إذا قمت بالتعديل أولاً والتحقق لاحقًا، يمكنك إصلاح تغيير غير مستهدف في النسخة المتماثلة. سأبقي سير العمل بسيطًا: اختر طريقة التحرير الأقل خطورة، حافظ على تعرض المحرر قصيرًا، ثم اختبر كل من المواقع غير المستهدفة المتوقعة واستقرار النسخة قبل الإصدار.
بالنسبة لمهندسي العمليات الحيوية، وعلماء زراعة الخلايا، وفرق البحث والتطوير في اللحوم المزروعة، النقطة الرئيسية واضحة. لا تزال أنظمة CRISPR قادرة على القطع في المواقع المتطابقة تقريبًا، وغالبًا ما يتم تحمل 3–6 اختلافات، ويمكن أن تنتقل تلك الأخطاء إلى النسخ المتماثلة ذات الخلية الواحدة الموسعة. يقسم المقال التحكم في المخاطر إلى ثلاث مراحل: قبل التحرير , أثناء التحرير, و بعد التحرير.
إليك القائمة الكاملة بالشروط البسيطة:
-
اختر أداة التحرير الأقل خطورة للعملية
- استخدم التحرير الأساسي أو التحرير الرئيسي عندما يمكنهم إجراء التعديل دون كسر مزدوج في السلسلة
- استخدم التعديل القائم على dCas9 إذا كنت تحتاج فقط إلى تنظيم الجينات
- إذا كنت بحاجة إلى نوكلياز، ابدأ بـ عالي الدقة متغير Cas9
-
تأمين المادة الأولية
- تأكيد هوية خط الخلايا
- تحقق من الميكوبلازما
- سجل رقم المرور
- تسلسل الموقع المستهدف الفعلي في الخط العامل، وليس فقط الجينوم المرجعي
-
فحص الأدلة قبل العمل الرطب
- استخدم أدوات المحاذاة والتسجيل معًا لتحديد الأهداف غير المستهدفة
- يفضل اختيار دليل بملف غير مستهدف أنظف على دليل ذو نشاط مستهدف أعلى فقط
- راقب طول الدليل، محتوى GC بنسبة 40-60%, وتجنب تكرار النوكليوتيدات المتشابهة
-
قلل التعرض داخل الخلية
- استخدم RNP أو توصيل mRNA بدلاً من الأنظمة البلازميدية أو الفيروسية حيثما أمكن
- استخدم الجرعة الفعالة الأدنى
- تجنب تمديد بقاء المحرر فقط لإجبار نتائج النقل
-
أضف ضوابط إضافية للحالات ذات المخاطر الأعلى
- اعتبر استخدام النيكازات المزدوجة
- استخدم أنظمة قابلة للتحفيز, كاس9 المنقسم, أو الأنظمة التي تتحكم بها الضوء عندما يكون التوقيت مهمًا
- أضف بروتينات مضادة لـ CRISPR كخطوة إيقاف عند الحاجة
-
تحقق بشكل صحيح بعد التحرير
- تأكد من التحرير المستهدف أولاً
- تحقق من كل موقع خارج الهدف المتوقع باستخدام تسلسل الأمبليكون المستهدف NGS
- انتقل إلى GUIDE-seq, CIRCLE-seq, CAST-seq, UDiTaS, أو WGS عندما يكون خطر المشروع أعلى
- بالنسبة إلى المحررين الأساسيين أو المحررين الرئيسيين, أضف فحوصات على مستوى RNA حيثما كان ذلك مناسبًا
-
لا تطلق نسخة واحدة بناءً على التسلسل فقط
- قارن 2–3 نسخ مستقلة
- استخدم تحكمًا أبويًا غير معدل
- قم بإزالة النسخ ذات عدم الاستقرار أو الانحراف في النمط الظاهري
- أطلق فقط عندما تكون حالة التحرير، وفحص خارج الهدف، والسجلات مكتملة جميعها
طريقة مختصرة للتفكير في الأمر: التصميم لتجنب القطوع غير المستهدفة، والتسليم لتحديد الوقت داخل الخلية، ثم التحقق من العمق الذي يتطلبه خطر المشروع. هذا هو الخيط الذي يمر عبر القطعة بأكملها.
