หากการบำรุงรักษา PSC กำลังเบี่ยงเบน สื่อกลางมักเป็นส่วนหนึ่งของปัญหา สำหรับวิศวกรกระบวนการชีวภาพ นักวิทยาศาสตร์เพาะเลี้ยงเซลล์ และทีมวิจัยและพัฒนาเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง คำตอบสั้น ๆ คือ: รักษาระบบการบำรุงรักษาให้ชัดเจน รักษาเวลาการให้อาหารให้คงที่ และตรวจสอบความสามารถในการเปลี่ยนแปลงและความเสถียรตามตาราง QC ที่กำหนดไว้&
ฉันจะสรุปบทความนี้เป็นสี่ประเด็น:
- การกำหนดหมายถึงมากกว่าการปราศจากเซรั่ม ในการเพาะเลี้ยง PSC การกำหนดทางเคมี, ปราศจากแหล่งกำเนิดจากต่างประเทศ, ปราศจากฟีดเดอร์, และ ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ แต่ละอย่างจะขจัดแหล่งที่มาของความแปรปรวนที่แตกต่างกันออกไป
- การตั้งค่าหลักนั้นง่าย: ฐาน DMEM/F-12 การสนับสนุน ITS และการเลือกที่ชัดเจนระหว่างสื่อที่มี อัลบูมิน และสื่อที่ ปราศจากอัลบูมิน
- ระบบที่ปราศจากอัลบูมินสามารถให้การควบคุมที่สะอาดกว่า, แต่มีความยืดหยุ่นน้อยกว่าและมักต้องการความใส่ใจที่เข้มงวดขึ้นในเรื่องของเวลาในการให้อาหาร, ไขมัน, และความเสถียรของปัจจัยการเจริญเติบโต.
- คุณภาพการบำรุงรักษาไม่ได้รับการยืนยันจากตัวบ่งชี้เพียงตัวเดียว. ฉันจะติดตาม OCT4, SOX2, NANOG, ลักษณะอาณานิคม, เวลาการเพิ่มจำนวน, และคาริโอไทป์ ร่วมกันก่อนที่จะย้ายเซลล์เข้าสู่การแยกแยะ.
ตัวเลขบางตัวทำให้กระบวนการชัดเจนขึ้น ในการขยายขนาด, วัฒนธรรมแบบการไหลเวียนอาจแลกเปลี่ยน 30–50% ของปริมาตรวัฒนธรรมต่อวัน และกรณีเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงที่อ้างถึงรายงาน 80 ล้านเซลล์/มล. ใน 9 วัน ภายใต้ สภาวะที่ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์. ตัวเลขเหล่านี้ไม่ได้หมายความว่ากระบวนการ PSC ทุกกระบวนการจะทำงานในลักษณะเดียวกัน พวกเขาแสดงให้เห็นว่าการกำหนดสื่อและการควบคุมกระบวนการต้องทำงานร่วมกัน.
วิธีการดูแลและประเมินลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ต้นกำเนิดพลูริโพเทนต์ของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงใน mTeSR™ Plus
sbb-itb-ffee270
การเปรียบเทียบอย่างรวดเร็ว
| พื้นที่ | สิ่งที่ต้องเฝ้าดู |
|---|---|
| เบสัลมีเดียม | DMEM/F-12 กำหนดมาตรฐานสารอาหารและการบัฟเฟอร์ |
| การสนับสนุนขั้นต่ำที่ปราศจากเซรั่ม | อินซูลิน, ทรานสเฟอร์ริน, ซีลีเนียม (ITS) |
| มีเดียที่มีอัลบูมิน | มีการบัฟเฟอร์มากขึ้นต่อความเครียดของกระบวนการ แต่มีความแปรปรวนของแบทช์มากขึ้น |
| มีเดียที่ไม่มีอัลบูมิน | ความซับซ้อนของสูตรต่ำกว่า แต่ต้องการการควบคุมการเพาะเลี้ยงที่เข้มงวดขึ้น |
| อินพุตที่ติดตาม | การจัดการเหล็ก, ซีลีเนียม, ความสม่ำเสมอของล็อตไขมัน |
| ปัจจัยที่สร้างใหม่ | FGF2 และ TGF-β ต้นทุน, ความเสถียร, และความสม่ำเสมอของสัญญาณ |
| การควบคุมรายวัน | ตารางการให้อาหาร, แลคเตท, แอมโมเนีย, ความหนาแน่น, เวลาการเพิ่มจำนวน |
| การตรวจสอบก่อนการแยก | OCT4, SOX2, NANOG, ลักษณะทางสัณฐานวิทยา, คาริโอไทป์ |
ดังนั้นหากคุณกำลังตั้งค่าการดูแล PSC สำหรับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง ฉันจะแนะนำให้พิจารณามีเดียมเป็นตัวแปรของกระบวนการ ไม่ใช่แค่รายการสารเคมีเท่านั้น ล็อคองค์ประกอบ, ล็อค แผนการให้อาหาร, และล็อคการอ่านค่า.
การออกแบบสื่อหลัก: สื่อพื้นฐาน, ระบบ ITS และกลยุทธ์อัลบูมิน
สื่อ PSC ที่มีอัลบูมินเทียบกับไม่มีอัลบูมิน: ความแตกต่างที่สำคัญ
การเลือกสื่อพื้นฐานและจุดควบคุมของมัน
เมื่อ กำหนด ได้ถูกตั้งค่าแล้ว, การตัดสินใจออกแบบครั้งแรกคือสื่อพื้นฐาน. DMEM/F-12 เป็นสื่อพื้นฐานทั่วไปสำหรับการบำรุงรักษา PSC. มันตั้งค่าพื้นฐานของสารอาหาร, วิตามิน, และการบัฟเฟอร์, ซึ่งส่งผลต่อการเจริญเติบโตและความเข้มข้นของสารละลาย [8].
อินซูลิน, ทรานสเฟอร์ริน และซีลีเนียมเป็นระบบสนับสนุนขั้นต่ำ
หลังจากเลือกเบสัลมีเดียแล้ว, ระบบ ITS - อินซูลิน, ทรานสเฟอร์ริน, และซีลีเนียม - จะกลายเป็นแพ็คเกจสนับสนุนขั้นต่ำที่ทำให้เซลล์มีชีวิตและเพิ่มจำนวนได้โดยไม่ต้องใช้เซรั่ม [8][3].
แต่ละส่วนมีหน้าที่ต่างกัน อินซูลิน สนับสนุนการเผาผลาญและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ ทรานสเฟอร์ริน จัดการการขนส่งและการส่งเหล็กเข้าสู่เซลล์ ซีลีเนียม สนับสนุนการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ [3][8].
สูตรที่ไม่มีอัลบูมินเทียบกับสูตรที่มีอัลบูมิน
การแบ่งหลักระหว่างประเภทมีเดียคือกลยุทธ์อัลบูมิน มีเดียที่มีอัลบูมิน ใช้อัลบูมินเพื่อสนับสนุนความมีชีวิต, การขนส่งไขมัน, และความทนทานต่อความเครียด [3]. สูตรที่ไม่มีอัลบูมิน, Essential 8 (E8) ชนิดจะกำจัดโปรตีนที่ซับซ้อนเช่นอัลบูมินเพื่อปรับปรุงความสม่ำเสมอระหว่างล็อตและทำให้การอ่านค่าทางวิเคราะห์ง่ายต่อการตีความ แต่โดยปกติแล้วจะต้องการการควบคุมกระบวนการที่เข้มงวดขึ้น [4][1].
