冷冻保存 是将活细胞在超低温下冷冻和储存的过程，以保持其随时间的活力。这种方法对于培养肉的生产至关重要，确保一致、稳定的细胞系，并防止因污染或设备故障造成的损失。关键步骤包括：
- 准备：在细胞生长阶段收获细胞，检查活力（目标为≥90%），并在含有DMSO或甘油等冷冻保护剂的冷冻介质中准备它们。
- 冷冻：使用受控的降温速率（每分钟-1°C至-3°C）以防止冰晶损伤。将细胞储存在液氮蒸汽中（-135°C至-190°C）以进行长期保存。
- 解冻：在37°C水浴中快速解冻细胞，以尽量减少冷冻保护剂的毒性，然后将其转移到生长介质中进行恢复。
- 质量控制：准确标记小瓶，监测储存条件，并在解冻后测试活力以确保成功保存。
细胞系完整冷冻保存方案：从准备到储存的四步流程
准备细胞进行冷冻保存
细胞收获和活力检查
为了确保解冻后的最佳恢复效果，在细胞的对数（log）生长期进行收获。对于贴壁细胞系，通常是在达到80-90%汇合度时进行 [2][3][6]。
使用台盼蓝排除法检查细胞活力。将0.4%台盼蓝与细胞悬液按1:1比例混合，然后使用血细胞计数板计数细胞。活细胞会排除染料并在显微镜下显得明亮，而非活细胞会被染成蓝色[4]。理想情况下，目标是至少90%的活力以获得最佳的回收率，尽管某些方案可能接受最低75%[1][2][3][5]。
在收获之前，使用显微镜检查是否有细菌或真菌污染。健康的悬浮细胞在倒置相差显微镜下应显得明亮、圆形且具有折光性[2][3]。
一旦细胞达到所需的活力标准，继续进行预冷冻步骤。
冷冻前准备
对于贴壁细胞，使用温和的解离方法，如胰蛋白酶或TrypLE Express，并限制孵育时间以避免损伤细胞膜[5]。根据细胞系，将细胞制备成1 × 10⁶到1 × 10⁷个细胞/mL的浓度[1][6]。分装时，确保细胞悬液经常混合，以保持在冻存管中的均匀分布[5]。
在重悬过程中，将冷冻介质保持在2°C到8°C之间，以减少冷冻保护剂的毒性，然后开始冷冻过程[5]。一旦细胞悬浮在冷冻介质中，迅速进入冷冻协议[1]。始终在尽可能低的传代数下冷冻保存细胞，以减少遗传漂移或形态变化的风险[5][7]。
选择冷冻保护剂和冷冻介质
冷冻保护剂选项及其功能
二甲基亚砜 (DMSO) 广泛用作冷冻保护剂，通常浓度为 10% [2]。它通过穿透细胞膜并减少冷冻过程中的冰晶形成来发挥作用。然而，DMSO 在室温下对细胞有毒，因此快速解冻对于减少暴露和快速稀释至关重要[1]。
甘油 是对 DMSO 敏感的细胞系的有用替代品，通常使用浓度范围为 5% 至 15% [8]。它对于DMSO可能导致不必要分化的细胞类型特别有效，并且与DMSO相比，其毒性较低。 在培养肉应用中，传统的冷冻方案通常使用90%胎牛血清（FBS）和10%DMSO的混合物。然而，依赖于动物来源的成分在可扩展性和监管批准方面限制了这些方法。为了解决这些问题，化学定义的培养基 - 如Synth-a-Freeze或Recovery Cell Culture Medium - 提供了一种无动物成分的替代方案。这些培养基在保持高解冻后细胞活力的同时，克服了与动物来源成分相关的挑战。
冷冻介质的比较
以下是用于培养肉生产的各种冷冻介质的优缺点分析：
| 介质 | 优点 | 缺点 | 培养肉适用性 |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO in FBS-DMEM | 已建立的协议[1] | 含有动物来源成分；批次差异性[9] | 可扩展性有限 |
| Synth-a-Freeze | 化学成分明确；质量一致；不含动物成分[9] | 初始成本较高[9] | 是 |
| 恢复细胞培养基 | 易于使用；设计用于快速恢复[9] | 可能需要针对特定细胞系进行优化 | 是 |
| 10% 甘油在 FBS 中 | 适用于对 DMSO 敏感的细胞的替代品[1] | 依赖于动物来源的血清[9] | 扩展性有限 |
2023年2月，东京女子医科大学的研究人员在高桥宏信的带领下，展示了选择合适冷冻介质的重要性。 使用商业选项如CELLBANKER 1和2，他们成功地将初级牛肌源细胞在–80°C下冷冻保存长达一年。值得注意的是，这些细胞在解冻后仍然保留了增殖和分化为具有完整肌节结构的收缩肌肉组织的能力[10]。
对于培养肉生产，化学定义和GMP合规的培养基越来越受到青睐。正如STEMCELL Technologies所强调的：
