长期可行性测试对于培养肉生产至关重要，确保细胞系在时间上保持稳定、有效和安全。到2025年，超过140家公司将投资超过27亿英镑，可靠的测试方法对于商业成功至关重要。本文探讨了五种关键方法：
- 活力测定: 通过膜完整性、代谢活动和能量生产评估细胞健康。
- 代谢活动监测: 测量线粒体功能和ATP生产，以跟踪实时能量动态。
- 压力测试协议: 模拟生产条件，如氧化应激、营养缺乏和pH变化。
- 染色体稳定性测试: 通过测序和核型分析检测染色体异常，确保遗传一致性。
- 功能性能测定: 确认细胞执行基本任务，如分裂、蛋白质生产和持续代谢。
每种方法都提供了关于细胞健康和性能的独特见解，使它们成为培养肉类开发中不可或缺的工具。下面，我们详细介绍这些方法的工作原理、用途及其解决的挑战。
不同方法测量细胞活力的比较
1. 活力测定
活力测定用于通过检查膜完整性、代谢活动和能量生产来评估细胞健康。它们对于初步筛选和细胞活力的持续监测都是必不可少的。
测量类型（定量与定性）
定量测定 提供数值数据，允许进行统计分析和比较。例如，ATP发光检测，如使用CellTiterGlo-3D进行的检测，利用生物发光技术测量能量水平 [1]. 同样，荧光DNA检测，如PicoGreen, 定量总DNA含量[1]. MTT检测使用微孔板读数器在570nm处测量吸光度，信号强度与活细胞数量直接相关 [5].
定性方法侧重于细胞健康的视觉确认。例如， 台盼蓝由于健康细胞膜完整而被排除在外 [5]. 同样，像碘化丙啶和7-AAD这样的染料被活细胞排除，但会渗透到膜受损的细胞中 [7]. 这些方法通常使用流式细胞术或免疫荧光显微镜进行分析。
时间分辨率（实时与周期性）
大多数活力测定是在周期性或终点基础上. 进行的。技术如BrdU掺入或Ki-67染色需要细胞固定，在特定时间点捕获数据[8]. 使用不可固定染料如碘化丙啶时，时间至关重要，因为在染色过程中，随着细胞继续死亡，染色细胞的数量可能增加[8].
“使用这些染料时，时间至关重要，因为随着细胞继续死亡，染色细胞的比例在染色过程中增加。” - Anna Quinlan, Bio-Radiations[8]
其他方法，如CFSE, 通过共价标记细胞内蛋白质，允许长期跟踪，这些蛋白质在细胞分裂过程中传递[8]. 发光ATP检测和Resazurin基础测试则提供快速结果，无需长时间孵育[8].
主要使用场景（筛选与验证）
筛选应用非常适合高通量格式。像Resazurin、XTT , 和ATP检测等方法设计用于微孔板读数器，使研究人员能够同时测试多种条件[8]. XTT的额外优势是产生水溶性染料，消除了MTT所需的溶解步骤。Resazurin由于其稳定性和相对于四唑盐的无毒性而特别有利 [8].
验证目的通常需要正交测试，其中使用两种不同的方法来确认结果。这在3D支架环境中特别重要，在这些环境中，试剂扩散可能较慢，或者检测组件可能与材料相互作用 [1]. 例如，将ATP检测（评估代谢活性）与DNA检测（测量总生物质量）结合起来，可以提供互补的见解，提高细胞系特征化的可靠性[1].
2. 代谢活性监测
代谢活性监测侧重于评估不同培养条件下的线粒体功能和ATP生产[7]. 这种方法提供了关于细胞健康的宝贵见解，特别是在延长培养期间。通过提供细胞能量动态的实时数据，它补充了传统的活力测试。
测量类型（定量与定性)
定量方法 是代谢监测的基石，提供适合统计分析的精确数值数据。ATP发光和光谱分析方法，如XTT和Resazurin，以其准确性而广泛使用 [7][9]. 这些方法在基于支架的培养肉系统中特别有效，因为恢复测试可以帮助识别任何潜在的检测干扰 [9].