ตารางด้านล่างสรุปความแตกต่างในทางปฏิบัติระหว่างสองวิธี:
| คุณสมบัติ | มีอัลบูมิน (e.g. , ชนิด mTeSR1) | ไม่มีอัลบูมิน (e.g. , E8-type) |
|---|---|---|
| ความสม่ำเสมอ | ต่ำกว่า; อัลบูมินที่มาจากสัตว์ทำให้เกิดความแปรปรวนในแต่ละชุด [3] | สูงกว่า; ส่วนประกอบที่กำหนดทางเคมีช่วยปรับปรุงความสามารถในการทำซ้ำ [4] |
| ความทนทานต่อความเครียด | สูงกว่า; อัลบูมินสนับสนุนความมีชีวิตและป้องกันความเครียด [3] | ต่ำกว่า; เซลล์มีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงของสื่อและกระบวนการมากขึ้น [4] |
| ความชัดเจนของการอ่านค่า | ต่ำกว่า; โปรตีนที่ซับซ้อนสามารถรบกวนการอ่านค่าการเผาผลาญ | สูงกว่า; องค์ประกอบที่เรียบง่ายสนับสนุนการอ่านค่าที่แม่นยำยิ่งขึ้น |
| ความไวของกระบวนการ | ต่ำกว่า; อัลบูมินช่วยบัฟเฟอร์ต่อความแปรปรวนของกระบวนการ [3] | สูงกว่า; ต้องการการควบคุมการให้อาหารและสิ่งแวดล้อมที่เข้มงวดขึ้น [4] |
| การสนับสนุนไขมัน | อัลบูมินให้การขนส่งไขมันและความทนทาน [3] | ต้องการตัวพาไขมันที่กำหนดหรือสารทดแทนสังเคราะห์เพื่อรักษาความทนทาน [1] |
ในกระบวนการทำเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง หลายทีมตอนนี้ชอบ สูตรที่ปราศจากอัลบูมินและกำหนดทางเคมี [4][1]. ในการปฏิบัติจริง นั่นหมายถึงการสร้างเซลล์ไลน์ในสื่อที่ปราศจากอัลบูมินตั้งแต่เริ่มต้นแทนที่จะพยายามเปลี่ยนในภายหลัง การเปลี่ยนแปลงนั้นอาจเจ็บปวดหากเซลล์ถูกทำให้เสถียรในระบบที่มีอัลบูมินก่อน
เมื่ออัลบูมินถูกนำออก สูตรจะต้องมีตัวพาไขมันที่กำหนดหรือสารทดแทนสังเคราะห์เพื่อรักษาความแข็งแกร่ง [1][3]. นั่นทำให้ระบบที่ปราศจากอัลบูมินมีเส้นทางที่สะอาดขึ้นไปสู่ความสม่ำเสมอจากล็อตถึงล็อต สำหรับงานเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง มันยังทำให้การถ่ายโอนขนาดง่ายต่อการตรวจสอบและทำซ้ำ
หลังจากที่ฐานหลักถูกกำหนด จุดควบคุมถัดไปคือธาตุที่มีปริมาณน้อย ไขมัน และไซโตไคน์ที่สร้างขึ้นใหม่ ซึ่งสามารถปรับแต่งได้โดยใช้ ชุดการเพิ่มประสิทธิภาพสื่อที่ปราศจากเซรั่ม.
การปรับแต่งความสามารถในการพัฒนา: ธาตุรอง, ไขมัน และไซโตไคน์ที่สร้างขึ้นใหม่
ธาตุรองและการเสริมไขมัน
เมื่ออัลบูมินถูกนำออกไป การป้อนข้อมูลขนาดเล็กในสื่อจะหยุดเป็นเสียงพื้นหลังและเริ่มทำหน้าที่เหมือนปุ่มควบคุมโดยตรง ใน สื่อ PSC ที่กำหนด, แม้แต่การเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในส่วนประกอบธาตุรองก็สามารถผลักดันเซลล์ออกจากสถานะการบำรุงรักษาที่เสถียรได้
การจัดหาเหล็กเป็นหนึ่งในตัวอย่างที่ชัดเจนที่สุด ความมีชีวิตและการต่ออายุของ PSC ขึ้นอยู่กับมัน ในระบบที่กำหนด ทรานส์เฟอร์รินสามารถถูกแทนที่ด้วยโมเลกุลขนาดเล็กที่มีความเสถียรทางเคมี เช่น ฮิโนคิทอล ซึ่งช่วยลดความแปรปรวนระหว่างชุด [3].
