Nếu bạn so sánh các giá trị kLa mà không khớp phương pháp, môi trường, nhiệt độ và phản ứng của đầu dò, bạn có thể đưa ra quyết định mở rộng quy mô sai.
Đối với kỹ sư quy trình sinh học, nhà khoa học nuôi cấy tế bào và các nhóm R&D thịt nuôi cấy, câu trả lời ngắn gọn là đơn giản: phương pháp khử khí tĩnh là tốt nhất để đánh giá tàu, trong khi các phương pháp cân bằng oxy động và khí thải hữu ích hơn khi bạn muốn dữ liệu đối diện quy trình dưới điều kiện nước dùng sống. Các số liệu kLa dựa trên nước có thể gây hiểu lầm, độ trễ của đầu dò có thể làm sai lệch tốc độ truyền nhanh, và các chất phụ gia môi trường như Pluronic F-68 có thể giảm kLa xuống 50% hoặc hơn trong một số thiết lập.
Đây là bài viết trong một lần đọc:
- kLa không phải là mục tiêu độc lập. Tôi sẽ sử dụng nó cùng với P/V, giới hạn cắt, lưu lượng khí và thời gian trộn.
- Khử khí tĩnh cung cấp một so sánh phần cứng sạch, nhưng nó bỏ qua CHÚNG TÔI và không phản ánh văn hóa hoạt động.
- Các phương pháp động theo dõi sự chuyển oxy trong quá trình nuôi cấy và gần gũi hơn với những gì bạn thực hiện ở quy mô lớn, mặc dù việc tạm dừng thông khí có thể gây căng thẳng cho tế bào.
- Các phương pháp cân bằng oxy sử dụng dữ liệu khí vào và ra và phù hợp với các bình lớn hơn, nhưng chúng cần phân tích khí chặt chẽ.
- Oxy hóa sulfite và các phương pháp bước áp suất chủ yếu dành cho việc đặc trưng hóa thiết bị, không dành cho nước dùng thịt nuôi sống.
- Thời gian phản hồi của đầu dò quan trọng: các đầu dò DO quang học thường phản hồi trong 3-10 s , trong khi các đầu dò polarographic thường là 8-30 s.
- Nhiệt độ và môi trường quan trọng: một kLa đo trong nước ở 20°C không ánh xạ chính xác đến môi trường nuôi cấy ở 37°C .
- Phạm vi được báo cáo điển hình trong bài viết là 50-200 h⁻¹ tại 2-10 L và 80-300 h⁻¹ tại 50-500 L, nhưng chỉ khi cơ sở thử nghiệm đầy đủ phù hợp.
H.E.L Giải thích | Đạt được Truyền Oxy Đồng nhất: Tác động của kLa đối với Quy mô Lên men
sbb-itb-ffee270
So sánh Nhanh
Phương pháp Đo lường kLa cho Quy mô Lên men: So sánh Song song
| Phương pháp | Tốt nhất cho | Nhược điểm chính | Phù hợp với quy trình |
|---|---|---|---|
| Phương pháp thoát khí tĩnh | So sánh bình chứa và bộ phân phối khí | Không có nhu cầu oxy của tế bào sống | Thấp đến trung bình |
| Phương pháp động | Công việc quy mô lên men văn hóa hoạt động | Dừng thông khí có thể làm xáo trộn tế bào | Cao |
| Cân bằng oxy | Giám sát quy mô lớn hơn | Cần dữ liệu khí thải chặt chẽ | Cao |
| Oxy hóa sulfite | Kiểm tra phần cứng chuyển tối đa | Không giống như phương tiện xử lý | Thấp |
| Bước áp suất | Đặc điểm hóa bình lớn | Cần thiết lập chịu áp suất | Trung bình |
Nếu tôi đang thiết lập một kế hoạch mở rộng quy mô, đặc biệt khi chuyển sang hệ thống quy mô thí điểm, tôi sẽ coi việc lựa chọn phương pháp là một phần của kiểm tra chất lượng dữ liệu, không phải là một suy nghĩ sau.
2. Các phương pháp đo kLa chính được sử dụng trong nghiên cứu bioreactor
Tài liệu thường nhóm các phương pháp đo kLa thành ba nhóm chính: khử khí tĩnh, phương pháp động và cân bằng oxy, và kỹ thuật hóa học hoặc dựa trên áp suất. Mỗi phương pháp xem xét việc chuyển oxy từ một góc độ hơi khác nhau. Điều đó quan trọng, vì bản thân phương pháp có thể định hình cách đọc dữ liệu mở rộng quy mô.
