หากฉันเอาเซรั่มออกแต่ยังคงใช้สายพันธุ์เซลล์ชนิดเดียวกัน ฉันไม่ควรคาดหวังว่าการปรับแต่งสื่อเพียงอย่างเดียวจะหยุดการแก่ชรา การล่องลอย หรือการสูญเสียการยึดเกาะได้ ในบทความนี้ ฉันแสดงให้เห็นว่าความสำเร็จในการเพาะเลี้ยงเนื้อสัตว์โดยไม่ใช้เซรั่มมักขึ้นอยู่กับ ทั้งสอง ด้านของระบบ: สื่อที่กำหนดไว้นอกเซลล์ และการแก้ไขภายในเซลล์ที่ช่วยให้มันแบ่งตัวต่อไป ยึดติด และรักษาหน้าที่ของกล้ามเนื้อ
สำหรับวิศวกรกระบวนการชีวภาพและทีมเพาะเลี้ยงเซลล์ ประเด็นหลักนั้นง่าย:
- สื่อที่ปราศจากเซรั่มเปลี่ยนพฤติกรรมของเซลล์, ไม่ใช่แค่รายการส่วนผสม การดูดซึมกลูโคส กลูตามีน ไกลซีน และซิสตีนสามารถเปลี่ยนแปลงได้ภายใต้สภาวะที่ปราศจากเซรั่ม
- เซลล์ดาวเทียมหลักถึงขีดจำกัดของสายเซลล์ได้เร็ว เซลล์หมูชนิดป่ามักสูญเสียลักษณะของกล้ามเนื้อภายในประมาณ การผ่านครั้งที่ 10.
- CDKN2A knockout เป็นหนึ่งในตัวอย่างที่ชัดเจนที่สุด ในบทความ: เซลล์ดาวเทียมสุกรที่ถูกแก้ไขขยายออกไป 15+ passages, รักษา >ความมีชีวิต 90%, และในบางโคลนแสดง การเพิ่มขึ้น ~194 เท่า PAX7 ที่ passage 20 มากกว่าการควบคุมแบบไวลด์ไทป์.
- มีการแลกเปลี่ยน. การขยายตัวที่ดีกว่าไม่ได้รับประกันการแยกแยะในช่วงท้าย; บางบรรทัดที่ถูกแก้ไขยังคงแสดงการแยกแยะที่ต่ำกว่าโดย passage 30.
- การตรวจสอบต้องเกิดขึ้นในชุดการผลิต: สื่อที่ปราศจากเซรุ่มเดียวกัน, โหมดการเพาะเลี้ยงเดียวกัน, และการอ่านค่าเดียวกันสำหรับการเจริญเติบโต, การสะสมของเสีย, ตัวบ่งชี้สายพันธุ์, และการหลอมรวม.
เวอร์ชันสั้น: หากคุณต้องการกระบวนการที่ปราศจากเซรั่มที่สามารถถ่ายโอนไปสู่การผลิตได้ ฉันจะแนะนำให้พิจารณา การออกแบบสื่อ, การแก้ไขยีน, การคัดกรองโคลน, และการปรับให้เข้ากับเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ เป็นกระบวนการที่เชื่อมโยงกัน ไม่ใช่งานแยกสี่งาน
| พื้นที่ที่มุ่งเน้น | สิ่งที่ฉันจะตรวจสอบก่อน | ทำไมมันถึงสำคัญ |
|---|---|---|
| การควบคุมวงจรเซลล์ | CDKN2A, อายุการใช้งานของ passage, PAX7 | ช่วยแสดงว่าเส้นสามารถขยายได้โดยไม่เกิดความชราเร็ว |
| การส่งสัญญาณการเจริญเติบโต | การตอบสนองของ IGF1R, EGFR, FGFR | ระบบที่ปราศจากเซรั่มมีการสนับสนุนการส่งสัญญาณภายนอกที่ต่ำกว่า |
| การอยู่รอดจากความเครียด | ความมีชีวิต, ตัวบ่งชี้การตายของเซลล์, การตอบสนองต่อแรงเฉือน | การถอนเซรั่มและการผ่านสามารถผลักดันเซลล์ให้สูญเสีย |
