培养肉生产受到细胞生长缓慢和初级与永生化细胞系早期衰老的限制. CRISPR基因编辑提供了克服这些挑战的针对性解决方案。
以下是改善培养肉细胞增殖、分化和可扩展性的五大CRISPR目标及其作用：
- 肌肉生长抑制素 (MSTN)： 通过去除自然生长限制来促进肌肉细胞生长。
- P53 (TP53)： 延长细胞寿命并增加增殖率，但可能会降低分化。
- HIF1A： 帮助细胞在低氧环境中生存，这对于密集的生物反应器培养至关重要。
- 肌肉生成调控因子 (MYOD1, MYOG)： 促进肌肉细胞的形成和排列。
- CDKN2A： 绕过衰老，支持长期细胞增殖。
这些目标解决了复制性衰老、低产量和血清依赖等关键问题。然而，平衡增殖与分化并确保安全性对于成功至关重要。
快速比较：
| CRISPR 目标 | 主要优势 | 挑战 |
|---|---|---|
| 肌生成抑制素 (MSTN) | 促进肌肉生长 | 脱靶效应风险；可行性问题 |
| P53 (TP53) | 延长寿命，促进增殖 | 分化减少；安全性问题 |
| HIF1A | 支持低氧生存 | 需要精确编辑以避免干扰 |
| MYOD1, MYOG | 增强肌肉形成 | 平衡增殖和分化 |
| CDKN2A | 实现长期增殖 | 脱靶风险；需要无血清培养基 |
CRISPR技术正在重塑培育肉类的生产方式，旨在提高产量和降低生产成本，同时解决伦理问题。
培养肉的前5名CRISPR目标：益处和挑战比较
1. 肌肉抑制素基因 (MSTN)
通过敲除MSTN基因，可以去除肌肉生长的自然制动。这一过程通过增生和肥大促进肌肉细胞增殖和分化[5] [6].
主要益处
2025年3月，首尔国立大学的研究人员通过结合MSTN敲除牛细胞与数字光处理3D生物打印取得了重大进展。这种方法改善了肌肉的排列和分化，使培养肉具有类似于传统牛排的特性 [5] .
早在2022年5月，中国西北农林科技大学的科学家们使用优化的CRISPR/Cas9递送系统（100 ng/μL Cas9 mRNA和200 ng/μL sgRNAs）创造了纯合子MSTN敲除羊。在出生的16只羔羊中，有四只被确认是纯合子敲除。这些羔羊在30、60和90天时的体重显著高于未编辑的对照组，同时保持了肉质参数，如pH值、肌内脂肪和粗蛋白水平[6].
细胞类型适用性
编辑MSTN基因增强了各种细胞类型的肌源潜力，包括原代肌母细胞、卫星细胞、成纤维细胞（通过MYOD1驱动的转分化）和间充质干细胞。这是通过克服细胞增殖的自然限制来实现的[5] [1].
潜在挑战
尽管有其好处，MSTN敲除并非没有并发症。它与活体动物的生存问题以及诸如脱靶突变和嵌合体等技术障碍有关。例如，2022年6月的一项研究报告称，虽然MSTN编辑的猪表现出肌肉生长增加，但37只双等位基因敲除猪中没有一只存活[7] [8][6].
“MSTN敲除增强了MYOD1介导的牛排型培养肉的生产。”[5]
接下来，我们将探讨P53肿瘤抑制基因及其在确保持续细胞增殖中的重要性。
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2. P53肿瘤抑制基因
禁用TP53基因会移除关键的细胞周期检查点，从而显著加速细胞增殖。P53 在作为肿瘤抑制因子中起着核心作用，响应细胞压力启动细胞周期停滞和衰老。没有这个检查点，细胞可以更快地积累生物质并维持更长的培养周期 [1].
主要优势
在2025年初，Communications Biology 发表了一项研究，强调了TP53编辑对牛间充质干细胞的变革性影响。研究结果令人震惊：在30天内细胞数量增加了1000倍，培养寿命从100天延长到超过200天。编辑后的细胞显示出50%更快的细胞倍增率，到第80天，衰老水平显著下降——从未编辑细胞的约60%降至修改后细胞的仅10%。此外，这些细胞保留了“年轻”的基因表达特征，表现为增强的DNA复制和持续的蛋白质合成，类似于早期传代细胞[1].
细胞类型适用性
牛脂肪来源的间充质干细胞（AD‑bMSCs）特别适合于TP53修改。这些细胞自然会遇到复制性衰老，这限制了它们的扩展潜力。鉴于间充质干细胞约占培养肉生产中细胞来源的25%，TP53编辑提供了一个实用的解决方案，平衡了它们保持多能性的能力与工业规模化之间的关系[1].
潜在挑战
然而，这种方法并非没有挑战。其中一个显著缺点是分化能力降低。Communications Biology 研究报告称，脂肪生成分化效率从未编辑细胞的67.8%下降到TP53敲除克隆的37.7%。转录组分析显示，细胞周期基因活性增加，但与肌肉分化和粘附相关的基因减少。此外，由于TP53是关键的肿瘤抑制因子，其失活是癌症的标志，这一策略引发了安全性和监管方面的担忧。虽然这些细胞是用于消费而非医疗用途，但这些问题需要仔细考虑[1].
