Nếu tôi loại bỏ huyết thanh nhưng giữ nguyên dòng tế bào hoang dã, tôi không nên mong đợi việc điều chỉnh môi trường một mình có thể ngăn chặn sự lão hóa, trôi dạt, hoặc mất kết dính. Trong bài viết này, tôi cho thấy rằng thành công không có huyết thanh trong thịt nuôi cấy thường phụ thuộc vào cả hai mặt của hệ thống: một môi trường xác định bên ngoài tế bào, và các chỉnh sửa bên trong tế bào giúp nó tiếp tục phân chia, giữ kết dính, và duy trì chức năng cơ.
Đối với các kỹ sư quy trình sinh học và các nhóm nuôi cấy tế bào, các điểm cốt lõi rất đơn giản:
- Môi trường không có huyết thanh thay đổi hành vi của tế bào, không chỉ là danh sách thành phần. Sự hấp thụ glucose, glutamine, glycine, và cystine có thể thay đổi dưới điều kiện không có huyết thanh.
- Các tế bào vệ tinh sơ cấp đạt giới hạn dòng tế bào sớm. Các tế bào lợn hoang dã thường mất các đặc điểm cơ học vào khoảng lần cấy 10.
- CDKN2A knockout là một trong những ví dụ rõ ràng nhất trong bài viết: các dòng tế bào vệ tinh lợn đã chỉnh sửa được mở rộng cho 15+ lần truyền, giữ >90% khả năng sống sót, và trong một số dòng vô tính cho thấy ~194 lần cao hơn PAX7 tại lần truyền 20 so với các đối chứng loại hoang dã.
- Có một sự đánh đổi. Mở rộng tốt hơn không đảm bảo sự phân hóa ở giai đoạn muộn; một số dòng đã chỉnh sửa vẫn cho thấy sự phân hóa thấp hơn vào lần truyền 30.
- Việc xác nhận phải diễn ra trong thiết lập sản xuất: cùng môi trường không có huyết thanh, cùng chế độ nuôi cấy, và cùng các chỉ số đo lường cho sự phát triển, tích tụ chất thải, dấu hiệu dòng dõi, và sự hợp nhất.
Một phiên bản ngắn gọn: nếu bạn muốn một quy trình không có huyết thanh có thể chuyển sang sản xuất, tôi sẽ coi thiết kế môi trường, chỉnh sửa gen, sàng lọc dòng vô tính và phù hợp với bioreactor như một quy trình làm việc liên kết, không phải bốn công việc riêng biệt.
| Khu vực tập trung | Điều tôi sẽ kiểm tra đầu tiên | Tại sao nó quan trọng |
|---|---|---|
| Kiểm soát chu kỳ tế bào | CDKN2A, tuổi thọ đoạn, PAX7 | Giúp hiển thị liệu dòng có thể mở rộng mà không bị lão hóa sớm hay không |
| Tín hiệu tăng trưởng | Phản ứng IGF1R, EGFR, FGFR | Hệ thống không có huyết thanh có hỗ trợ tín hiệu bên ngoài thấp hơn |
| Sống sót trong điều kiện căng thẳng | Khả năng sống, dấu hiệu apoptosis, phản ứng cắt | Rút huyết thanh và truyền có thể đẩy tế bào vào mất mát |
| Xử lý dinh dưỡng | Sử dụng glucose, lactate, ammonia, hấp thụ axit amin | Hấp thụ nhanh hơn cũng có thể có nghĩa là tích tụ chất thải nhanh hơn |
| Duy trì danh tính | PAX7, MYOD, MYOG, chỉ số hợp nhất | Một dòng phát triển nhanh không có ích nếu nó không còn hình thành mô mục tiêu |
Sau đó, tôi sẽ đi qua nơi mà nuôi cấy không có huyết thanh thất bại, những chỉnh sửa nào ánh xạ đến những điểm thất bại đó, và cách tôi sẽ xác nhận một dòng đã chỉnh sửa trước khi chuyển giao quy trình.