| การจัดการสารอาหาร | การใช้กลูโคส, แลคเตท, แอมโมเนีย, การดูดซึมกรดอะมิโน | การดูดซึมที่เร็วขึ้นอาจหมายถึงการสะสมของเสียที่เร็วขึ้นด้วย |
| การคงตัวตน | PAX7, MYOD, MYOG, ดัชนีการหลอมรวม | สายการผลิตที่เติบโตอย่างรวดเร็วไม่มีประโยชน์หากไม่สามารถสร้างเนื้อเยื่อเป้าหมายได้อีกต่อไป |
จากนั้นฉันจะอธิบายถึงจุดที่การเพาะเลี้ยงที่ปราศจากเซรั่มล้มเหลว การแก้ไขใดที่เชื่อมโยงกับจุดล้มเหลวนั้น และวิธีที่ฉันจะตรวจสอบความถูกต้องของสายการผลิตที่แก้ไขก่อนการถ่ายโอนกระบวนการ
การแก้ไขจีโนม CRISPR-Cas ในสายเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม | ตัวอย่างโปรโตคอล
อุปสรรคทางชีวภาพหลักในการเพาะเลี้ยงแบบปราศจากเซรั่ม
การนำเซรั่มออกเผยให้เห็นสามคอขวด: การส่งสัญญาณ, การยึดเกาะ, และเอกลักษณ์ของเซลล์ ปัญหาเริ่มต้น ภายในเซลล์, ไม่ใช่แค่ในสูตรสื่อ นั่นสำคัญเพราะมันกำหนดว่าทีมจะใช้เวลาไปกับอะไร: การปรับแต่งสื่อ, การแก้ไขยีน, หรือผสมผสานทั้งสองอย่าง
| คุณสมบัติ | การเพาะเลี้ยงที่มีเซรั่มเสริม | การเพาะเลี้ยงที่ไม่มีเซรั่ม |
|---|---|---|
| การเพิ่มจำนวนเซลล์ | แข็งแรง; สนับสนุนโดยปัจจัยการเจริญเติบโตที่หลากหลาย | แปรปรวน; มีแนวโน้มที่จะเกิดการชราภาพของการจำลองแบบและการหยุดที่ G1/S |
| การยึดเกาะ | สนับสนุนโดยโปรตีน ECM ที่มีในเซรั่ม (ไฟโบรเนคติน, ไวโทรเนคติน) | ต้องการการเคลือบหรือสารเติมแต่งจากภายนอก; ความเสี่ยงในการหลุดออกเพิ่มขึ้น |
| การขนส่งสารอาหาร | อำนวยความสะดวกโดยโปรตีนพาหะ เช่น อัลบูมินและทรานสเฟอร์ริน | ขึ้นอยู่กับการดูดซึมที่มีการบัฟเฟอร์น้อยกว่า; ต้องการความเข้มข้นของ ITS-X และไขมันที่เหมาะสม |
| ความเสี่ยงของการตายของเซลล์ | ต่ำ; เส้นทาง PI3K-AKT และ MAPK-ERK ถูกกระตุ้นอย่างแรง | ความไวต่อความเครียดจากการออกซิเดชันและของเสียจากการเผาผลาญเพิ่มขึ้น |
| ความเสถียรของอัตลักษณ์ | โดยทั่วไปมีความเสถียรในช่วงต้นถึงกลางของการผ่าน | มีความเสี่ยงสูงต่อการเปลี่ยนแปลงลักษณะทางฟีโนไทป์; ตัวบ่งชี้ความเป็นสเต็มมักลดลงอย่างรวดเร็ว |
การสูญเสียสัญญาณการเจริญเติบโตและการอยู่รอด
เมื่อเซรั่มถูกนำออก ระดับของปัจจัยการเจริญเติบโตจะลดลงอย่างรวดเร็วจากนั้นเซลล์จะสูญเสียการสนับสนุนภายนอกที่ช่วยให้กิจกรรม PI3K-AKT และ MAPK-ERK สูงขึ้น ในทางปฏิบัติ นั่นหมายถึงการเกิด apoptosis มากขึ้นและการเพิ่มจำนวนที่อ่อนแอลง ซึ่งเป็นปัญหาโดยตรงสำหรับการขยายขนาด
การยึดเกาะ การดูดซึมสารอาหาร และคอขวดความเครียด
