Nếu việc bảo trì PSC đang trôi dạt, thì môi trường thường là một phần của vấn đề. Đối với các kỹ sư quy trình sinh học, các nhà khoa học nuôi cấy tế bào và các nhóm R&D thịt nuôi cấy, câu trả lời ngắn gọn là: giữ cho hệ thống bảo trì được xác định, giữ thời gian cho ăn cố định và kiểm tra tính đa năng và ổn định theo lịch QC đã định.
Tôi sẽ tóm tắt bài viết thành bốn điểm:
- Xác định có nghĩa là nhiều hơn không có huyết thanh. Trong nuôi cấy PSC, định nghĩa hóa học, không có xeno, không có feeder, và không có thành phần động vật mỗi cái loại bỏ một nguồn biến đổi khác nhau.
- Cấu hình cốt lõi rất đơn giản: một DMEM/F-12 cơ sở, ITS hỗ trợ, và một lựa chọn rõ ràng giữa môi trường có chứa albumin và không chứa albumin .
- Các hệ thống không có albumin có thể mang lại sự kiểm soát sạch hơn, nhưng chúng ít linh hoạt hơn và thường cần chú ý chặt chẽ hơn đến thời gian cho ăn, lipid và sự ổn định của yếu tố tăng trưởng.
- Chất lượng bảo trì không được xác nhận chỉ bằng một dấu hiệu. Tôi sẽ theo dõi OCT4, SOX2, NANOG, hình thái thuộc địa, thời gian nhân đôi và kiểu nhân karyotype cùng nhau trước khi chuyển tế bào vào giai đoạn phân hóa.
Một vài con số làm rõ điểm của quy trình. Trong các thiết lập mở rộng quy mô, nuôi cấy kiểu perfusion có thể trao đổi 30–50% thể tích nuôi cấy mỗi ngày. Và một trường hợp thịt nuôi cấy được trích dẫn đã báo cáo 80 triệu tế bào/mL trong 9 ngày dưới điều kiện không có thành phần động vật. Những con số đó không có nghĩa là mọi quy trình PSC sẽ hoạt động theo cùng một cách. Chúng cho thấy rằng định nghĩa môi trường và kiểm soát quy trình phải hoạt động cùng nhau.
Cách Duy Trì và Đánh Giá Hình Thái của Tế Bào Gốc Đa Năng Người Nuôi Cấy trong mTeSR™ Plus
sbb-itb-ffee270
So sánh nhanh
| Khu vực | Điều cần chú ý |
|---|---|
| Môi trường cơ bản | DMEM/F-12 thiết lập nền tảng dinh dưỡng và đệm |
| Hỗ trợ tối thiểu không chứa huyết thanh | Insulin, transferrin, selenium (ITS) |
| Môi trường chứa albumin | Nhiều đệm hơn chống lại căng thẳng quá trình, nhưng nhiều biến đổi lô hơn |
| Môi trường không chứa albumin | Độ phức tạp công thức thấp hơn, nhưng cần kiểm soát nuôi cấy chặt chẽ hơn |
| Đầu vào vi lượng | Xử lý sắt, selenium, độ nhất quán lô lipid |
| Yếu tố tái tổ hợp | FGF2 và TGF-β chi phí, độ ổn định, và độ nhất quán tín hiệu |
| Kiểm soát hàng ngày | Lịch trình cho ăn, lactate, ammonia, mật độ, thời gian nhân đôi |
| Kiểm tra phát hành để phân biệt | OCT4, SOX2, NANOG, hình thái, kiểu nhân đồ |
Vì vậy, nếu bạn đang thiết lập bảo trì PSC cho thịt nuôi cấy, tôi sẽ coi môi trường như một biến quy trình, không chỉ là danh sách thuốc thử. Khóa thành phần, khóa kế hoạch cho ăn, và khóa các chỉ số đọc.
Thiết kế phương tiện cốt lõi: môi trường cơ bản, hệ thống ITS và chiến lược albumin
Môi trường PSC có chứa Albumin so với không chứa Albumin: Những khác biệt chính
Lựa chọn môi trường cơ bản và các điểm kiểm soát của nó
Một khi đã được xác định đã được thiết lập, quyết định thiết kế đầu tiên là môi trường cơ bản. DMEM/F-12 là môi trường cơ bản phổ biến cho việc duy trì PSC. Nó thiết lập nền tảng dinh dưỡng, vitamin và đệm, từ đó định hình sự phát triển và độ thẩm thấu [8].
Insulin, transferrin và selenium như hệ thống hỗ trợ tối thiểu
Sau khi chọn môi trường cơ bản, hệ thống ITS - insulin, transferrin và selenium - trở thành gói hỗ trợ tối thiểu giúp tế bào sống sót và phát triển mà không cần huyết thanh [8][3].
Mỗi phần có một nhiệm vụ khác nhau. Insulin hỗ trợ quá trình trao đổi chất và phát triển của tế bào. Transferrin xử lý việc vận chuyển và cung cấp sắt vào tế bào. Selenium hỗ trợ phòng thủ chống oxy hóa [3][8].