Chỉnh sửa hệ gen CRISPR-Cas trong dòng tế bào động vật có vú | Xem trước giao thức
Các rào cản sinh học chính đối với nuôi cấy không có huyết thanh
Loại bỏ huyết thanh làm lộ ra ba nút thắt cổ chai: tín hiệu, bám dính và nhận dạng tế bào. Vấn đề bắt đầu bên trong tế bào, không chỉ trong công thức môi trường. Điều đó quan trọng, vì nó định hình nơi các nhóm dành thời gian: điều chỉnh môi trường, chỉnh sửa gen, hoặc kết hợp cả hai.
| Tính năng | Nuôi cấy có bổ sung huyết thanh | Nuôi cấy không có huyết thanh |
|---|---|---|
| Sinh sản | Mạnh mẽ; được hỗ trợ bởi các yếu tố tăng trưởng đa dạng | Biến đổi; dễ bị lão hóa sao chép và dừng lại ở G1/S |
| Bám dính | Được hỗ trợ bởi các protein ECM có trong huyết thanh (fibronectin, vitronectin) | Yêu cầu lớp phủ hoặc phụ gia ngoại sinh; nguy cơ tách rời tăng lên |
| Vận chuyển chất dinh dưỡng | Được hỗ trợ bởi các protein vận chuyển như albumin và transferrin | Phụ thuộc vào sự hấp thụ ít đệm hơn; yêu cầu tối ưu hóa nồng độ ITS-X và lipid |
| Nguy cơ apoptosis | Thấp; các con đường PI3K-AKT và MAPK-ERK được kích hoạt mạnh mẽ | Cao hơn; độ nhạy cảm với stress oxy hóa và chất thải trao đổi chất tăng lên |
| Ổn định danh tính | Nói chung ổn định qua các lần chuyển sớm đến giữa | Nguy cơ cao của sự trôi dạt kiểu hình; các dấu hiệu gốc thường giảm nhanh chóng |
Mất tín hiệu tăng trưởng và sống sót
Một khi huyết thanh bị loại bỏ, mức độ yếu tố tăng trưởng giảm mạnh.Các tế bào sau đó mất đi nhiều sự hỗ trợ bên ngoài giúp duy trì hoạt động cao của PI3K-AKT và MAPK-ERK. Trong thực tế, điều đó có nghĩa là nhiều apoptosis hơn và sự phát triển yếu hơn, điều này là một vấn đề trực tiếp cho việc mở rộng quy mô.
Kết dính, Hấp thụ Dinh dưỡng, và Tắc nghẽn Căng thẳng
Huyết thanh không chỉ nuôi dưỡng tế bào. Nó cũng cung cấp các protein ECM hỗ trợ sự gắn kết và lan rộng. Không có fibronectin, vitronectin, và các yếu tố liên quan, các tế bào vệ tinh sơ cấp có khả năng tách ra và đi vào apoptosis, đặc biệt là dưới lực cắt trong điều kiện bioreactor. Ức chế ROCK với Y-27632 có thể giúp đến một mức độ nào đó, nhưng nó không loại bỏ vấn đề gắn kết.
Xử lý dinh dưỡng cũng trở nên khó khăn hơn. Không có protein vận chuyển huyết thanh, sự hấp thụ glucose, glutamine, glycine, và cystine trở nên ít được đệm hơn [1] . Đồng thời, chất thải trao đổi chất như amoniac và lactate có thể tích tụ và ức chế sự phát triển [3]. Vì vậy, ngay cả khi môi trường cơ bản trông ổn trên giấy, cân bằng vận chuyển và chất thải vẫn có thể trở thành bước giới hạn.
Trôi Dạt Kiểu Hình Trong Quá Trình Thích Ứng Không Có Huyết Thanh
Thích ứng không có huyết thanh có thể chọn lọc cho các tiểu quần thể chịu được điều kiện mới nhưng không còn phù hợp với tiêu chuẩn sản phẩm. Đó là cái bẫy: tế bào có thể phát triển tốt, nhưng mất khả năng hình thành mô dự kiến.