เซรั่มทำมากกว่าการเลี้ยงเซลล์ มันยังให้โปรตีน ECM ที่สนับสนุนการยึดเกาะและการกระจายตัวอีกด้วย หากไม่มีไฟโบรเนคติน, ไวโทรเนคติน และปัจจัยที่เกี่ยวข้อง เซลล์ดาวเทียมหลักมีแนวโน้มที่จะหลุดออกและเข้าสู่ apoptosis มากขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งภายใต้แรงเฉือนในสภาวะเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ การยับยั้ง ROCK ด้วย Y-27632 สามารถช่วยได้ในระดับหนึ่ง แต่ไม่สามารถแก้ปัญหาการยึดเกาะได้
การจัดการสารอาหารก็ยากขึ้นเช่นกัน หากไม่มีโปรตีนพาหะในเซรั่ม การดูดซึมกลูโคส กลูตามีน ไกลซีน และซิสตีนจะมีการบัฟเฟอร์น้อยลง [1]. ในขณะเดียวกัน ของเสียจากการเผาผลาญ เช่น แอมโมเนียและแลคเตทสามารถสะสมและยับยั้งการเจริญเติบโต [3]. ดังนั้น แม้ว่าสื่อพื้นฐานจะดูดีบนกระดาษ การขนส่งและสมดุลของเสียยังคงเป็นขั้นตอนที่จำกัดได้
การเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ระหว่างการปรับตัวแบบปลอดเซรั่ม
การปรับตัวแบบปลอดเซรั่มสามารถเลือกกลุ่มย่อยที่ทนต่อสภาพใหม่ได้ แต่ไม่ตรงตามข้อกำหนดของผลิตภัณฑ์ นั่นคือกับดัก: เซลล์อาจขยายตัวได้ดี แต่สูญเสียความสามารถในการสร้างเนื้อเยื่อที่ตั้งใจไว้
ในระหว่างการผ่านต่อเนื่อง เครื่องหมายเช่น PAX7, MYOD, และ MYOG สามารถลดลงได้ [2]. ติดตามเครื่องหมายลำดับวงศ์ระหว่างการปรับตัวเพื่อให้การเปลี่ยนแปลงแสดงออกมาเร็วกว่าในภายหลังหลังจากรอบการปรับสื่อที่ยาวนาน นี่คือเส้นทางที่การแก้ไขยีนจำเป็นต้องทำให้เสถียร
วิธีการแก้ไขยีนที่ปรับปรุงประสิทธิภาพแบบปลอดเซรั่ม
เป้าหมายการแก้ไขยีนสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบปลอดเซรั่ม: ประโยชน์เทียบกับข้อแลกเปลี่ยน
อุปสรรคเหล่านี้แบ่งออกเป็นสามประเภทการแก้ไข: การส่งสัญญาณ, การอยู่รอด, และการแยกแยะ
การแก้ไขการส่งสัญญาณของปัจจัยการเจริญเติบโตและการใช้สารอาหาร
เส้นทางตรงหนึ่งคือการเพิ่มระดับหรือทำให้ IGF1R, EGFR, และ FGFR ไวต่อการตอบสนองต่อ IGF-1, EGF, และ bFGF [2]. ซึ่งมีความสำคัญในสื่อปลอดเซรั่มที่ระดับของปัจจัยการเจริญเติบโตมักจะต่ำตามการออกแบบ หากการส่งสัญญาณดีขึ้น การควบคุมวงจรเซลล์มักจะกลายเป็นคอขวดถัดไป
ตัวควบคุมวงจรเซลล์ CDKN2A โดดเด่นในที่นี้ CRISPR/Cas9 knockout ของ exon 2 สร้าง CDKN2A −/− เซลล์ดาวเทียมสุกรที่ขยายตัวอย่างแข็งแกร่งมากกว่า 15 passages ในสื่อที่ปราศจากเซรั่ม 19 ส่วนประกอบ ในโคลนเฉพาะ PAX7 การแสดงออกเพิ่มขึ้นประมาณ 194 เท่าใน passage 20 เมื่อเทียบกับการควบคุมแบบไวด์ไทป์ [2].