التحكم في مخاطر CRISPR خارج الهدف: قائمة تحقق من 3 مراحل لتحرير خطوط الخلايا
قائمة التحقق قبل التحرير: تقليل المخاطر قبل بدء التحرير
حدد هدف التحرير واختر طريقة التحرير الأقل خطورة
قبل أن تطلب أي كاشف، كن واضحًا جدًا بشأن ما يُقصد بالتحرير القيام به. لا يحمل التغيير في النوكليوتيد الواحد، أو التعديل النسخي، أو الإزالة، أو الإدخال نفس مخاطر خارج الهدف. كما أنها لا تتطلب نفس الأداة.
ترتيب المخاطر العام واضح. تجلس النوكليازات المكونة للـ DSB مثل Cas9 وCas12 في قمة المخاطر لأنها يمكن أن تسبب حذفًا كبيرًا، وانتقالات، واستجابات تلف الحمض النووي [1] [7]. يستخدم المحررون الأساسيون والمحررون الرئيسيون النيكازات، لذا يتجنبون DSBs ويقللون من خطر التغيرات الهيكلية [1][5]. للتعديل النسخي، يترك المحررون الجينيون مثل dCas9 المدمج مع معدلات النسخ تسلسل الحمض النووي دون تغيير [1].
القاعدة العملية بسيطة: استخدم الطريقة الأقل سمية جينية التي يمكنها أن تقدم التعديل الذي تحتاجه. بالنسبة لتغييرات النوكليوتيد الواحد، فإن CBEs أو ABEs هي أفضل من HDR، الذي يمكن أن يقدم indels [3][1]. بالنسبة للاستبدالات والإدخالات أو الحذف الصغيرة، يظهر التحرير الرئيسي غالبًا نشاطًا أقل خارج الهدف من CRISPR-Cas9 القياسي [1]. إذا كان عليك استخدام نوكلياز، اختر نوعًا عالي الدقة مثل SpCas9-HiFi, eSpCas9, أو SpCas9-HF1 [1][6].
بمجرد تحديد نهج التحرير، قم بتثبيت خط الخلايا العامل وتسلسل الهدف الدقيق.
تأكيد هوية خط الخلايا، وتاريخه، وتسلسل موقع الهدف
إذا تم تحديد خط الخلايا بشكل خاطئ أو تلوثه، فإن بقية سير العمل يبدأ في التذبذب. حتى دليل RNA المصمم جيدًا لن ينقذ المادة الأولية السيئة. تحقق من هوية خط الخلايا قبل بدء أي تحرير. في الوقت نفسه، تأكد من حالة الميكوبلازما وسجل رقم المرور الحالي، حيث يمكن للخلايا ذات المرور العالي أن تغير الاستقرار الجينومي وكفاءة التحرير [1][6].
بنفس الأهمية، لا تعتمد فقط على الجينوم المرجعي. تسلسل الموقع المستهدف الدقيق في خط الخلايا العامل. هذه الخطوة تساعدك في اكتشاف SNPs أو indels التي قد تعيق ارتباط الدليل أو تخلق مواقع جديدة خارج الهدف [1][6].
بعد ذلك، انتقل إلى تصميم الدليل.
قم بتشغيل فحص خارج الهدف باستخدام الحاسوب قبل اختيار الكواشف
بمجرد تأكيد الموقع المستهدف، قم بفحص مرشحي دليل RNAs باستخدام الحاسوب قبل الالتزام بالعمل في المختبر الرطب. استخدم أدوات تعتمد على المحاذاة، مثل Cas-OFFinder أو FlashFry, وأدوات تعتمد على التقييم، مثل تقييم CFD أو DeepCRISPR. تساعد المجموعة الأولى في العثور على المواقع الجينومية ذات التماثل التسلسلي. تساعد الثانية في ترتيب تلك المواقع حسب احتمالية القطع المتوقعة [1] [5].