“在所有候选者中，TP53敲除产生了最显著的效果，到第30天丰度增加了超过1000倍。”
- Communications Biology [1]
接下来，让我们探索另一个重要的CRISPR目标。
3.缺氧诱导因子1-α (HIF1A)
HIF1A在帮助培养肉细胞适应生物反应器中常遇到的低氧环境中起着关键作用，这些生物反应器配备了集成传感器. 当氧气渗透受限时，这种调节器变得尤为重要。通过使用CRISPR稳定HIF1A，细胞可以在氧气水平降低的情况下维持能量生产并保持活力。
主要优势
编辑HIF1A重新编程细胞代谢，将其从依赖氧气的呼吸转变为无氧糖酵解。这种转变确保细胞在缺氧条件下继续产生能量。结果？能够在不担心氧气不足的情况下以更高密度培养细胞。这对于扩大培养肉生产规模, 尤其是在创建更厚的组织结构时，是一个改变游戏规则的因素。
细胞类型适用性
肌肉卫星细胞和肌母细胞从HIF1A编辑中受益最大。这些是肌肉纤维发育的关键参与者，它们在紧密包装的生物反应器中的存活对于实现高产量至关重要。稳定的HIF1A使这些细胞能够有效地切换代谢途径，确保它们即使在长时间培养期间也能保持活力。
潜在挑战
一个主要挑战是确保编辑后的细胞在多次传代后仍能分化为功能性肌肉纤维。这需要技术上的微调以避免分化能力的丧失。除了实验室之外，监管障碍和公众认知增加了复杂性。基因编辑的肉类产品必须通过广泛的安全评估，以确保其在人类消费和环境影响方面的安全性，然后才能进入市场。同时，消费者对这类产品的接受度在不同地区差异很大[3]. 这些挑战突显了在扩展到新目标之前完善基因编辑技术的必要性。接下来，我们将探讨进一步增强肌源性分化的基因。
4. 肌源性调节因子 (MRFs: MYOD1, MYOG)
MYOD1在将细胞承诺为肌源性谱系中起关键作用，而MYOG促进肌母细胞融合成成熟的肌管。有趣的是，过表达MYOD1可以将成纤维细胞重新编程为肌源性细胞，有效绕过初级卫星细胞中看到的自然衰老限制[5].
主要优势
当在牛成纤维细胞中结合MYOD1过表达与MSTN敲除，并与DLP 3D生物打印集成在100‑µm槽纹水凝胶, 上的结果令人印象深刻。这种方法增强了肌肉的排列和分化，能够创建厘米级的培养肉结构。2025年3月发表在《动物科学与生物技术杂志》的一项研究展示了这种方法，使用非病毒递送MYOD1和CRISPR介导的MSTN敲除来工程化牛成纤维细胞[5]. 通过消除对肌肉分化的抑制信号，这一策略将细胞引导至更强的肌源性身份，从而产生质地更好的培养肉。这种双重方法强调了精确平衡增殖和分化途径的重要性。
细胞类型适用性
成纤维细胞是MYOD1靶向的一个有效起点。通过简单的皮肤活检（类似于常规的耳标），这些细胞来源于中胚层，对MYOD1诱导的转分化反应良好[5]. 另一方面，卫星细胞虽然能够在新生儿中贡献多达30%的肌肉细胞核，但随着年龄的增长显著减少。这使得成纤维细胞成为工业规模培养肉生产中更实用和可扩展的选择。
潜在挑战
主要障碍之一是找到细胞增殖和分化之间的正确平衡。例如，旨在促进细胞扩增的基因改造——如TP53敲除——可能会无意中抑制关键的肌肉分化因子，可能阻碍细胞成熟为功能性肌肉组织的能力[1]. 此外，虽然出于食品安全原因更倾向于使用非病毒方法，如Piggybac转座子系统，但它们需要仔细优化以确保高效的基因传递。外部因素，如3D打印的微槽，对于实现适当的肌纤维对齐仍然至关重要[5].
5. 细胞周期调节因子 (e.g. , CDKN2A)
CDKN2A在触发衰老中起关键作用，有效地阻止细胞分裂。通过使用CRISPR/Cas9敲除CDKN2A，研究人员可以绕过海弗里克极限。这使得肌肉干细胞能够在其通常寿命之外继续分裂，同时仍然保持分化为功能性肌肉组织的能力。这一突破解决了培养肉生产中的最大挑战之一：生产工业规模制造所需的大量可行的、功能性的细胞。
主要优势
直接靶向CDKN2A解决了培养肉生产中细胞增殖有限的问题。
编辑CDKN2A提高了可扩展性并降低了成本。例如，在2025年6月，南京农业大学, 的研究团队，由丁世杰、李春宝和周光宏领导，在食品材料研究. 中发表了他们的研究成果。他们成功开发了CRISPR编辑的CDKN2A敲除猪卫星细胞系。这些细胞在A19无血清培养基中稳定增殖超过18代，存活率超过90%。重要的是，这些细胞保留了关键肌生成调节因子（PAX7、MYOD和MYOG）的表达，并分化为成熟的、MyHC阳性的肌管。当这些编辑过的细胞播种到植物基3D支架上时，形成了具有改善的咀嚼性和粘性的肉状结构 [2].