การแก้ไขตัวพาโซลูต (SLC) สามารถช่วยหลีกเลี่ยงข้อจำกัดการดูดซึมในระหว่างการขยายขนาดสำหรับกลูโคส กลูตามีน ไกลซีน และซิสทีน [1]. แต่มีข้อแม้ การดูดซึมที่สูงขึ้นยังทำให้เกิดการสะสมของแลคเตทและแอมโมเนียเร็วขึ้น ดังนั้นการแก้ไขตัวพาจำเป็นต้องวางแผนควบคู่กับการแลกเปลี่ยนสื่อและการควบคุมของเสียตั้งแต่วันแรก การแก้ไขการดูดซึมเพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอ
การปรับปรุงการอยู่รอดของเซลล์และความต้านทานต่อความเครียดที่ปราศจากเซรั่ม
การถอนเซรั่ม การผ่านเซลล์ตามปกติ และแรงเฉือนในไบโอรีแอคเตอร์ทั้งหมดผลักดันเซลล์เข้าสู่สภาวะที่มีการตายของเซลล์สูงขึ้น การแก้ไขเส้นทาง BCL2 - ไม่ว่าจะโดยการเพิ่มการแสดงออกของสมาชิกที่ส่งเสริมการอยู่รอดหรือการยับยั้งสมาชิกที่ส่งเสริมการตายของเซลล์ - สามารถลดการสูญเสียเซลล์ในระหว่างการเปลี่ยนแปลงเหล่านั้นได้ สิ่งนี้มีความสำคัญมากขึ้นในระบบไมโครแคร์ริเออร์ ซึ่งเซลล์ต้องรับมือกับทั้งความเครียดจากการยึดเกาะและความเครียดทางกลไก
การแก้ไขใด ๆ ที่ช่วยปรับปรุงการอยู่รอดหรือขยายการเพิ่มจำนวนจำเป็นต้องมีการตรวจสอบความเสถียรของจีโนมตลอดช่วงการผลิตทั้งหมด CDKN2A −/− เซลล์ดาวเทียมของสุกรยังคงอัตราการมีชีวิตของเซลล์สูงกว่า 90% ในระหว่างการเพิ่มจำนวนอย่างต่อเนื่องโดยปราศจากเซรั่ม [2]. ถึงกระนั้น ทีมงานควรตรวจสอบความสมบูรณ์ของโครโมโซมในช่วงการผ่านที่กำหนด แทนที่จะสมมติว่าความเสถียรจะคงอยู่
การปรับสมดุลระหว่างการยึดเกาะ การเพิ่มจำนวน และความสามารถในการแยกแยะ
ส่วนที่ยากที่สุดคือการจัดการความขัดแย้งระหว่างการขยายตัวและการแยกแยะ CDKN2A knockout รักษาศักยภาพการสร้างกล้ามเนื้อผ่าน passage 10 ในขณะที่เซลล์ชนิด wild-type ในสภาวะไม่มีเซรั่มแสดงคุณสมบัติการสร้างกล้ามเนื้อที่เกือบจะสูญเสียไปอย่างสมบูรณ์ ดัชนีการหลอมรวมอยู่ที่ 16.3% ถึง 56.3% ในสายที่ถูกแก้ไข [2]. อย่างไรก็ตาม ภายใน passage 30 แม้แต่เซลล์ที่ถูกแก้ไขก็สามารถแสดงความสามารถในการแยกแยะที่ลดลงได้ [2].
| เป้าหมายการแก้ไข | ประโยชน์หลักในวัฒนธรรมที่ปราศจากเซรั่ม | การแลกเปลี่ยนที่สำคัญ |
|---|---|---|
| CDKN2A (p16/p14) | หลีกเลี่ยงการชราภาพ; ขยายตัวอย่างเสถียรสำหรับ 15+ passages [2] | ความสามารถในการแยกแยะอาจลดลงที่ passages สูงมาก (P30+) [2] |
| IGF1R / EGFR / FGFR | การตอบสนอง mitogenic ที่แข็งแกร่งขึ้นต่อปัจจัยการเจริญเติบโตที่กำหนด [2] | ความเสี่ยงจากการกระตุ้นมากเกินไปทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงลักษณะ |
| ตัวขนส่ง SLC | การดูดซึมกลูโคส ไกลซีน และซิสทีนที่ดีขึ้น [1] | ภาระเมตาบอลิกที่สูงขึ้น; การสะสมของแลคเตทและแอมโมเนียที่เพิ่มขึ้น [1] |
| BCL2 / การตอบสนองต่อความเครียด | การลดการตายของเซลล์แบบ apoptosis ระหว่างการถอนและความเครียดจากการเฉือน [2] | ต้องการการตรวจสอบเสถียรภาพของจีโนมและการประเมินความปลอดภัยของอาหาร [2] |