时间分辨率（实时与周期性）
传统的XTT和MTT检测依赖于周期性采样，而实时监测系统使用非裂解试剂连续跟踪同一细胞群体长达72小时。这种实时方法对于更精确地检测毒性发生至关重要 [2]. 周期性方法则受到其孵育时间的限制，这可能会掩盖在此期间发生的生存能力下降 [2].
“所有四唑或瑞萨祖红还原测定法的一个缺点是，它们依赖于有色或荧光产物随时间的积累。由于信号随时间逐渐增加，因此在长时间孵育期间细胞活力的下降无法检测到。” - Promega [2]
主要用例（筛选与验证）
基于ATP的发光测定法高度敏感，非常适合多孔板格式的高通量筛选 [2]. 其简单的“添加-混合-测量”程序允许同时测试多种条件。然而，在3D支架系统中的验证需要更详细的方法，因为这些环境中的材料可能会减缓试剂扩散或干扰检测[9]. 进行多次独立测试可确保有关细胞健康的准确结果[7], 为进一步的压力测试协议铺平道路。
3. 压力测试协议
压力测试协议旨在评估细胞如何响应模拟生产条件的压力因素。这些压力因素可以包括氧化应激（通过活性氧测量）、化学毒性、营养缺乏以及环境条件的变化，如pH值、温度和CO₂水平[2][3][4]. 在3D培养系统中，尤其是用于培养肉类生产的系统中，机械应力和支架内扩散限制等额外挑战变得至关重要。这些因素会影响细胞的健康和检测的可靠性。通过补充活力和代谢数据，压力测试提供了关于细胞系如何应对生产相关挑战的见解。 测量类型（定量与定性） 现代压力测试严重依赖于定量技术，如吸光度、荧光或发光，以确定IC50值。ATP发光检测因其相较于旧的四唑盐基方法的灵敏度而脱颖而出。例如，基于瑞萨祖林的试剂如alamarBlue HS显著降低背景荧光（超过50%），并将信号与背景比率提高一倍，与标准版本相比 [4]. 在支架中处理细胞时，使用互补方法验证结果至关重要 - 例如比较ATP发光与DNA荧光 - 以确保支架材料不干扰检测性能 [9].
时间分辨率（实时与周期性）
已经从终点测量转向实时动力学监测。这种方法允许在长达72小时的时间内连续跟踪应激反应 [2]. 它消除了对额外板的需求，节省了时间和细胞资源。
主要用例（筛选与。验证)
对于高通量筛选，压力测试通常采用快速的“添加-混合-测量”协议。这些方法效率高，减少了处理数千个样本时的变异性和劳动量 [2]. 另一方面，验证协议需要更严格的方法。它们结合了多种标记，如代谢活动和膜完整性，以确认细胞死亡背后的机制 [10]. 此外，将功能数据与生存率进行标准化，确保特定治疗效果不会被误认为是一般毒性 [4].
“实验化合物可能不会诱导细胞死亡，而是改变细胞代谢或细胞增殖，这可能被错误地解释为生存率降低。” - 细胞信号技术 [10]
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4.染色体稳定性和遗传特征化
染色体稳定性测试对于确保细胞系在长期培养过程中保持其遗传完整性至关重要。在培养肉生产的背景下，这一过程在保持一致性和安全性方面起着关键作用。随着时间的推移，细胞系经历了多次传代，即使是小的染色体变化 - 如非整倍体（异常染色体数目） - 也会显著改变细胞行为、基因表达和基因组编辑的结果[11]. 通过关注染色体稳定性，生产者可以确保细胞系在长期使用中保持可靠和安全。
测量类型（定量与定性）
染色体稳定性测试通常结合定量和定性方法。例如：
- 短读长的下一代测序（NGS） 定量分析读取深度和等位基因频率，从而能够检测大规模拷贝数变异 [11] .
- 流式细胞术 提供DNA含量的定量测量，识别全基因组变化，如三倍体化或多倍体 [11][6].
- 核型分析 和 荧光原位杂交（FISH） 提供特定染色体异常的定性、视觉确认 [11] .
- 长读长测序 提供更详细的结构变异定量视图，但需要更多资源 [11].