Qua các lần truyền nối tiếp, các dấu hiệu như PAX7, MYOD, và MYOG có thể giảm [2]. Theo dõi các dấu hiệu dòng dõi trong quá trình thích ứng để trôi dạt xuất hiện sớm thay vì sau một chu kỳ tối ưu hóa môi trường dài. Đây là những con đường mà chỉnh sửa gen cần ổn định hóa.
Các Phương Pháp Chỉnh Sửa Gen Cải Thiện Hiệu Suất Không Cần Huyết Thanh
Các Mục Tiêu Chỉnh Sửa Gen cho Nuôi Cấy Tế Bào Không Cần Huyết Thanh: Lợi Ích so với Sự Đánh Đổi
Những rào cản này rơi vào ba lớp chỉnh sửa: tín hiệu, sống sót và phân hóa.
Chỉnh Sửa Tín Hiệu Yếu Tố Tăng Trưởng và Sử Dụng Dinh Dưỡng
Một con đường trực tiếp là điều chỉnh tăng hoặc làm nhạy IGF1R, EGFR, và FGFR để tế bào phản ứng mạnh hơn với IGF-1, EGF và bFGF [2]. Điều đó quan trọng trong môi trường không có huyết thanh, nơi mà mức độ yếu tố tăng trưởng thường thấp theo thiết kế. Nếu tín hiệu được cải thiện, kiểm soát chu kỳ tế bào thường trở thành nút thắt tiếp theo.
Điều hòa chu kỳ tế bào CDKN2A nổi bật ở đây. CRISPR/Cas9 knockout của exon 2 đã tạo ra các dòng tế bào vệ tinh lợn CDKN2A−/− mở rộng mạnh mẽ trong hơn 15 lần truyền trong môi trường không có huyết thanh gồm 19 thành phần. Trong các dòng cụ thể, biểu hiện PAX7 đã tăng khoảng 194 lần ở lần truyền thứ 20 so với các đối chứng loại hoang dã [2].
Chỉnh sửa các chất vận chuyển solute carrier (SLC) có thể giúp tránh giới hạn hấp thu trong quá trình mở rộng quy mô cho glucose, glutamine, glycine và cystine [1]. Nhưng có một vấn đề. Hấp thu cao hơn cũng dẫn đến sự tích tụ nhanh hơn của lactate và ammonia, vì vậy các chỉnh sửa chất vận chuyển cần được lên kế hoạch cùng với việc trao đổi môi trường và kiểm soát chất thải từ ngày đầu tiên. Tự chúng, các chỉnh sửa hấp thu là không đủ.
Cải thiện Sự Sống Sót của Tế Bào và Kháng Căng Thẳng Không Huyết Thanh
Rút huyết thanh, truyền thường xuyên và cắt shear trong bioreactor đều đẩy tế bào vào điều kiện apoptosis cao hơn.Chỉnh sửa con đường BCL2 - bằng cách tăng cường các thành viên chống chết tế bào hoặc ức chế các thành viên thúc đẩy chết tế bào - có thể giảm mất tế bào trong quá trình chuyển đổi đó. Điều này càng trở nên quan trọng hơn trong các hệ thống vi hạt, nơi mà tế bào phải đối mặt với cả căng thẳng bám dính và căng thẳng cơ học.
Bất kỳ chỉnh sửa nào cải thiện sự sống sót hoặc kéo dài sự tăng sinh đều cần kiểm tra sự ổn định của bộ gen trong toàn bộ phạm vi sản xuất. Tế bào vệ tinh lợn CDKN2A−/− duy trì tỷ lệ tế bào sống trên 90% trong quá trình tăng sinh liên tục không có huyết thanh [2]. Tuy nhiên, các nhóm nên kiểm tra tính toàn vẹn nhiễm sắc thể tại các khoảng thời gian chuyển đoạn nhất định thay vì giả định rằng sự ổn định sẽ duy trì.