“基于CRISPR的CDKN2A敲除细胞提供了可再生的肌肉祖细胞来源，减少了对反复动物活检的依赖。” – 食品材料研究 [2]
细胞类型适用性
猪卫星细胞, 对于肌肉再生至关重要，对CDKN2A编辑反应特别好。这种方法对其他牲畜物种也有潜力。CDKN2A编辑细胞的一个关键优势是它们与无血清培养基配方. 的兼容性。这消除了对昂贵且有伦理争议的胎牛血清的需求，减少了批次之间的变异性并降低了污染风险 [2].
潜在挑战
虽然南京的研究强调了显著的益处，但在培育肉中更广泛应用CRISPR仍面临挑战。脱靶突变仍然是一个关注点，必须仔细监测。此外，必须严格遵循转基因食品产品的监管安全标准。研究人员还需要确保长期分化，以保证最终产品与天然肌肉组织非常相似。这使得协议的改进和3D支架的彻底验证变得至关重要[2].
这些发现以及其他CRISPR目标总结在以下比较表中。
比较表
表：以下总结了五个CRISPR目标，这些目标改善了细胞增殖、分化和代谢适应，以实现可扩展的培育肉生产。
| CRISPR 目标 | 主要益处 | 目标细胞类型 | 挑战 | |
|---|---|---|---|---|
| 肌肉抑制素 (MSTN) | 促进肌肉生长 | 牛和猪的肌肉细胞 | 需要详细的基因组理解；如果管理不当，可能导致意外的表型变化风险[4] | |
| P53 (TP53) | 显著增加增殖；延缓复制衰老（细胞数量在第30天增加超过1,000倍）[1] | 牛间充质干细胞 (bMSCs) | 分化能力降低；脂肪生成分化从67.8%下降到37. | 7%；肌肉相关基因的下调 [1] |
| HIF1A | 改善代谢适应性 | 牛和猪细胞 | 需要仔细编辑以避免代谢紊乱 [4] | |
| MRFs (MYOD1, MYOG) | 对肌纤维形成和再生至关重要 | 猪卫星细胞（肌肉干细胞） [2] | 在快速扩增以实现工业规模化时，维持高表达水平具有挑战性 [2] | |
| CDKN2A | 支持超过18次传代的稳定增殖，>90%存活率；绕过衰老 [2] | 猪卫星细胞（肌肉干细胞） [2] | 需要特定的无血清培养基 (e.g. , A19) 以保持干性和分化在长期培养中 [2] |
选择合适的目标需要在细胞增殖和有效分化能力之间取得平衡。这突显了在培养肉细胞工程中微调这些过程的重要性。
结论
CRISPR 技术在解决培养肉生产中的关键挑战方面具有巨大潜力，包括有限的细胞增殖、衰老和 高生产成本. 例如，TP53 基因敲除 已被证明在短短 30 天内使细胞数量增加超过 1,000 倍 [1]. 同样，CDKN2A 编辑 使细胞在 15-18 次传代中稳定增殖，无血清条件下的存活率超过 90% [2]. 这减少了对昂贵动物血清的依赖，并最大限度地减少了对动物活检的重复需求。
然而，在快速细胞增殖与分化为肌肉组织的能力之间取得适当的平衡仍然是一个关键挑战。虽然TP53敲除显著增加了细胞数量，但可能会阻碍分化。因此，保持像 MYOD1和 MYOG这样的调节因子的作用对于生成适合培养肉的成熟肌肉组织至关重要。
对于旨在应用这些基因策略的研究团队，
预计全球肉类需求将在2020年至2030年间增长14%[1], 这些CRISPR目标为培养肉生产中的可扩展和成本效益解决方案铺平了道路。
常见问题解答
哪个CRISPR目标在不影响分化的情况下最能促进生长？
在增强生长同时保持分化的最佳CRISPR目标是无血清、基因工程卫星细胞系统. 这种方法支持一致的细胞生长和有效的分化，使其成为大规模培养肉生产的强大选择。
如何确保TP53或CDKN2A编辑对培养肉类是安全的？
为了确保TP53或CDKN2A编辑对培养肉类是安全的，需要采取几个重要步骤。这些步骤包括彻底的遗传稳定性测试, 建立结构化的细胞库系统, 并使用先进的工具如下一代测序来检测任何突变。此外，遵循严格的监管合规指南确保在整个生产过程中安全性和一致性。
哪些编辑有助于细胞在低氧、高密度生物反应器中茁壮成长？
开发不含血清的培养基，并根据适当的营养素、生长因子、脂质、非必需氨基酸和抗氧化剂的混合物进行定制，在促进细胞增殖和分化方面起着关键作用。这些调整不仅支持更好的细胞活力，还增强了功能性，特别是在低氧和高密度等挑战性环境中。