在细胞和基因治疗等高度监管的领域，建议使用GMP生产的、完全定义的冷冻保存培养基，以确保产品按照质量标准一致地生产和控制[9]。
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冷冻保存程序和冷却速率
逐步冷冻协议
成功冷冻保存的关键在于保持每分钟-1°C到-3°C[2]的稳定冷却速率。这个渐进的过程允许水慢慢离开细胞，防止形成可能破坏细胞膜的有害细胞内冰晶 [1]。
首先以150 x g离心细胞5分钟[3]。离心后，将细胞沉淀重悬于含有10% DMSO的冷冻介质中，浓度为 2–4×10⁶ cells/mL[3]。为了减少DMSO的暴露，快速进入下一步 - 冷冻。
将细胞悬液分配到预先标记的冷冻小瓶中。每个小瓶应清楚标明细胞系名称、传代次数、批号、细胞浓度和冷冻日期等重要信息[3]。准备好小瓶后，是时候选择和使用合适的冷却设备了。
冷却设备和技术
立即将小瓶放入受控速率冷却装置中。被动冷冻容器，如Nalgene "Mr Frosty"（使用异丙醇）或Corning "CoolCell"，是流行的选择。这些工具在放置于-80°C冰箱中时可以实现大约1°C每分钟的冷却速率[2]。
对于需要高度一致性的更大规模操作，使用可编程速率控制冷冻机是最佳选择。正如Sigma-Aldrich所述：
在-80°C下约24小时 后，将小瓶转移到液氮的蒸汽相中，温度范围在-135°C到-190°C之间，以进行长期储存[4] 。避免将细胞在-80°C下储存超过一周，因为这可能会影响其活力。低于-135°C的温度对于无限期保存是必需的[2]。使用蒸汽相而不是液相可以降低交叉污染的风险，同时保持足够低的温度。
解冻和恢复协议
解冻过程
快速解冻细胞对于限制有毒的冷冻保护剂暴露和防止冰晶造成损害至关重要。确保佩戴全脸面罩和绝缘手套以确保安全。首先，从液氮中取出冷冻管，并稍微松开盖子以释放任何积聚的压力。然后，重新拧紧盖子。
将小瓶放入37°C的水浴中，确保盖子保持在水面以上。让其解冻1-2分钟，或直到只剩下少量冰晶。解冻后，用70%酒精擦拭小瓶的外部以保持无菌。
将小瓶的内容物转移到含有5-10 mL预热培养基的试管中。慢慢加入培养基以帮助减少渗透压冲击。如果您正在处理悬浮细胞系，请立即在4°C下以300 × g离心细胞悬液5分钟。此步骤有助于沉淀细胞并去除保护剂。离心后，将细胞重悬于新鲜培养基中。对于贴壁细胞，通常不需要离心。相反，直接将细胞接种到合适的培养容器中，并在第一次更换培养基时去除任何残留的DMSO，通常是在24小时后。
解冻后评估
解冻后立即检查细胞活力以确保恢复成功。使用台盼蓝排除法进行此评估。理想情况下，细胞活力应超过90% [11] ，但最低75%也是可以接受的。24小时后，在相差显微镜下检查细胞以确认贴壁情况，评估细胞密度，并检查是否有任何污染迹象。
继续监测细胞在1-3代传代期间的情况，以确保正常增殖并保持其预期特性。对于恢复较慢的细胞系，可以通过将初始胎牛血清浓度提高到约20% v/v 来改善存活率。
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储存和长期活力
储存条件和时长
为了长期保持细胞系的活力，必须将其储存在低于-135°C 的温度下[7][2]。这确保它们可以无限期保存。
储存培养肉细胞系的首选方法是蒸汽相液氮。此技术将温度保持在-135°C 到-190°C 之间，是长期保存的理想选择，同时相比液相储存提供了更高的安全性。
如果需要在-80°C 下储存细胞，请将时间限制在24小时到一周内。超过此时间，细胞活力可能会下降。在此温度下临时储存时，请尽快将细胞转移到液氮储存中。
使用标准无菌冷冻小瓶（1–2 mL），带有内螺纹和O形圈以确保安全储存[4][5]。始终将密封的冷冻小瓶放置在氮气的气相中，而不是液相中，以减少解冻时小瓶爆炸的风险[5]。此外，确保大容量液氮容器至少保持半满，以维持安全缓冲区。
最后，严格的质量控制措施对于确保细胞的长期活力至关重要。
质量控制检查
为了确保储存细胞系的可靠性，请遵循严格的质量控制协议。首先，用耐液氮的标签准确标记每个小瓶。包括细胞系身份、批号、传代次数和冷冻日期等基本信息。维护一个电子数据库以记录每个小瓶的确切位置，从而减少储存容器需要打开的时间[7][2].