| Integrins / ยีน ECM | ปรับปรุงการยึดเกาะในระบบไมโครแคเรียร์และโครงสร้าง [2] | การแสดงออกมากเกินไปสามารถยับยั้งการหลุดของเซลล์ระหว่างการผ่าน [2] |
การแก้ไขการยึดเกาะมีประโยชน์มากที่สุดในการตั้งค่าไมโครแคเรียร์หรือโครงสร้าง.พวกเขาควรถูกมองว่าเป็นเครื่องมือเฉพาะรูปแบบ ไม่ใช่การแก้ไขสำหรับทุกกระบวนการที่ปราศจากเซรั่ม
ระบบ CRISPR ที่สามารถเหนี่ยวนำได้ให้ทีมมีวิธีการที่เป็นประโยชน์ในการจัดการกับการขยายตัวเทียบกับการแยกแยะ ความคิดนี้ง่าย: ใช้การแก้ไขที่สามารถเหนี่ยวนำได้เพื่อแยกเฟสการขยายตัวออกจากการแยกแยะ
การแก้ไขเหล่านี้ไม่มีความหมายหากฟีโนไทป์ไม่คงอยู่ในสื่อที่ปราศจากเซรั่มที่ตั้งใจไว้
sbb-itb-ffee270
การสร้างและการตรวจสอบสายเซลล์ที่แก้ไขสำหรับการเพาะเลี้ยงที่ปราศจากเซรั่ม
การค้นหาการแก้ไขที่ถูกต้องเป็นเพียงส่วนหนึ่งของงาน ส่วนที่ยากกว่าคือการเปลี่ยนการแก้ไขนั้นให้เป็นสายเซลล์ที่เสถียรที่สามารถจัดการกับการผลิตที่ปราศจากเซรั่มได้ นั่นต้องใช้กระบวนการทำงานที่แน่นหนาเชื่อมโยงการแก้ไข การเลือกโคลน และการตรวจสอบในสายงานเดียว และสายงานนั้นควรทดสอบข้อจำกัดของการส่งสัญญาณ การอยู่รอด และการยึดเกาะที่ได้ระบุไว้โดยตรง
การเลือกเครื่องมือแก้ไขและวิธีการส่งมอบ
สำหรับเป้าหมายเช่น CDKN2A, CRISPR/Cas9 knockout เป็นขั้นตอนแรกที่เหมาะสมเมื่อมีเป้าหมายในการลบตัวกดวงจรเซลล์และสนับสนุนการขยายตัวในระยะยาว [2]. ในเซลล์ปศุสัตว์หลัก เส้นทางการส่งมอบทั่วไปประกอบด้วยระบบทรานส์เฟคชั่นที่ไม่ใช่ไวรัสเช่น Lipofectamine และระบบไวรัสเช่น lentiCRISPR v2 [2][4] . ก่อนที่จะย้ายไปทำงานแบบโคลน ให้ยืนยันประสิทธิภาพการส่งมอบ
มีจุดหนึ่งที่สำคัญมากกว่าที่บางครั้งได้รับการยอมรับ: ตรวจสอบแต่ละโคลนในสื่อและโหมดการเพาะเลี้ยงที่วางแผนไว้สำหรับการผลิต. หากกระบวนการผลิตใช้สื่อที่ปราศจากเซรั่มที่กำหนดไว้ วัฒนธรรมที่ยึดติดแบบสถิต ไมโครแคเรียร์ หรือการตั้งค่าอื่น ๆ นั่นคือสภาพที่เซลล์ควรเผชิญในระหว่างการตรวจสอบ
การคัดกรองเซลล์ที่แก้ไขแล้วภายใต้สูตรปลอดเซรั่มสำหรับการผลิต
วิธีทั่วไปคือการแยกโคลนโดยการเจือจางจำกัดและยืนยันการแก้ไขโดยการจัดลำดับ Sanger ที่ตำแหน่งเป้าหมาย [2]. เมื่อการแก้ไขได้รับการยืนยันแล้ว การคัดกรองควรดำเนินต่อไปในสูตรปลอดเซรั่มและโหมดการเพาะเลี้ยงที่ตั้งใจไว้สำหรับการผลิต [2][1].
ในขั้นตอนนี้ วัดพื้นฐานที่บอกคุณได้ว่าคลอนสามารถอยู่ร่วมกับกระบวนการได้หรือไม่ แทนที่จะเพียงแค่รอดจากการแก้ไข:
- การเจริญเติบโต
- ความมีชีวิต
- การบริโภคกลูโคส
- การผลิตแลคเตท
- การสะสมแอมโมเนีย
นอกจากนี้ยังมีเหตุผลที่จะเพิ่ม PAX7 RT-qPCR ในช่วงต้น เพราะการสูญเสียความเป็นสเต็มสามารถแสดงออกมาก่อนที่สายพันธุ์จะล้มเหลวในวิธีที่ชัดเจนกว่า [1][2].