عند اختيار الأدلة، يجب أن يتفوق الملف الشخصي النظيف خارج الهدف على الكفاءة الخام على الهدف. الدليل الذي يحتوي على كفاءة 70% على الهدف ولا توجد أهداف متوقعة خارج الهدف هو مكان أكثر أمانًا للبدء من دليل بكفاءة 90% وعدة مواقع عالية الخطورة [6]. في بعض الإعدادات، يمكن أن يؤدي تقصير طول الدليل من 20 bp إلى 17-18 bp إلى تقليل الأحداث خارج الهدف بما يصل إلى 500 ضعف دون فقدان كبير في دقة الهدف [5]. استهدف محتوى GC بين 40% و60%، وتجنب تكرار أربع قواعد متطابقة أو أكثر [6][5].
ومع ذلك، فإن الفحص في السيليكو له حدود. لا يأخذ في الاعتبار بشكل جيد حالة الكروماتين أو دورة الخلية أو السياق الخاص بالخلية [1][6][4]. فكر فيه كمرشح، وليس كدليل.إنه يضيق المجال، لكنه لا يحل محل التأكيد التجريبي.
قدم المواقع المتوقعة ذات المخاطر العالية إلى خطة التحرير والتحقق.
sbb-itb-ffee270
قائمة التحقق من التحرير: اختيار المحرر، التوصيل، والتعرض
استخدم المحررين ذوي التخصص العالي ومرشدات RNA المصنفة جيدًا
ابدأ بقائمة الأهداف المتوقعة خارج الهدف واستخدمها لاختيار المحرر. في معظم الحالات، يكون نوع SpCas9 عالي الدقة - SpCas9-HiFi، eSpCas9، أو SpCas9-HF1 - خيارًا أفضل من SpCas9 البري [6][1]. يمكن لـ SpCas9 البري تحمل ما يصل إلى ثلاثة إلى خمسة اختلافات في أزواج القواعد, خاصة في المنطقة البعيدة عن PAM, وهذا يخلق خطرًا كبيرًا خارج الهدف في خطوط الخلايا الحساسة [3].
قاعدة بسيطة تساعد هنا: استخدم المحرر عالي الدقة الأقل نشاطًا الذي لا يزال يقدم التعديل المقصود.
بالنسبة للمحررين الأساسيين، تتبع التعديلات الجانبية و تأثيرات RNA خارج الهدف بشكل منفصل عن مخاطر DNA خارج الهدف [1] [8] . تلك هي أوضاع فشل مختلفة، وتحتاج إلى فحوصات منفصلة. إذا كان بإمكانك إجراء التعديل دون كسر مزدوج في السلسلة, قد يكون التحرير الأساسي أو التحرير الأولي مناسبًا بشكل أفضل في عمليات العمل ذات المخاطر العالية [1][8].
بمجرد اختيار المحرر، تكون المهمة التالية هي الحفاظ على وقته داخل الخلية قصيرًا قدر الإمكان.
حدد استمرارية المحرر بالتوصيل العابر والجرعة الفعالة الدنيا
تعتبر استمرارية المحرر مهمة بقدر أهمية اختيار المحرر.كلما بقي المحرر نشطًا في الخلية لفترة أطول، زادت المدة التي يمكنه العمل فيها في المواقع ذات الاحتمالية المنخفضة. وهذا يجعل تنسيق التسليم نقطة تحكم رئيسية.
استخدم التسليم العابر مثل RNPs أو mRNA, وتجنب الحمض النووي البلازميدي أو النواقل الفيروسية التي تمدد تعبير المحرر [1][5] . في الممارسة العملية، يجب أن يكون تسليم RNP هو الافتراضي [6].
الجرعة مهمة أيضًا. يزيد تركيز النوكلياز العالي من فرصة الانقسام في المواقع خارج الهدف ذات الحساسية المنخفضة [5]. استخدم الجرعة الفعالة الدنيا. إذا كانت كفاءة النقل ضعيفة، فلا تقم فقط بإضافة المزيد من الكواشف وتأمل في الأفضل. غالبًا ما يؤدي ذلك إلى تحويل المشكلة بدلاً من حلها.
إضافة تدابير حماية دقيقة لعمليات العمل ذات المخاطر العالية
تحتاج بعض عمليات العمل إلى حواجز إضافية. هذا صحيح بشكل خاص للأهداف القريبة من الجينات المسرطنة, مثبطات الأورام, أو في خطوط الخلايا الحساسة لـ p53, حيث يمكن أن يكون لحدث خارج الهدف تكلفة كبيرة [1][6][3].