2.1 Khử khí tĩnh
Khử khí tĩnh bắt đầu bằng cách khử oxy trong chất lỏng, thường là bằng nitơ. Sau đó, quá trình sục khí được bật lại và sự phục hồi oxy hòa tan (DO) được theo dõi theo thời gian. kLa được tính từ tốc độ tăng DO đó.
Vì không cần tế bào sống hoặc hóa chất nguy hiểm, phương pháp này là một cách đơn giản để đánh giá một bioreactor. Tuy nhiên, nhược điểm là nó không phản ánh hô hấp tế bào hoặc cách các thuộc tính của môi trường nuôi cấy thay đổi trong quá trình phát triển.Kết quả cũng phụ thuộc vào môi trường, thiết kế cánh khuấy, thiết kế sparger, lưu lượng khí, nhiệt độ và việc sử dụng chất chống tạo bọt. Ví dụ, trong một bể khuấy 400 L, việc thêm Pluronic F-68 ở mức 0.02 g/L có thể giảm kLa ít nhất 50% so với tham chiếu không có phụ gia [2].
Một vấn đề thực tế là động lực của đầu dò. Nếu phản ứng của cảm biến quá chậm, kLa đo được sẽ bị lệch và cần được điều chỉnh [1].
2.2 Phương pháp động và cân bằng oxy dưới điều kiện quy trình
Nếu mục tiêu là sự liên quan đến quy trình hơn là tiêu chuẩn nước sạch, các phương pháp động thường cho bạn biết nhiều hơn. Trong phiên bản phổ biến nhất, quá trình sục khí được dừng lại trong thời gian ngắn để hô hấp tế bào kéo DO xuống. Sau đó, quá trình sục khí được khôi phục và sự phục hồi thoáng qua được phân tích. Điều đó làm cho phép đo gần hơn với những gì môi trường đang làm trong một lần chạy thực tế.
Phương pháp cân bằng oxy đi theo một hướng khác.Thay vì làm gián đoạn quá trình sục khí, nó ước tính kLa từ OTR trừ OUR, thường với phân tích khí thải như khối phổ [2]. Đây là phương pháp không xâm lấn và đặc biệt hữu ích trong các bình chứa lớn hơn. Nhưng có một cái giá: bạn cần phần mềm điều khiển quy trình sinh học và phần cứng phân tích khí thải và dữ liệu OUR đáng tin cậy.
Đối với công việc thịt nuôi cấy, các phương pháp này hữu ích vì chúng phản ánh sự chuyển giao oxy dưới cùng điều kiện môi trường và tế bào được thấy trong quá trình mở rộng quy mô. Sự đánh đổi là khá rõ ràng. Trong phương pháp động, DO giảm trong thời gian tạm dừng sục khí, và điều đó có thể gây căng thẳng cho văn hóa nếu sự gián đoạn kéo dài quá lâu.
Các phương pháp hóa học và bước áp suất được sử dụng nhiều hơn cho việc đặc trưng hóa thiết bị hơn là cho việc đọc quy trình trực tiếp.
2.3 Phương pháp oxy hóa sulfite và bước áp suất
Đối với việc đánh giá không sinh học, hai phương pháp khác thường xuất hiện.Chúng tốt cho việc đặc trưng hóa phần cứng, nhưng chúng không trực tiếp đại diện cho nước dùng thịt nuôi cấy sống.
Quá trình oxy hóa sulfite sử dụng natri sulfite, bị oxy hóa trong sự hiện diện của chất xúc tác, để tiêu thụ oxy hòa tan với tốc độ từ đó có thể tính toán kLa. Vấn đề đơn giản: chất lỏng không đại diện cho môi trường sinh học, vì vậy kết quả không chuyển trực tiếp sang nước dùng thịt nuôi cấy [2].
Phương pháp bước áp suất thay đổi áp suất bình chứa theo cách từng bước để thay đổi nồng độ bão hòa oxy (C*) theo định luật Henry. Điều đó tạo ra lực truyền khối mà không thay đổi tốc độ khuấy hoặc tốc độ dòng khí [2]. Nó tiện lợi khi áp suất dễ kiểm soát hơn so với khuấy hoặc thông khí. Tuy nhiên, nó cần các bình chịu áp suất và thay đổi áp suất được kiểm soát chặt chẽ, điều này hạn chế việc sử dụng hàng ngày. Dù vậy, nó vẫn là một phương pháp nghiên cứu hữu ích cho việc đặc trưng hóa thiết bị.