Cân bằng Khả năng Bám dính, Tăng sinh và Phân hóa
Phần khó khăn nhất là quản lý sự kéo giữa mở rộng và phân hóa. CDKN2A knockout duy trì tiềm năng cơ bắp qua lần nuôi cấy thứ 10, trong khi các tế bào loại hoang dã trong điều kiện không có huyết thanh gần như hoàn toàn mất đi các đặc tính cơ bắp. Chỉ số hợp nhất từ 16.3% đến 56.3% đã được báo cáo trong các dòng đã chỉnh sửa [2]. Tuy nhiên, đến lần nuôi cấy thứ 30, ngay cả các tế bào đã chỉnh sửa cũng có thể cho thấy khả năng phân hóa giảm [2].
| Chỉnh sửa Mục tiêu | Lợi ích Chính trong Nuôi cấy Không Serum | Sự Đánh đổi Chính |
|---|---|---|
| CDKN2A (p16/p14) | Vượt qua lão hóa; mở rộng ổn định cho hơn 15 lần truyền [2] | Khả năng phân biệt có thể giảm ở các lần truyền rất cao (P30+) [2] |
| IGF1R / EGFR / FGFR | Phản ứng tăng sinh mạnh hơn với các yếu tố tăng trưởng xác định [2] | Nguy cơ kích hoạt quá mức dẫn đến trôi dạt kiểu hình |
| Vận chuyển SLC | Cải thiện sự hấp thu glucose, glycine và cystine [1] | Tải trọng trao đổi chất cao hơn; tăng tích lũy lactate và ammonia [1] |
| BCL2 / phản ứng căng thẳng | Giảm apoptosis trong quá trình rút lui và căng thẳng cắt [2] | Yêu cầu giám sát ổn định gen và đánh giá an toàn thực phẩm [2] |
| Integrins / gen ECM | Cải thiện sự gắn kết trong hệ thống vi hạt và giàn giáo [2] | Biểu hiện quá mức có thể ức chế sự tách rời tế bào trong quá trình chuyển giao [2] |
Chỉnh sửa kết dính hữu ích nhất trong các thiết lập vi hạt hoặc giàn giáo.Chúng được coi là công cụ đặc thù theo định dạng, không phải là giải pháp cho mọi quy trình không có huyết thanh.
Hệ thống CRISPR có thể điều chỉnh cung cấp cho các nhóm một cách thực tế để xử lý sự đánh đổi giữa mở rộng và phân biệt. Ý tưởng rất đơn giản: sử dụng các chỉnh sửa có thể điều chỉnh để tách giai đoạn mở rộng khỏi phân biệt.
Không có chỉnh sửa nào trong số này quan trọng nếu kiểu hình không giữ được trong môi trường không có huyết thanh dự định.
sbb-itb-ffee270
Xây dựng và Xác nhận Dòng Tế bào Đã Chỉnh sửa cho Văn hóa Không Huyết thanh
Tìm chỉnh sửa phù hợp chỉ là một phần của công việc. Phần khó hơn là biến chỉnh sửa đó thành một dòng tế bào ổn định có thể xử lý sản xuất không có huyết thanh. Điều đó đòi hỏi một quy trình chặt chẽ liên kết chỉnh sửa, lựa chọn dòng vô tính và xác nhận trong một quy trình. Và quy trình đó nên kiểm tra trực tiếp các ràng buộc về tín hiệu, sự sống sót và sự gắn kết đã được xác định.
Lựa chọn Công cụ Chỉnh sửa và Phương pháp Giao hàng
Đối với các mục tiêu như CDKN2A, CRISPR/Cas9 knockout là bước đầu tiên thực tế khi mục tiêu là loại bỏ một chất ức chế chu kỳ tế bào và hỗ trợ mở rộng lâu dài [2]. Trong các tế bào gia súc sơ cấp, các tuyến đường giao hàng phổ biến bao gồm các hệ thống chuyển gen không virus như Lipofectamine và các hệ thống virus như lentiCRISPR v2 [2][4]. Trước khi chuyển sang công việc nhân bản, hãy xác nhận hiệu quả giao hàng.