تشمل تدابير الحماية المفيدة:
- النيكازات المزدوجة, التي تتطلب قطعتين متجاورتين. عادةً ما يتم إصلاح النيك الواحد خارج الهدف دون حدوث طفرة، لذا ينخفض خطر خارج الهدف بشكل كبير مقارنةً بإعداد النوكلياز القياسي [4][1].
- أنظمة Cas9 القابلة للتحفيز، التحكم بالضوء، أو المنقسمة, التي تساعد في الحفاظ على نشاط المحرر ضمن نافذة ضيقة عندما يكون التوصيل فعالاً ويجب أن تبقى التعرضات قصيرة [1].
- بروتينات مضادة لـ CRISPR (Acr), التي تعمل كمفتاح إيقاف. يمكن لهذه البروتينات الطبيعية أن تعطل مركب CRISPR-Cas بعد فترة محددة، مما يوفر لك مكابح جزيئية على نشاط المحرر [1].
قائمة التحقق بعد التحرير: اكتشاف الأحداث خارج الهدف والتحقق من النسخ
فحص المواقع المتوقعة خارج الهدف باستخدام التسلسل المستهدف
بمجرد الانتهاء من التحرير، قم بتأكيد التغيير المقصود في الموقع المستهدف أولاً. للحصول على مرور سريع أولي في الخلايا المجمعة، يمكنك استخدام اختبار انشقاق عدم التطابق مثل T7 Endonuclease I, هضم التقييد، أو PCR محيط. فقط كن حذرًا مع التفسير: كل من هذه الطرق لها حدود حساسية، خاصة للتعديلات النادرة أو المتغيرات المتجانسة [9].
لتحقق صحة مستوى النسخة، التسلسل المستهدف للـ NGS هو المعيار. يوفر لك رؤية كمية لتردد الأليل ويمكنه اكتشاف المتغيرات حتى 0.01% إلى 0.1% [3].
قم بتسلسل كل موقع متوقع خارج الهدف باستخدام التسلسل المستهدف للـ NGS. يجب أن يكون ذلك خطوة التحقق الافتراضية.
تصعيد إلى الفحوصات الجينومية أو الهيكلية عندما يكون خطر المشروع أعلى
الفحص موقعًا بموقع ليس دائمًا كافيًا. إذا كان المحرر أو موقع الهدف أو خط الخلية يشير إلى خطر مخفي، انتقل إلى الفحوصات التي يمكنها التقاط الأحداث التي لم تتوقعها مسبقًا.
فحوصات الاكتشاف الجينومي مثل GUIDE-seq و CIRCLE-seq لا تحتاج إلى قوائم مواقع خارج الهدف مسبقًا.يمكن لـ GUIDE-seq اكتشاف المواقع خارج الهدف بترددات indel منخفضة تصل إلى 0.03% [2]. يمكن لـ CIRCLE-seq تحديد ما يصل إلى 94% من المواقع خارج الهدف في المختبر [3]. تكون هذه الأساليب مفيدة عندما قد يخفي سياق نوع الخلية النشاط خارج الهدف.
إذا كنت قلقًا بشأن الترتيبات الكبيرة، فقد تفوت قراءات الأمبليكون القياسية المشكلة الرئيسية. تحتاج الحذف، الانقلابات، والانتقالات إلى اختبارات مبنية للتغيرات الهيكلية، مثل CAST-seq و UDiTaS [1].
تسلسل الجينوم الكامل (WGS) هو الخيار الأوسع. يمكنه اكتشاف indels، التغيرات الهيكلية، وتغيرات عدد النسخ عبر الجينوم [1]. المقايضة هي العمق والتكلفة: عادة ما يحتاج إلى 20–60× تغطية، مما يجعله غير مناسب للفحص الروتيني للسكان بالجملة [1] .
استخدم التسلسل المستهدف للأمبليكون NGS للمواقع المتوقعة. انتقل إلى الفحوصات الجينومية أو الهيكلية للمشاريع ذات المخاطر العالية. بالنسبة للمحررين الأساسيين أو الرئيسيين، أضف RNA-seq للتحقق من التأثيرات خارج الهدف على مستوى RNA.