3. Điểm mạnh, giới hạn và khả năng so sánh giữa các phương pháp
Giá trị kLa được công bố chỉ có thể so sánh khi thiết lập thử nghiệm và các giả định cơ bản là giống nhau. Ngay cả nhiệt độ cũng có thể làm thay đổi kết quả một cách đáng kể. Và nếu một bài báo điều chỉnh thời gian phản hồi của đầu dò oxy hòa tan trong khi bài khác không, thì những giá trị đó không nên được coi là tương đương, ngay cả khi phần còn lại của thiết lập trông giống nhau.
Khoảng cách đó quan trọng nhất khi bạn đang quyết định con số đó là gì cho. Đó có phải là một tiêu chuẩn phần cứng không? Hay đó là một chỉ số hướng tới quy trình phản ánh những gì xảy ra trong nuôi cấy?
3.1 Nơi phương pháp xả khí tĩnh vẫn là phương pháp tham chiếu
Xả khí tĩnh vẫn là phương pháp phổ biến để so sánh phần cứng. Nếu mục tiêu là so sánh thiết kế sparger, hình học cánh khuấy, hoặc cấu hình bình chứa dưới các điều kiện kiểm soát, thì nó thực hiện công việc tốt.Nó đơn giản, có thể tái tạo và không cần tế bào sống.
Nhược điểm cũng rõ ràng: kLa đo trong nước là một dự đoán kém về sự chuyển oxy trong môi trường thịt nuôi cấy. Một giá trị từ nước khử ion cho bạn biết điều gì đó hữu ích về bản thân bình chứa, nhưng ít hơn nhiều về hiệu suất khi một môi trường thực sự được sử dụng.
Đó là nơi mà các phương pháp động bắt đầu quan trọng hơn. Khi công việc chuyển từ đặc điểm hóa bình chứa sang nuôi cấy sống, sự liên quan của quy trình bắt đầu vượt trội hơn so với kiểm soát hệ thống sạch.
3.2 Nơi mà các phương pháp động và hồ sơ oxy hòa tan thêm sự liên quan của quy trình
Các phương pháp động gần với điều kiện quy trình thực tế hơn vì chúng đo sự chuyển oxy trong quá trình nuôi cấy hoạt động. Điều đó có nghĩa là chúng nắm bắt cả nhu cầu oxy và các tính chất thực tế của môi trường. Đối với công việc mở rộng quy mô, điều đó làm cho kết quả hữu ích hơn nhiều so với ước tính nước sạch.
Phương pháp cân bằng oxy bổ sung một đầu ra liên tục, không xâm lấn dưới điều kiện hoạt động, mặc dù nó phụ thuộc vào phân tích khí thải chính xác và hoạt động ổn định [2].
Sự khác biệt dễ thấy hơn khi các phương pháp được đặt cạnh nhau.
3.3 Bảng so sánh: phương pháp phù hợp cho quy mô thịt nuôi cấy
| Phương pháp | Nguyên tắc | Dữ liệu cần thiết | Giả định chính | Điểm mạnh | Hạn chế | Sử dụng tốt nhất |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Phương pháp thoát khí tĩnh | Sự tăng DO sau khi loại bỏ N₂ trong chất lỏng không có tế bào | Quá trình thời gian DO, thời gian phản hồi của đầu dò | Chất lỏng được trộn đều; không có OUR | Đơn giản; có thể tái tạo; không cần tế bào | Bỏ qua OUR; nhạy cảm với thành phần môi trường và độ trễ của đầu dò | Đặc điểm ban đầu của bình; so sánh phần cứng |
| Phương pháp động | Phục hồi DO trong quá trình nuôi cấy hoạt động sau khi dừng thông khí ngắn hạn | Quá trình thời gian DO, ước tính OUR | Nuôi cấy trạng thái gần như ổn định; áp dụng hiệu chỉnh cảm biến | Phản ánh điều kiện thực tế của nước dùng và tế bào | Tạm dừng sục khí có thể gây căng thẳng cho nuôi cấy; nhạy cảm với độ trễ của cảm biến | Tối ưu hóa quy trình và mở rộng quy mô trong quá trình tăng trưởng tích cực |
| Cân bằng oxy (phân tích pha khí) | Cân bằng khối lượng O₂ giữa khí vào và khí ra | Tốc độ dòng khí và nồng độ O₂ chính xác | Hoạt động ổn định | Không xâm lấn; liên tục; không làm xáo trộn nuôi cấy | Yêu cầu phân tích khí thải rất chính xác | Giám sát sản xuất quy mô lớn |
| Oxy hóa sulfite | Oxy hóa hóa học của natri sulfite tiêu thụ O₂ | Tốc độ tiêu thụ sulfite | Tốc độ phản ứng bị giới hạn bởi chuyển khối | Hữu ích cho khả năng OTR tối đa | Không đại diện cho môi trường sinh học; có thể đánh giá quá cao kLa | Chỉ đánh giá thiết bị; không dành cho công việc nuôi cấy sống |
| Phương pháp áp suất động (DPM) | Thay đổi bước áp suất để thay đổi độ hòa tan oxy | Thời gian áp suất và DO | Áp suất cân bằng nhanh hơn thành phần khí | Tránh độ trễ pha khí; phù hợp với các bình lớn | Yêu cầu bình chịu áp suất và kiểm soát áp suất chính xác | Đặc trưng quy mô lớn |
Những lựa chọn phương pháp này ảnh hưởng đến cách dữ liệu kLa nên được chuyển thành mục tiêu mở rộng quy mô và lựa chọn thiết bị.