ไขมันต้องการการดูแลในระดับเดียวกัน หากการเสริมไขมันเปลี่ยนจากล็อตหนึ่งไปยังอีกล็อตหนึ่ง โปรไฟล์กรดไขมันภายในเซลล์ก็สามารถเปลี่ยนได้เช่นกัน [6].
FGF2, TGF-β และปัจจัยรีคอมบิแนนท์ที่เกี่ยวข้อง
หลังจากธาตุอาหารรอง ไซโตไคน์รีคอมบิแนนท์ ทำหน้าที่หลักในสัญญาณความสามารถในการคงสภาพของเซลล์ต้นกำเนิด FGF2 และ TGF-β อยู่ที่ศูนย์กลางของเครือข่ายนั้น ซึ่งเป็นเหตุผลที่สื่อที่กำหนดต้องพึ่งพาการจัดหาจากรีคอมบิแนนท์ [7]. ปัญหาคือสิ่งเหล่านี้เป็นส่วนที่มีราคาแพงที่สุดและไม่เสถียรที่สุดในสูตร [1].
ปัจจัยการเจริญเติบโตที่ออกแบบให้คงตัวที่อุณหภูมิช่วยแก้ปัญหานั้นโดยตรง พวกเขาช่วยให้สัญญาณคงที่มากขึ้นในระหว่างการเพาะเลี้ยงที่ยาวนาน [1].
การใช้งานสื่อที่กำหนดในแต่ละวัน: ตารางการให้อาหารและการอ่านคุณภาพ
เมื่อสูตรถูกกำหนดแล้ว งานต่อไปคือการรักษาให้คงที่จากการให้อาหารครั้งหนึ่งไปยังครั้งถัดไป
การให้อาหารประจำวัน, รูปแบบข้ามวัน และ การปรับตัวของไบโอรีแอคเตอร์
สูตรที่ดีจะทำงานได้ก็ต่อเมื่อแผนการให้อาหารเคารพต่อสูตรนั้น ในกระบวนการผลิตเนื้อสัตว์เพาะเลี้ยงในระดับอุตสาหกรรม, โมเดลแบบต่อเนื่องสามารถเคลื่อนย้าย 30–50% ของวัฒนธรรมในแต่ละวันเพื่อรักษาการเติบโตให้คงที่ [5].
เมื่อวัฒนธรรมเริ่มตั้งตัว, อัตราการให้อาหารสามารถลดลงได้, แต่เฉพาะเมื่อการบริโภคสารอาหาร, ภาระเมตาบอไลต์ และเวลาการเพิ่มจำนวนยังคงเสถียร นั่นคือเหตุผลที่กลยุทธ์การให้อาหารและการตรวจสอบกระบวนการต้องอ่านร่วมกัน, ไม่ใช่แยกกัน ติดตามแลคเตทและแอมโมเนียควบคู่ไปกับตัวบ่งชี้ความสามารถในการเปลี่ยนแปลง
การอ่านคุณภาพที่ยืนยันคุณภาพการบำรุงรักษา
ใช้ตารางเวลาคงที่เพื่อติดตาม OCT4, SOX2 และ NANOG, ลักษณะทางสัณฐาน, เวลาการเพิ่มจำนวน และคาริโอไทป์ OCT4, SOX2 และ NANOG ควรใช้เป็นชุดประจำ, ไม่ใช่การอ่านเดี่ยว
ลักษณะทางสัณฐานวิทยาทำงานได้ดีในฐานะการตรวจสอบอย่างรวดเร็วสำหรับสุขภาพของโคโลนีและการสูญเสียความสามารถในการเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ชนิดอื่นในระยะแรก เวลาการเพิ่มจำนวนและความหนาแน่นของเซลล์เชื่อมโยงกลยุทธ์การให้อาหารกลับไปยังความเสถียรของการเพาะเลี้ยง หากเวลาการเพิ่มจำนวนเริ่มช้าลง นั่นอาจบ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ชนิดอื่นเองหรือการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในระยะแรก [5]. การตรวจสอบคาริโอไทป์ในช่วงเวลาที่กำหนดยังคงมีความสำคัญในการยืนยันความเสถียรในระยะยาว