Một điểm quan trọng hơn đôi khi được đánh giá cao: sàng lọc từng bản sao trong môi trường và chế độ nuôi cấy chính xác được lên kế hoạch cho sản xuất. Nếu quy trình sản xuất sử dụng môi trường không có huyết thanh xác định, nuôi cấy bám dính tĩnh, vi hạt hoặc một thiết lập khác, đó là điều kiện mà các tế bào nên đối mặt trong quá trình sàng lọc.
Sàng lọc các tế bào đã chỉnh sửa dưới công thức không có huyết thanh sản xuất
Một phương pháp phổ biến là cô lập các dòng bằng cách pha loãng giới hạn và sau đó xác nhận chỉnh sửa bằng cách giải trình tự Sanger tại vị trí mục tiêu [2]. Một khi chỉnh sửa được xác minh, việc sàng lọc nên tiếp tục trong cùng công thức không có huyết thanh và chế độ nuôi cấy dự định cho sản xuất [2][1].
Ở giai đoạn này, đo lường các yếu tố cơ bản cho bạn biết liệu bản sao có thể sống với quy trình hay chỉ đơn thuần là sống sót qua chỉnh sửa:
- Sự phát triển
- Khả năng sống sót
- Tiêu thụ glucose
- Sản xuất lactate
- Tích tụ ammonia
Cũng có ý nghĩa khi thêm PAX7 RT-qPCR sớm, vì mất tính gốc có thể xuất hiện trước khi một dòng thất bại theo cách rõ ràng hơn [1][2].
Đặc điểm hóa tế bào đã chỉnh sửa trước khi chuyển quy trình
Trước khi chuyển quy trình, việc xác nhận nên bao gồm bốn lĩnh vực liên kết: chỉnh sửa genome, phản ứng đường dẫn, ổn định qua các lần chuyển và chức năng. Mỗi cái giải quyết một vấn đề khác nhau. Kiểm tra genome giải quyết rủi ro trôi dạt kiểu hình. Phân tích môi trường đã sử dụng chỉ ra giới hạn hấp thụ dinh dưỡng và tích tụ chất thải.Fusion index cho bạn biết liệu sự phân hóa cơ vẫn còn hay không [2][1].
| Loại Xét Nghiệm | Những Gì Nó Đo Lường | Tại Sao Nó Quan Trọng Đối Với Dòng Thịt Nuôi Không Huyết Thanh |
|---|---|---|
| T7 Endonuclease I / Sanger Sequencing | Hiệu quả chỉnh sửa và trình tự gen chính xác | Xác nhận thành công việc knockout hoặc knock-in gen trước khi mở rộng quy mô [2] |
| RT-qPCR (PAX7, MYOD, MYOG, BAX, CCND1) | Mức độ phiên mã của các dấu hiệu tế bào gốc, phân hóa và apoptosis | Theo dõi sức khỏe tế bào và tiềm năng phân hóa qua các lần truyền dài hạn [2][4] |
| Miễn dịch huỳnh quang (MyHC / CK18) | Biểu hiện protein đặc hiệu dòng dõi | Đảm bảo các tế bào giữ được đặc tính cơ hoặc biểu mô sau khi chỉnh sửa và thích ứng [2][4] |
| Phân Tích Môi Trường Nuôi Cấy Đã Sử Dụng | Hồ sơ glucose, axit amin, lactate và amoniac | Xác định nhu cầu dinh dưỡng và thông báo chiến lược cung cấp dinh dưỡng cho bioreactor [1] |
| Chỉ Số Hợp Nhất | Tỷ lệ nhân được tích hợp vào các sợi cơ đa nhân | Xác nhận khả năng phân hóa cơ học được giữ lại mà không cần huyết thanh [2] |
| Phân Tích Hồ Sơ Kết Cấu (TPA) | Độ cứng, độ đàn hồi và độ dai của các cấu trúc 3D | Xác nhận rằng các tế bào đã chỉnh sửa tạo ra sản phẩm cuối cùng có các đặc tính vật lý giống thịt [2] |
Xác nhận bộ gen dựa vào xét nghiệm T7 Endonuclease I cộng với giải trình tự Sanger của các dòng đơn lẻ [2]. Xác nhận con đường sử dụng RT-qPCR hoặc Western blot để cho thấy rằng sự thay đổi transcript hoặc protein đã thực sự xảy ra, bao gồm các dấu hiệu như PAX7, MYOD , MYOG và MyHC [2][4].