在将整个批次投入长期储存之前，测试一个小瓶在短期气相储存后的活力。此步骤有助于确认冷冻过程是否成功，并识别任何潜在问题[4][7][2]。对于高价值的细胞库存，建议在次要地点存储副本，以防设备故障或局部灾害[7][2]。
为所有储存容器配备温度监控系统和警报，以检测低液氮水平[7]。此外，在储存区域安装氧气警报器，设置在18%氧气（v/v）时触发，以减少液氮操作人员的窒息风险[7][2]。
哺乳动物细胞系的冷冻保存视频协议
结论和关键要点
以下是有效冷冻保存培养肉生产中的基本步骤和建议的快速回顾：
- 细胞收获：在细胞的对数生长期收集细胞，确保细胞活力超过90%。使用10% DMSO作为冷冻保护剂，尽管甘油可以作为更精细细胞系的替代品[11][1]。
- 冷却和储存：保持受控的冷却速度，并迅速将小瓶转移到蒸汽相液氮储存中，以保护细胞完整性[11]。
Roka Kakehi 等人的研究强调了精确冷冻保存的重要性[10]：
“通过使用冷冻保存确保可靠且一致的细胞来源，将使我们能够增加用于培养肉生产的有前途细胞的稳定供应。” - Roka Kakehi 等人，东京女子医科大学
- 解冻过程：在37°C水浴中解冻细胞约两分钟，当80%的冰融化时停止。这可以减少DMSO的毒性并改善细胞恢复[1]。随后进行解冻后活力检查以确保成功，并微调未来的程序。
这些方法与严格的质量控制实践密切配合。始终准确标记小瓶，保持有序记录，并在长期存储前进行彻底检查[11]。对于专业的低温保存需求，像
常见问题解答
在培养肉生产中使用化学定义培养基进行细胞系低温保存有哪些优势？
在培养肉生产中，化学定义培养基在细胞系低温保存方面带来了多重好处。通过去除不确定成分，如动物来源的血清，它们确保一致和可预测的结果 - 这是保持细胞系长期可靠性的关键因素。
另一个关键优势是降低了污染和变异的风险。这不仅支持更高的质量和安全标准，还完美契合了培养肉行业中满足监管要求和消费者期望所需的精确性和可扩展性。
冷冻保护剂的选择如何影响细胞在冷冻和解冻过程中的存活率？
冷冻保护剂的选择是冷冻和解冻过程中保持细胞健康的关键因素。两种广泛使用的选择是二甲基亚砜 (DMSO)和甘油，每种都有其独特的特性。DMSO以其快速渗透细胞并提供强保护的能力而闻名。然而，它有一个警告：在高浓度或长时间暴露下，它可能变得有毒，可能降低细胞活力。
相比之下，甘油毒性较低，可以直接应用。其缺点在于其细胞渗透速度较慢，这可能导致与DMSO相比，保护效果不够及时。
实现正确的平衡至关重要。适当调整冷冻保护剂的浓度和暴露时间有助于保护细胞，同时将毒性风险降至最低。此外，遵循最佳的冷却速率和储存条件对于确保解冻后尽可能高的恢复率至关重要。
为什么在冷冻保存过程中控制冷却速率很重要？
保持稳定的冷却速率，通常在每分钟–1°C到–3°C之间，是保持细胞活力的关键。逐渐冷却使细胞能够以受控的速度脱水，减少有害冰晶形成的机会，这些冰晶可能撕裂或损坏细胞膜。
这种有节制的方法保护了细胞的结构，提高了细胞解冻后的存活率和功能性。遵循精确的冷却协议对于确保细胞系的长期储存和恢复至关重要。