这种方法的结合确保了对染色体稳定性的全面理解，平衡了精确性和实用性。
时间分辨率（实时与周期性）
染色体稳定性测试是定期进行的, ，因为它们需要细胞固定或DNA/RNA提取等过程，这些过程阻止了实时监测[11] [6]. 。测试的频率取决于细胞系的历史和预期用途。
例如，2024年发表在BMC Genomics上的一项研究使用Illumina测序法检查了PK15猪细胞系。研究人员比较了一个大学实验室样本（56X覆盖）和一个ATCC样本（29X覆盖）。经过十多年传代的样本显示出显著更高的结构和克隆变异，而较近期传代的样本则没有。这突显了染色体不稳定性如何随着时间的推移而积累，特别是在永生化细胞系中[11]. 因此，定期监测对于识别和解决此类变化至关重要。
主要用例（筛选与验证）
染色体稳定性方法分为筛选和验证工具：
- 筛选工具如短读测序和流式细胞术用于常规监测。
- 验证工具如FISH和核型分析确认特定异常[11].
筛选在基因组编辑前尤为重要。例如，在二倍体位点具有20%同源定向修复效率的基因组编辑测定在三体位点的效率可能仅为0.8%[11].
"我们建议在开始任何类型的靶向基因组编辑检测之前，先调查细胞系的基因组倍性" - BMC Genomics [11]
5. 功能性能检测
功能性能检测旨在确定细胞是否按预期运作。这在培养肉生产中尤为重要，因为细胞可能看起来是活的——膜完整等——但无法分裂、产生蛋白质或维持大规模生产所需的代谢活动水平 [6]. 这些检测专注于生物活性，如ATP生产、代谢率和DNA合成，以确保细胞系保持其功能能力 [1]. 与基本的生存能力测试不同，这些方法确认细胞正在执行持续生产所需的所有基本任务。
“活细胞通常是预期作用机制所必需的，其中活细胞再生组织或分泌因子以诱导再生。” - NIST [1]
测量类型（定量与定性）
功能测定通过测量实际细胞性能来建立在生存能力和代谢测试的基础上。这些测定中的大多数产生定量数据. 例如，ATP发光测定提供了对代谢活动的精确数值见解[1]. 同样，DNA定量测定作为补充测量[1]. 代谢测定如MTT和XTT依赖于线粒体酶还原比色底物，450 nm的吸光度读数表示相对存活细胞的数量[6]. 另一方面，定性方法，如使用核染料观察染色质凝聚，提供细胞活动的视觉确认[6].
时间分辨率（实时与周期性）
许多功能性能测定依赖于终点测量，这些测量是在细胞固定或裂解后进行的[6]. 然而，尖端的非侵入性技术，包括光声成像、荧光寿命成像和光学相干断层扫描，允许实时监测而不损害样品[1]. 这些方法在3D组织结构中特别有用，这在培养肉生产中很常见，因为定期取样有可能破坏支架或影响培养。因此，这些技术支持快速筛选和更详细的验证过程。
主要用例（筛选与验证）
对于筛选目的，高通量代谢测定如MTT和XTT非常有效。然而，验证需要额外的测试方法来解决如支架干扰等挑战[6]. ATP发光和DNA测定的组合已被证明在测量支架中的细胞活力方面有效，克服了如支架材料导致的试剂扩散减慢等问题。这项工作促成了ASTM标准测试方法WK62115的发展，该方法提供了评估制造组织中细胞活力的指南[1].
比较表
培养肉生产的5种长期活力测试方法比较
下表概述了用于长期活力测试的五种方法的主要特征，突出其测量类型、时间分辨率和典型应用。
| 方法 | 测量类型 | 时间分辨率 | 主要用例 |
|---|---|---|---|
| 活力测定 | 膜完整性（染料排除/摄取） | 终点 | 常规培养检查；小规模台式工作 |
| 代谢活动监测 | 酶活性/ATP水平 | 终点或实时（动态长达72小时） | 培养基优化；高通量筛选 |
| 压力测试协议 | 细胞毒性标志物（LDH释放，caspase激活） | 实时/动态 | 确定生长因子或抑制剂的IC50 |
| 染色体稳定性和遗传特征化 | DNA合成，细胞周期进程 | 终点 | 长期细胞系稳定性的质量控制 |
| 功能性能测定 | 生物活性（增殖标志物，特定功能） | 变量（高于成像） | 验证细胞分化和性能 |
此比较突出了每种方法的独特优势和局限性，特别是在测量类型和时间方面。时间分辨率在跟踪长期变化中起着关键作用，非裂解检测允许连续监测长达72小时[2].