4. Sử dụng dữ liệu kLa trong việc mở rộng quy mô và lựa chọn thiết bị
4.1 Đặt mục tiêu mở rộng quy mô từ phòng thí nghiệm đến quy mô thí điểm
Một khi bạn đã đo được kLa, công việc tiếp theo là chuyển con số đó thành giới hạn hoạt động cho khuấy trộn, lưu lượng khí và trộn. kLa nên được coi là một ràng buộc, không phải là toàn bộ quyết định. Nó cần đủ cao để đáp ứng nhu cầu oxy, nhưng không quá cao để quá trình trôi vào chế độ cắt mà tế bào của bạn không chịu được.
Sự cân bằng đó rất quan trọng trong thịt nuôi cấy. Giữ kLa không đổi ở quy mô lớn hơn có thể đẩy bạn đến tốc độ đầu cánh khuấy cao hơn và, với điều đó, cắt cao hơn [4]. Trong nuôi cấy tế bào động vật có vú, tốc độ đầu cánh khuấy 0.1-0.5 m/s thường được sử dụng để cân bằng chuyển oxy với ứng suất cắt [5]. Vì vậy, trong thực tế, kLa nằm trong một cửa sổ hoạt động rộng hơn bao gồm cả đầu vào công suất trên mỗi đơn vị thể tích (P/V), vận tốc khí bề mặt và thời gian trộn [4][5] .
Một tiêu chuẩn hữu ích giúp ích ở đây. Trong một 2-10 L lò phản ứng khuấy quy mô phòng thí nghiệm, kLa thường nằm trong khoảng 50-200 h⁻¹. Trong một 50-500 L bình thí điểm, phạm vi điển hình là 80-300 h⁻¹ [4] . Bước quan trọng là tìm ra sự chồng chéo mà tất cả các bình có thể đạt được. Đó là điều biến mục tiêu mở rộng quy mô từ một ý tưởng tốt trên giấy thành một thứ bạn có thể thực hiện.
4.2 Lựa chọn cảm biến và phần cứng cho công việc kLa đáng tin cậy
Dữ liệu mở rộng quy mô tốt bắt đầu với các thiết bị và phần cứng khí không làm lệch kết quả.
Thời gian phản hồi của cảm biến có ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của kLa.Trong các hệ thống kLa cao, sử dụng đầu dò DO phản ứng nhanh. Các đầu dò phân cực chậm cần điều chỉnh và có thể đọc thấp hơn kLa. Đầu dò phân cực thường có thời gian phản ứng từ 8-30 giây, trong khi đầu dò dựa trên huỳnh quang quang học phản ứng trong 3-10 giây [4]. Một quy tắc tốt là thời gian phản ứng của cảm biến nên ít hơn một phần mười hằng số thời gian chuyển khối (1/kLa) [1]. Nếu bạn không thể đáp ứng điều kiện đó, đầu dò quang học thường là lựa chọn an toàn hơn.
Việc cung cấp khí cũng quan trọng không kém. Bộ điều khiển lưu lượng khối nhiệt giúp giữ cho dòng khí ổn định, làm cho các phép đo lặp lại dễ dàng hơn. Lựa chọn bộ phân tán cũng có ảnh hưởng trực tiếp đến kLa mà bạn có thể đạt được [2][3]. Các bọt khí nhỏ hơn cung cấp diện tích bề mặt khí-lỏng lớn hơn, nhưng có một vấn đề: các chất phụ gia trong môi trường có thể làm giảm mạnh kLa [2].
5. Những điểm chính cần lưu ý khi diễn giải các phép đo kLa
Kết hợp lại, phương pháp bạn chọn nên phù hợp với câu hỏi mở rộng quy mô mà bạn đang cố gắng trả lời. Trong thực tế, điều đó có nghĩa là cần rõ ràng về việc bạn cần đặc tính phần cứng hay dữ liệu mở rộng quy mô hướng tới quy trình.