การจำแนกเซลล์ที่แก้ไขก่อนการถ่ายโอนกระบวนการ
ก่อนการถ่ายโอนกระบวนการ การตรวจสอบควรครอบคลุมสี่ด้านที่เชื่อมโยงกัน: การแก้ไขจีโนม, การตอบสนองของเส้นทาง, ความเสถียรของการผ่าน และการทำงาน แต่ละด้านตอบคำถามที่แตกต่างกัน การตรวจสอบจีโนมจัดการกับความเสี่ยงของการล่องลอยของฟีโนไทป์ การวิเคราะห์สื่อที่ใช้แล้วชี้ไปที่การดูดซึมสารอาหารและขีดจำกัดการสะสมของของเสีย Fusion index บอกคุณว่าการแยกแยะกล้ามเนื้อยังคงมีอยู่หรือไม่ [2][1].
| ประเภทการทดสอบ | สิ่งที่วัดได้ | เหตุผลที่สำคัญสำหรับสายการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงโดยไม่มีเซรั่ม |
|---|---|---|
| T7 Endonuclease I / Sanger Sequencing | ประสิทธิภาพการแก้ไขและลำดับจีโนมที่แม่นยำ | ยืนยันการลบหรือเพิ่มยีนที่สำเร็จก่อนการขยายขนาด [2] |
| RT-qPCR (PAX7, MYOD, MYOG, BAX, CCND1) | ระดับการถอดรหัสของตัวบ่งชี้ความเป็นสเต็มเซลล์ การแยกตัว และการตายของเซลล์ | ติดตามสุขภาพของเซลล์และศักยภาพในการแยกตัวในระยะยาว [2][4] |
| Immunofluorescence (MyHC / CK18) | การแสดงออกของโปรตีนเฉพาะสายพันธุ์ | มั่นใจได้ว่าเซลล์ยังคงมีลักษณะของกล้ามเนื้อหรือเยื่อบุผิวหลังจากการแก้ไขและการปรับตัว [2][4] |
| การวิเคราะห์สื่อที่ใช้แล้ว | โปรไฟล์ของกลูโคส, กรดอะมิโน, แลคเตท และแอมโมเนีย | กำหนดความต้องการสารอาหารและให้ข้อมูลกลยุทธ์การป้อนอาหารของไบโอรีแอคเตอร์ [1] |
| ดัชนีการหลอมรวม | เปอร์เซ็นต์ของนิวเคลียสที่รวมเข้ากับไมโอทูบหลายเซลล์ | ยืนยันว่าความสามารถในการแยกแยะกล้ามเนื้อยังคงอยู่โดยไม่มีเซรั่ม [2] |
| การวิเคราะห์โปรไฟล์เนื้อสัมผัส (TPA) | ความแข็ง, ความยืดหยุ่น และความเหนียวของโครงสร้าง 3 มิติ | ยืนยันว่าเซลล์ที่แก้ไขแล้วผลิตผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่มีคุณสมบัติทางกายภาพคล้ายเนื้อสัตว์ [2] |
การตรวจสอบความถูกต้องทางจีโนม อาศัยการทดสอบ T7 Endonuclease I พร้อมกับการจัดลำดับ Sanger ของโคลนแต่ละตัว [2]. การยืนยันเส้นทาง ใช้ RT-qPCR หรือ Western blot เพื่อแสดงว่าการเปลี่ยนแปลงของทรานสคริปต์หรือโปรตีนที่วางแผนไว้ได้เกิดขึ้นจริง รวมถึงตัวบ่งชี้เช่น PAX7, MYOD, MYOG และ MyHC [2][4].
สำหรับ ความเสถียรในระยะยาว, มาตรฐานคือ 15-30 passages พร้อมการตรวจสอบซ้ำในเรื่องการเจริญเติบโต ความมีชีวิต และการแสดงออกของตัวบ่งชี้ CDKN2A knockout porcine satellite cells รักษาอัตราการมีชีวิตของเซลล์ไว้เหนือ 90% ตลอด 15 passages ในสภาวะที่ไม่มีเซรั่ม แต่ความสามารถในการแยกแยะเริ่มลดลงเมื่อถึง passage 30 [2].