Đối với tính ổn định lâu dài, tiêu chuẩn là 15-30 lần truyền với các kiểm tra lặp lại về sự phát triển, khả năng sống sót và biểu hiện dấu hiệu. CDKN2A knockout tế bào vệ tinh lợn giữ tỷ lệ tế bào sống trên 90% qua 15 lần truyền trong điều kiện không có huyết thanh, nhưng khả năng phân hóa bắt đầu giảm từ lần truyền thứ 30 [2].
Kiểm tra chức năng sau đó đặt câu hỏi đơn giản nhất: đây có còn là các tế bào bạn cần không? Trong các dòng myogenic, chỉ số hợp nhất cho thấy liệu các tế bào đã chỉnh sửa có thể vẫn hình thành các myotube đa nhân mà không cần huyết thanh [2] . Phân tích Hồ sơ Kết cấu (TPA) sau đó kiểm tra xem các cấu trúc 3D có thể hiện độ cứng, độ đàn hồi và độ dai giống thịt hay không [2].
Sử dụng những dữ liệu đó để thiết lập điều kiện chuyển giao của bản sao cho sản xuất không có huyết thanh.
Từ Dòng Tế Bào Đã Chỉnh Sửa đến Sản Xuất Không Có Huyết Thanh
Khớp Nối Tế Bào Đã Chỉnh Sửa với Thiết Kế Môi Trường và Bioreactor
Một khi một bản sao vượt qua xác nhận, công việc thay đổi. Tại thời điểm đó, thành công phụ thuộc vào mức độ phù hợp của dòng tế bào với quy trình. Sàng lọc thêm sẽ không khắc phục được sự không phù hợp của quy trình.
Phân tích môi trường đã sử dụng nên thúc đẩy việc bổ sung glucose, bổ sung axit amin và liều lượng yếu tố tăng trưởng, bao gồm các đầu vào xác định như bFGF và IGF-1 [2]. Trong các hệ thống bám dính, mật độ gieo hạt trên giàn giáo và cửa sổ bám dính - khoảng 2 giờ trước khi chuyển vào bioreactor - nên được thiết lập từ hành vi bám dính của dòng đã chỉnh sửa, không phải từ các giao thức chứa huyết thanh [2]. Những dữ liệu đó sau đó nên được đưa trực tiếp vào các quyết định về thời gian cho ăn, mật độ gieo hạt và thời gian chuyển.
Các dòng đã chỉnh sửa có thể hỗ trợ mở rộng lâu hơn, mật độ tế bào cao hơn và biểu hiện dấu hiệu ổn định hơn. Điều đó có nghĩa là việc mở rộng quy mô phải tuân theo hành vi đo được của dòng đã chỉnh sửa, không phải giả định loại hoang dã.
Trong thực tế, việc lựa chọn dòng trở thành quyết định mua sắm và mở rộng quy mô, không chỉ là quyết định sinh học.