Một giá trị kLa đo được trong nước ở 20°C không thể được chuyển thẳng sang môi trường nuôi cấy ở 37°C. Chỉ riêng việc điều chỉnh nhiệt độ đã tạo ra sự khác biệt khoảng 45% [4]. Và kLa không phải là thứ bạn có thể dự đoán chỉ bằng lý thuyết. Mỗi bioreactor cần có kLa đo riêng [1].
Điều này càng quan trọng hơn khi bạn chuyển từ quy mô phòng thí nghiệm sang quy mô thí điểm . Khử khí tĩnh trong một dung dịch đệm phù hợp với muối như PBS cung cấp cho bạn một tiêu chuẩn thiết bị sạch. Nhưng khi quy mô tăng lên, đo lường động trong môi trường nuôi cấy thực tế cho bạn biết nhiều hơn về những gì quá trình sẽ thực hiện trong thực tế, vì các chất phụ gia trong môi trường có thể làm thay đổi kLa một cách đáng kể [4]. Nếu bạn dựa vào các giá trị dựa trên nước, bạn có thể kết thúc việc chỉ định quá mức khả năng truyền oxy ở quy mô lớn.
Kiểm tra cuối cùng là liệu kLa có nằm trong cửa sổ hoạt động đầy đủ hay không. Xem kLa như một ràng buộc của quá trình, không phải là một mục tiêu riêng lẻ. Sử dụng nó cùng với P/V và giới hạn cắt khi chọn hệ thống bioreactor tốt nhất và chiến lược khuấy [4] .
Câu hỏi thường gặp
Tôi nên sử dụng phương pháp kLa nào để mở rộng quy mô?
Phương pháp thoát khí động lực là cách được sử dụng rộng rãi nhất để xác định kLa trong các bioreactor khuấy, và đó là phương pháp mà hầu hết các nhóm khuyến nghị trong thực tế. Nó khá nhanh chóng và tránh được việc sử dụng hóa chất nguy hiểm hoặc sinh vật sống.
Đối với việc mở rộng quy mô thịt nuôi cấy, tốt nhất là đo không có tế bào để quá trình trao đổi chất của tế bào không làm sai lệch kết quả. Sử dụng đệm PBS ở 37 °C để phù hợp hơn với môi trường quy trình. Và nếu đầu dò oxy hòa tan có thời gian phản hồi chậm, hãy áp dụng một sự điều chỉnh. Nếu không, bạn có thể đánh giá thấp kLa.
Tại sao các giá trị kLa dựa trên nước thường gây hiểu lầm?
Các giá trị kLa dựa trên nước có thể gây hiểu lầm vì chúng không phản ánh hành vi lý hóa của môi trường nuôi cấy tế bào thực tế.Phương tiện thực không chỉ là nước pha trộn với chất dinh dưỡng. Nồng độ muối, độ nhớt, sức căng bề mặt và chất chống tạo bọt đều thay đổi sự chuyển khối oxy theo những cách mà thử nghiệm nước không thể hiện.
Khoảng cách đó quan trọng. Nếu bạn bỏ qua các hiệu ứng của phương tiện, ước tính cung cấp oxy của bạn có thể lệch xa so với những gì mà bioreactor thực hiện trong thực tế. Một ví dụ điển hình là chất chống tạo bọt: nó có thể tăng sự hợp nhất bong bóng, cắt giảm diện tích bề mặt và giảm kLa lên đến 50%. Trong sản xuất thịt nuôi cấy, đó không phải là một chi tiết nhỏ. Nó có thể thay đổi liệu một quy trình có đủ không gian chuyển oxy hay hoạt động gần với giới hạn của nó.
Làm thế nào độ trễ của đầu dò và các chất phụ gia trong môi trường ảnh hưởng đến kLa?
Độ trễ của đầu dò có thể làm sai lệch các phép đo kLa. Nếu cảm biến oxy hòa tan phản ứng quá chậm so với tốc độ chuyển oxy, kết quả có thể bị sai lệch và có thể cần chỉnh sửa phi tuyến tính.
Các chất phụ gia trong môi trường cũng có thể thay đổi sự chuyển oxy theo những cách quan trọng.Các chất điện giải và muối có thể ngăn chặn sự hợp nhất của bong bóng. Pluronic F68 có thể giảm kích thước bong bóng. Chất chống tạo bọt thường làm tăng sự hợp nhất của bong bóng, điều này làm giảm diện tích bề mặt hiệu quả và giảm kLa.