การทดสอบการทำงาน จากนั้นถามคำถามที่ชัดเจนที่สุด: นี่ยังคงเป็นเซลล์ที่คุณต้องการหรือไม่? ในสาย myogenic, fusion index แสดงว่าเซลล์ที่ถูกแก้ไขยังสามารถสร้าง myotubes หลายนิวเคลียสได้โดยไม่มีเซรั่มหรือไม่ [2]. การวิเคราะห์โปรไฟล์เนื้อสัมผัส (TPA) จะตรวจสอบว่าโครงสร้าง 3 มิติแสดงความแข็ง ความยืดหยุ่น และความเหนียวคล้ายเนื้อสัตว์หรือไม่ [2].
ใช้ข้อมูลเหล่านั้นเพื่อตั้งค่าการถ่ายโอนของโคลนสำหรับการผลิตที่ปราศจากเซรั่ม
จากสายเซลล์ที่แก้ไขแล้วสู่การผลิตที่ปราศจากเซรั่ม
การจับคู่เซลล์ที่แก้ไขแล้วกับการออกแบบสื่อและไบโอรีแอคเตอร์
เมื่อโคลนผ่านการตรวจสอบแล้ว งานจะเปลี่ยนไป ในจุดนั้น ความสำเร็จขึ้นอยู่กับว่าเซลล์ไลน์เหมาะสมกับกระบวนการเพียงใด การคัดกรองเพิ่มเติมจะไม่สามารถแก้ไขการจับคู่กระบวนการที่ไม่ดีได้
การวิเคราะห์สื่อที่ใช้แล้วควรกำหนดการเติมกลูโคส การเสริมกรดอะมิโน และการให้โดสของปัจจัยการเจริญเติบโต รวมถึงอินพุตที่กำหนดเช่น bFGF และ IGF-1 [2]. ในระบบที่ยึดติด ความหนาแน่นของการหว่านโครงสร้างและช่วงเวลาการยึดติด - ประมาณ 2 ชั่วโมงก่อนการย้ายไปยังเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ - ควรกำหนดจากพฤติกรรมการยึดติดของสายที่แก้ไขแล้ว ไม่ใช่จากโปรโตคอลที่มีเซรั่ม [2]. ข้อมูลเหล่านั้นควรนำไปใช้ในการตัดสินใจเกี่ยวกับเวลาการให้อาหาร ความหนาแน่นของการหว่าน และเวลาการย้ายโดยตรง
สายที่แก้ไขแล้วสามารถรองรับการขยายตัวที่ยาวนานขึ้น ความหนาแน่นของเซลล์ที่สูงขึ้น และการแสดงออกของเครื่องหมายที่เสถียรขึ้น ซึ่งหมายความว่าการขยายขนาดต้องปฏิบัติตามพฤติกรรมที่วัดได้ของสายที่แก้ไขแล้ว ไม่ใช่สมมติฐานของชนิดป่า
ในทางปฏิบัติ การเลือกสายกลายเป็นการตัดสินใจในการจัดหาและขยายขนาด ไม่ใช่แค่การตัดสินใจทางชีววิทยา
ข้อคิดสำคัญสำหรับทีม R&D, การผลิต, และการจัดหา
การปรับตัวให้ปราศจากเซรั่มไม่ใช่แค่ปัญหาการจัดสูตรสื่อ มันเริ่มต้นจากสายเซลล์ และการปรับสื่อให้เหมาะสมเพียงอย่างเดียวจะไม่แก้ปัญหา การแก้ไขยีนเป้าหมาย โดยเฉพาะการลบยีนที่ยับยั้งวงจรเซลล์ เช่น CDKN2A, จัดการกับชีววิทยาพื้นฐานที่ทำให้เซลล์ดาวเทียมหลักล้มเหลวในสภาวะที่ไม่มีเซรั่ม เซลล์ดาวเทียมหมู CDKN2A−/− รักษาการแสดงออกของ PAX7 สูงกว่ากลุ่มควบคุมชนิดป่าประมาณ 194 เท่าใน passage 20 และมีดัชนีการหลอมรวมสูงถึง 56.3% ใน passage 10 - ซึ่งเป็นระยะที่เซลล์ที่ไม่ได้แก้ไขส่วนใหญ่สูญเสียหน้าที่การสร้างกล้ามเนื้อ [2].