เมื่อรวมกันแล้ว การอ่านค่าเหล่านี้จะให้กรอบการยอมรับที่ใช้งานได้จริง:
- ลักษณะทางสัณฐานวิทยาเป็นประจำ
- เวลาการเพิ่มจำนวนจากการผ่านแต่ละครั้ง
- คาริโอไทป์ในจังหวะที่กำหนด
หากสูตรอาหารหรือล็อตมีการเปลี่ยนแปลง ให้ตรวจสอบแผงเครื่องหมายทั้งหมดอีกครั้งก่อนที่กระบวนการจะดำเนินต่อไป
การใช้การบำรุงรักษา PSC ที่กำหนดไว้กับกระบวนการผลิตเนื้อสัตว์เพาะเลี้ยง
ตำแหน่งของสื่อบำรุงรักษาในกระบวนการผลิตเนื้อสัตว์เพาะเลี้ยง
เมื่อสูตรถูกกำหนดแล้ว งานถัดไปจะง่ายในทางทฤษฎีแต่เข้มงวดในทางปฏิบัติ: ใช้มันเป็นการส่งต่อที่ควบคุมไปสู่การแยกแยะ
สื่อบำรุงรักษา PSC ที่กำหนดไว้มีบทบาทที่แคบ พวกเขาสร้างประชากรเริ่มต้นที่มีคุณภาพสูงก่อนที่เซลล์จะเคลื่อนเข้าสู่การแยกแยะเฉพาะสายพันธุ์ การแยกแยะนั้นสำคัญ หากการบำรุงรักษาและการแยกแยะถูกผสมกัน ความไม่เสถียรอาจแทรกซึมและกลายเป็นเรื่องยากที่จะติดตามในภายหลัง
ในทางปฏิบัติ การขยายตัวดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่ควบคุมอย่างเข้มงวด ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ จนกว่าวัฒนธรรมจะตรงตามแผง QC การบำรุงรักษาที่กำหนดไว้รายงานเดือนพฤศจิกายน 2024 ของ SuperMeat เป็นตัวอย่างที่ดี: สายเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนของมันถึง 80 ล้านเซลล์/มล. ในเก้าวัน ภายใต้สูตรสื่อที่ควบคุมอย่างเต็มที่และปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ [5]. กล่าวอีกนัยหนึ่ง ขั้นตอนการบำรุงรักษาเป็นจุดควบคุมหลักสำหรับการทำซ้ำในกระบวนการต่อเนื่อง
สื่อที่ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ยังสนับสนุนการประกันคุณภาพ การวางแผนด้านกฎระเบียบ และการถ่ายทอดเทคโนโลยี [4][2]. Aleph Farms ได้แสดงให้เห็นในกรณีศึกษาข้ามบริษัทที่มีประโยชน์ สื่อการเจริญเติบโตที่เป็นกรรมสิทธิ์ของมันซึ่งปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ได้เพาะเลี้ยงสายเซลล์โคที่พัฒนาภายนอกโดย
การจัดหาชิ้นส่วนสื่อและข้อมูลที่มีคุณภาพผ่าน Cellbase
เมื่อกำหนดข้อมูลแล้ว การจัดซื้อจะไม่ใช่เพียงงานหลังบ้านอีกต่อไป แต่จะกลายเป็นส่วนหนึ่งของ การควบคุมกระบวนการ.