اختر عدة نسخ مستقلة ووثق معايير الإصدار
بعد فحوصات التسلسل، اختبر النمط الظاهري في أكثر من نسخة واحدة.
لا تتقدم بنسخة معدلة واحدة فقط. اعزل ووسع على الأقل اثنين إلى ثلاث مجموعات استنساخ مستقلة وقارنها مع التحكم الأبوي غير المعدل [4][9]. قم بإزالة النسخ التي تظهر عدم استقرار أو انحراف في النمط الظاهري [3] . ثم تأكيد التعديل المقصود في حالة الأليل المطلوبة، سواء كانت متغايرة الزيجوت أو متماثلة الزيجوت، باستخدام NGS المستهدف للأمبليكون [9].
التوثيق ليس عملًا إداريًا في النهاية. إنه جزء من إصدار النسخة. سجل خلفية السلالة الأبوية, تصميم sgRNA، نوع النوكلياز، طريقة التوصيل، وجميع نتائج QC [3]. يجب أن تتحرك النسخة فقط عندما يتم تأكيد التعديل المقصود، وتكون المواقع المتوقعة خارج الهدف واضحة، ويكون السجل الكامل في مكانه.
تحرير الجينوم باستخدام CRISPR: كيفية تقليل التأثيرات خارج الهدف بشكل فعال
الخاتمة: قائمة تحقق من ثلاث مراحل لتحرير خطوط الخلايا بشكل أنظف
بشكل عام، تتعامل قائمة التحقق مع التحكم في خارج الهدف كعملية مرحلية، وليس كفحص QC لمرة واحدة. الهدف بسيط: تقليل المخاطر مبكرًا، تحديد نشاط المحرر، ثم التحقق من النتيجة.
يجب أن يتوافق عمق التحقق مع المخاطر. قم بإصدار فقط النسخ المستقلة المتعددة المؤكدة في حالة الأليل المقصودة.
الأسئلة الشائعة
لماذا لا نعتمد على نسخة واحدة؟
الاعتماد على نسخة واحدة محفوف بالمخاطر. تحرير CRISPR ليس دقيقًا تمامًا, لذلك يمكن أن يُدخل طفرات غير مقصودة خارج الهدف.
لهذا السبب تقوم الفرق عادةً بتوسيع مجموعات استنساخ متعددة. القيام بذلك يجعل من الأسهل العثور على خط يحمل التعديل المستهدف دون تغييرات ضارة خارج الهدف.
هناك سبب آخر أيضًا: يمكن أن تظهر خطوط الخلايا تباينًا جينيًا. يساعد تسلسل النسخ المتعددة في تأكيد أن الضربة القاضية المتجانسة أو تعديل موقع الهدف الآخر موجود عبر المواقع المستهدفة.
متى يكون تسلسل الجيل التالي القائم على الأمبليكون كافياً؟
غالباً ما يكون تسلسل الجيل التالي القائم على الأمبليكون كافياً عندما تحتاج إلى طريقة مستهدفة وفعالة من حيث التكلفة لتأكيد المواقع المحتملة خارج الهدف التي تم تحديدها بواسطة الأدوات الحاسوبية أو طرق الفحص الأخرى.
لا يزال تسلسل الجينوم الكامل هو الطريقة الوحيدة لقياس التأثيرات خارج الهدف بشكل كامل. ولكن بالنسبة للعديد من التطبيقات، لا تكون تلك الدرجة من التحليل ضرورية.
كيف أختار المحرر الأكثر أماناً؟
اختر أقل متغير نوكلياز CRISPR نشاطاً الذي لا يزال يقطع موقع الهدف بشكل جيد.
لا يمكنك اختيار أفضل متغير من التنبؤ وحده. الطريقة الموثوقة الوحيدة هي إجراء فحص صغير عبر متغيرات النوكلياز المختارة وقراءة التحرير باستخدام تسلسل الجيل التالي.
بالنسبة لأبحاث اللحوم المزروعة R&D، يمنحك ذلك مسارًا عمليًا للمضي قدمًا: ابدأ بقائمة قصيرة من المتغيرات، ثم اختبر الأضعف منها خطوة بخطوة حتى تجد الخيار الأقل نشاطًا الذي لا يزال يحرر الموقع المستهدف بكفاءة .