สำหรับทีมที่พัฒนาและการผลิต การแบ่งแยกค่อนข้างชัดเจน:
- ทีม R&D ควรสร้างกระบวนการตรวจสอบความถูกต้องที่ทดสอบโคลนที่แก้ไขภายใต้สภาวะการผลิตจริงตั้งแต่เริ่มต้น ซึ่งรวมถึงการเจริญเติบโต การบริโภคสารอาหาร ความเสถียรของสายพันธุ์ และความสามารถในการแยกแยะในรูปแบบ 3 มิติ
- ทีมการผลิต ควรใช้โปรไฟล์สารอาหารของสายพันธุ์ที่แก้ไขแล้วในการตั้งค่าการออกแบบอาหารและพารามิเตอร์ของไบโอรีแอคเตอร์ เนื่องจากสมมติฐานที่คัดลอกจากโปรโตคอลที่มีเซรั่มมีแนวโน้มที่จะไม่ถูกต้อง [1].
- ทีมจัดซื้อจัดจ้าง จำเป็นต้องมีแผนการจัดหาที่ตรงกับความต้องการเฉพาะของสายพันธุ์ที่แก้ไขแล้ว รวมถึงปัจจัยการเจริญเติบโตที่กำหนดไว้ ลิพิด สารต้านอนุมูลอิสระ และโครงสร้างหรือไมโครแคเรียร์ที่เหมาะสมกับโปรไฟล์การยึดเกาะของสายพันธุ์นั้นๆ
คำถามที่พบบ่อย
ทำไมการปรับสื่อเพียงอย่างเดียวจึงไม่เพียงพอ?
การปรับสื่อเพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอ ในหลายกรณี เซลล์สัตว์ไม่มีลักษณะที่จำเป็นสำหรับการผลิตขนาดใหญ่ เช่น ความต้านทานต่อแรงเฉือน , ประสิทธิภาพการเผาผลาญ, และ ความมีชีวิตในสารแขวนลอยความหนาแน่นสูง.
สื่อที่ปราศจากเซรั่มมีความสำคัญ แต่พวกมันไม่สามารถแก้ไขข้อจำกัดที่มีอยู่ในตัวเซลล์ได้ ข้อจำกัดเหล่านี้รวมถึง อายุการแพร่กระจายที่จำกัด, ความไวต่อความเครียดของเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ, และ ความต้องการทางโภชนาการที่แตกต่างกันระหว่างสายพันธุ์และระยะการพัฒนา.
การแก้ไขยีนใดที่สำคัญที่สุดในวัฒนธรรมที่ปราศจากเซรั่ม?
ในการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง การแก้ไขที่สำคัญที่สุดคือการลดการพึ่งพาปัจจัยการเจริญเติบโตที่เพิ่มเข้าไป ตัวอย่างหนึ่งคือการลบ CDKN2A ซึ่งสามารถปรับปรุงการแพร่กระจายและการแยกแยะของเซลล์ดาวเทียมสุกรภายใต้สภาวะที่ปราศจากเซรั่ม
อีกวิธีหนึ่งคือการออกแบบเซลล์ต้นกำเนิดกล้ามเนื้อเพื่อการแสดงออกเกินของ FGF2 และ RasG12V ที่กลายพันธุ์. การตั้งค่านั้นสนับสนุนการส่งสัญญาณออโตครินและขจัดความจำเป็นในการใช้ FGF2 ที่สร้างขึ้นใหม่ในตัวกลาง
ควรตรวจสอบสายเซลล์ที่แก้ไขแล้วสำหรับการผลิตอย่างไร?
สายเซลล์ที่แก้ไขแล้วควรผ่านการทดสอบทางจีโนม โปรตีโอมิกส์ และการทำงาน เพื่อยืนยันประสิทธิภาพการผลิตและศักยภาพในการแยกแยะ
ในทางปฏิบัติ หมายถึงการตรวจสอบว่าแก้ไขได้ทำตามที่ตั้งใจไว้ โดยไม่ สร้างปัญหาที่อื่น นักวิจัยควรตรวจสอบว่าการดัดแปลงทางพันธุกรรมไม่ทำให้การแยกแยะไปยังเนื้อเยื่อเป้าหมายเสียหาย และลักษณะที่ตั้งใจไว้ เช่น ความทนทานต่อความเครียดหรือการเจริญเติบโตที่ไม่ต้องพึ่งพาเซรั่ม แสดงออกตามที่คาดหวัง