Những Điểm Chính cho Các Đội R&D, Sản Xuất và Mua Sắm
Thích nghi không có huyết thanh không chỉ là vấn đề công thức môi trường. Nó bắt đầu với dòng tế bào, và tối ưu hóa môi trường một mình sẽ không giải quyết được nó.Chỉnh sửa gen có mục tiêu, đặc biệt là loại bỏ các chất ức chế chu kỳ tế bào như CDKN2A, giải quyết sinh học cơ bản gây ra sự thất bại của các tế bào vệ tinh chính trong điều kiện không có huyết thanh. Tế bào vệ tinh lợn CDKN2A−/− duy trì biểu hiện PAX7 cao hơn khoảng 194 lần so với các đối chứng loại hoang dã ở lần truyền 20, và đạt chỉ số hợp nhất lên đến 56,3% ở lần truyền 10 - giai đoạn mà các tế bào không chỉnh sửa đã mất chức năng sinh cơ bản [2].
Đối với các nhóm phát triển và sản xuất, sự phân chia khá rõ ràng:
- Các nhóm R&D nên xây dựng một quy trình xác thực kiểm tra các dòng đã chỉnh sửa trong điều kiện sản xuất thực tế ngay từ đầu. Điều đó bao gồm sự phát triển, tiêu thụ dinh dưỡng, ổn định dòng dõi và khả năng phân biệt 3D.
- Các đội sản xuất nên sử dụng hồ sơ dinh dưỡng của dòng đã chỉnh sửa để thiết lập thiết kế thức ăn và các thông số của bioreactor, vì các giả định sao chép từ các giao thức chứa huyết thanh có khả năng không chính xác [1].
- Các đội thu mua cần có kế hoạch cung ứng phù hợp với các yêu cầu cụ thể của dòng đã chỉnh sửa, bao gồm các yếu tố tăng trưởng, lipid, chất chống oxy hóa và giàn giáo hoặc vi hạt phù hợp với hồ sơ bám dính của dòng.
Câu hỏi thường gặp
Tại sao tối ưu hóa môi trường không đủ?
Tối ưu hóa môi trường tự nó không đủ. Trong nhiều trường hợp, các tế bào động vật đơn giản là không có các đặc điểm cần thiết cho sản xuất quy mô lớn, chẳng hạn như kháng ứng suất cắt , hiệu quả trao đổi chất, và khả năng sống sót trong huyền phù mật độ cao.
Môi trường không chứa huyết thanh quan trọng, nhưng chúng không khắc phục được các giới hạn tích hợp của tế bào.Những giới hạn đó bao gồm tuổi thọ tăng sinh bị hạn chế, độ nhạy cảm với căng thẳng trong bioreactor, và nhu cầu dinh dưỡng khác nhau giữa các loài và giai đoạn phát triển.
Những chỉnh sửa gen nào quan trọng nhất trong nuôi cấy không có huyết thanh?
Trong sản xuất thịt nuôi cấy, những chỉnh sửa quan trọng nhất là những chỉnh sửa giảm sự phụ thuộc vào các yếu tố tăng trưởng bổ sung. Một ví dụ là xóa CDKN2A, có thể cải thiện sự tăng sinh và phân hóa của tế bào vệ tinh lợn trong điều kiện không có huyết thanh.
Một hướng khác là kỹ thuật hóa tế bào gốc cơ để biểu hiện quá mức có thể điều khiển của FGF2 và RasG12V đột biến. Thiết lập đó hỗ trợ tín hiệu tự tiết và loại bỏ nhu cầu về FGF2 tái tổ hợp trong môi trường.
Các dòng tế bào đã chỉnh sửa nên được xác nhận như thế nào cho sản xuất?
Các dòng tế bào đã chỉnh sửa nên trải qua kiểm tra về gen, protein và chức năng để xác nhận hiệu suất sản xuất và tiềm năng phân biệt.
Trong thực tế, điều đó có nghĩa là kiểm tra xem chỉnh sửa đã thực hiện đúng như dự định mà không tạo ra vấn đề ở nơi khác. Các nhà nghiên cứu nên xác minh rằng các sửa đổi di truyền không làm suy giảm khả năng phân biệt thành các mô mục tiêu, và rằng các đặc điểm dự định, chẳng hạn như khả năng chịu đựng căng thẳng hoặc tăng trưởng không phụ thuộc vào huyết thanh, được biểu hiện như mong đợi.