在3D培养模型中 - 通常用于培养肉生产 - 传统的比色法检测在试剂渗透方面常常面临挑战。需要为3D系统设计的专用试剂，具有更强的去污剂，以确保检测性能的有效性。追踪释放到培养基中的标记物的方法，例如在压力测试中的LDH，对于到达微组织的核心特别有用[2]. 将活力检测与细胞毒性测试结合起来，可以更清楚地区分细胞静止（抑制生长）和细胞毒性（杀死细胞）的效果[2][6]. 这一简明概述有助于指导方法选择，以满足各种测试需求。
结论
为了确保细胞系活力测试的准确性和可靠性，采用多方面的方法是必不可少的。在培养肉生产中进行长期活力测试需要使用多种检测方法，因为每种方法评估不同的细胞标记。仅依赖一个参数可能会导致误导性结果——细胞可能看起来是活的，但可能在代谢上不活跃甚至衰老 [2].
正如Promega公司（Promega Corporation）的Johanna Lee和Mariel Mohns所解释的：
“选择适合您需求的细胞健康检测方法需要了解每种检测方法测量的标记是什么，测量如何与细胞活力相关，以及有哪些限制。" [2]
这在处理3D支架时尤为重要，此时结合正交方法变得至关重要 [2]. 在单个孔中进行多重检测不仅提高了统计可靠性，还帮助节省了宝贵的细胞类型 [2]. 通过使用这种方法，研究人员可以区分“活的”、“死的”和“垂死或受损”的细胞，确保实验结果的更全面验证 [3]. 此外，实验化合物有时会改变细胞代谢或增殖而不导致细胞死亡。将活力检测与毒性测试结合有助于避免对这种代谢变化的误解 [6].
对于培养肉行业的公司，开发稳健的测试协议也依赖于获得专业设备。工具如多模式微孔板读数器和自动细胞计数器增强了检测的灵活性并减少了错误。平台如简化了这一过程，通过将研发团队和生产经理与经过验证的供应商连接起来。这些供应商提供先进的工具，包括具有温度和CO₂控制的微孔板读数器，用于实时监测和专为3D培养系统设计的试剂。采用这些集成方法加强了培养肉生产中可扩展和可靠的细胞系性能的基础。 常见问题 在传代过程中，长期活力测试应多久进行一次？ 在细胞传代过程中进行长期活力测试的频率因所使用的协议和特定的细胞系而异。活力测定通常在与培养条件一致的间隔进行——这可能意味着在每次传代之前或在预定时间点进行测试。对于培养肉细胞系，定期进行活力测试对于确保细胞在长时间培养期间保持健康和功能至关重要。
哪些测定对于试剂扩散受限的3D支架最有效？
在试剂扩散受限的3D支架中工作时，酸性磷酸酶测定（APH）被证明是一个可靠的选择。该测定在直径达650 µm甚至900 µm的球体中表现良好，无需解离。
此外，专为3D结构设计的细胞活力测定与这些条件高度兼容。这些检测方法足够灵敏，可以解决3D支架中固有的扩散挑战，使其特别适合评估长期细胞活力。这使它们成为培养肉研究中的一个优秀工具，在该领域中，维持细胞健康至关重要。 确认细胞系安全和稳定的最小正交测试集是什么？ 为了确认细胞系的安全性和稳定性，需要进行一些基本测试。这些包括遗传稳定性评估，如核型分析、SNP阵列或下一代测序。这些方法有助于识别可能危及细胞系的突变或染色体异常。 此外，污染测试和细胞认证也起着至关重要的作用。这些测试确保细胞系的身份和纯度，降低交叉污染或误识别的风险。当这些程序结合在一起时，可以保护用于培养肉生产的细胞系的遗传完整性和整体安全性。