บทสรุป: ขั้นตอนสำคัญสู่การบำรุงรักษา pluripotent ที่เสถียร
การบำรุงรักษา PSC ที่กำหนดจะทำงานได้เฉพาะเมื่อ สูตร, เวลาให้อาหาร, และการอ่าน QC คงที่ตลอดการผ่าน.
คำถามที่พบบ่อย
ฉันจะรู้ได้อย่างไรว่าสื่อ PSC ของฉันถูกกำหนดจริงหรือไม่?
สื่อเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent ที่กำหนดจะไม่มี ส่วนประกอบที่มาจากสัตว์ เช่น เซรั่มจากเลือดวัวในครรภ์ เซรั่มเป็นส่วนผสมที่ซับซ้อน, แปรผัน, และไม่กำหนด ซึ่งทำให้การควบคุมกระบวนการยากขึ้น.
ในสื่อที่กำหนดไว้ ส่วนประกอบทุกอย่างจะถูกทราบและเพิ่มในความเข้มข้นที่กำหนด ซึ่งรวมถึงเกลือพื้นฐาน กรดอะมิโน วิตามิน กลูโคส และไซโตไคน์หรือปัจจัยการเจริญเติบโตที่สร้างขึ้น ผลลัพธ์คือประสิทธิภาพของสื่อที่สม่ำเสมอมากขึ้นและคุณภาพของเซลล์ที่เสถียรมากขึ้น
เมื่อใดที่ฉันควรเลือกใช้สื่อที่ไม่มีอัลบูมินแทนที่จะเป็นสื่อที่มีอัลบูมิน?
เลือก สื่อที่ไม่มีอัลบูมิน เมื่อเป้าหมายหลักคือการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงที่คุ้มค่าและสามารถขยายขนาดได้
การนำอัลบูมินและโปรตีนที่มาจากสัตว์อื่น ๆ ออกสามารถลดต้นทุนสื่อหลัก ปรับปรุงความสม่ำเสมอระหว่างล็อตโดยลดปัจจัยทางชีวภาพที่แปรผัน และสนับสนุนการเปลี่ยนไปสู่สูตรที่กำหนดทางเคมีที่ปราศจากสัตว์อย่างสมบูรณ์เพื่อการผลิตที่สามารถทำซ้ำได้ในระดับการค้า
ฉันควรตรวจสอบความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดและความเสถียรทางพันธุกรรมบ่อยแค่ไหน?
ข้อความที่ให้มาไม่ได้ระบุว่าควรตรวจสอบความสามารถในการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดหรือความเสถียรทางพันธุกรรมบ่อยแค่ไหน
ในการทำงานในห้องปฏิบัติการประจำวัน การดูแลรักษาเซลล์ต้นกำเนิดชนิด pluripotent มักจะรวมถึงการตรวจสอบการแสดงออกของเครื่องหมายและความสมบูรณ์ของจีโนมตามปกติ ตารางเวลาที่แน่นอนขึ้นอยู่กับสายเซลล์ ประวัติการผ่าน ตัวกลาง เวิร์กโฟลว์การจัดการ และระดับความเสี่ยงที่ทีมยินดีรับก่อนที่จะย้ายเซลล์ไปยังงานขั้นต่อไป
สำหรับทีมเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง สิ่งนี้มีความสำคัญด้วยเหตุผลที่ง่าย: สายเซลล์อาจดูดีในวัฒนธรรมและยังคงเปลี่ยนแปลงไปตามกาลเวลา การตรวจสอบเป็นประจำช่วยจับการสูญเสียความสามารถในการเป็น pluripotent การเปลี่ยนแปลงของคาริโอไทป์ การเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนา หรือการเปลี่ยนแปลงอื่น ๆ ก่อนที่มันจะส่งผลต่อประสิทธิภาพการแยกแยะ พฤติกรรมการเจริญเติบโต หรือคุณภาพของข้อมูล