Công thức không chứa albumin so với công thức chứa albumin
Sự phân chia chính giữa các loại môi trường là chiến lược albumin. Môi trường chứa albumin sử dụng albumin để hỗ trợ khả năng sống sót, vận chuyển lipid và khả năng chịu đựng căng thẳng [3]. Không chứa Albumin, Essential 8 (E8)-loại công thức loại bỏ các protein phức tạp như albumin để cải thiện tính nhất quán giữa các lô và làm cho kết quả phân tích dễ dàng hơn để diễn giải, nhưng chúng thường cần kiểm soát quy trình chặt chẽ hơn [4][1].
Bảng dưới đây tóm tắt sự khác biệt thực tế giữa hai phương pháp:
| Tính năng | Có chứa Albumin (e.g. , loại mTeSR1) | Không chứa Albumin (e.g. , E8-type) |
|---|---|---|
| Tính nhất quán | Thấp hơn; albumin có nguồn gốc động vật giới thiệu sự biến đổi giữa các lô [3] | Cao hơn; các thành phần được xác định hóa học cải thiện khả năng tái lập [4] |
| Khả năng chịu đựng căng thẳng | Cao hơn; albumin hỗ trợ khả năng sống sót và bảo vệ chống lại căng thẳng [3] | Thấp hơn; tế bào nhạy cảm hơn với thay đổi môi trường và quy trình [4] |
| Độ rõ ràng của kết quả đọc | Thấp hơn; protein phức tạp có thể gây nhiễu kết quả đọc chuyển hóa | Cao hơn; thành phần đơn giản hỗ trợ kết quả đọc chính xác hơn |
| Độ nhạy của quy trình | Thấp hơn; albumin đệm chống lại sự biến đổi quy trình [3] | Cao hơn; cần kiểm soát chặt chẽ hơn về việc cho ăn và môi trường [4] |
| Hỗ trợ lipid | Albumin cung cấp vận chuyển lipid và độ bền [3] | Cần các chất mang lipid được xác định hoặc các chất thay thế tổng hợp để duy trì độ bền [1] |
Trong quy trình làm thịt nuôi cấy, nhiều nhóm hiện nay ưa chuộng công thức không albumin, được xác định hóa học [4][1]. Trong thực tế, điều đó thường có nghĩa là thiết lập các dòng tế bào trong môi trường không có albumin ngay từ đầu thay vì cố gắng chuyển đổi chúng sau này. Việc chuyển đổi đó có thể đau đớn nếu các tế bào ban đầu được ổn định trong một hệ thống có chứa albumin.
Khi albumin bị loại bỏ, công thức cần có các chất mang lipid được xác định hoặc các chất thay thế tổng hợp để duy trì độ bền vững [1][3]. Điều đó mang lại cho các hệ thống không có albumin một con đường sạch hơn để đạt được sự nhất quán từ lô này sang lô khác. Đối với công việc thịt nuôi cấy, nó cũng giúp việc chuyển đổi quy mô dễ dàng hơn để giám sát và tái tạo.
Sau khi cơ sở cốt lõi được cố định, các điểm kiểm soát tiếp theo là các nguyên tố vi lượng, lipid và cytokine tái tổ hợp, có thể được tinh chỉnh bằng cách sử dụng bộ tối ưu hóa môi trường không có huyết thanh.
Điều chỉnh tính đa năng: nguyên tố vi lượng, lipid và cytokine tái tổ hợp
Bổ sung nguyên tố vi lượng và lipid
Một khi albumin bị loại bỏ, các yếu tố đầu vào nhỏ của môi trường không còn là tiếng ồn nền mà bắt đầu hoạt động như các nút điều khiển trực tiếp. Trong môi trường PSC xác định, ngay cả những thay đổi nhỏ trong các thành phần vi lượng cũng có thể đẩy tế bào ra khỏi trạng thái duy trì ổn định.
Cung cấp sắt là một trong những ví dụ rõ ràng nhất. Khả năng sống sót và tự tái tạo của PSC phụ thuộc vào nó. Trong các hệ thống xác định, transferrin có thể được thay thế bằng các phân tử nhỏ ổn định hóa học như hinokitiol, giúp giảm sự biến đổi giữa các lô [3].
Lipid cần được chăm sóc ở mức độ tương tự. Nếu bổ sung lipid thay đổi từ lô này sang lô khác, hồ sơ axit béo bên trong tế bào cũng có thể thay đổi [6].
FGF2, TGF-β và các yếu tố tái tổ hợp liên quan
Sau các nguyên tố vi lượng, cytokine tái tổ hợp thực hiện phần lớn công việc nặng nhọc trong tín hiệu đa năng. FGF2 và TGF-β nằm ở trung tâm của mạng lưới đó, đó là lý do tại sao môi trường xác định dựa vào nguồn cung cấp tái tổ hợp [7]. Vấn đề đơn giản: các yếu tố này cũng nằm trong số các phần đắt nhất và ít ổn định nhất của công thức [1].
Các yếu tố tăng trưởng được thiết kế ổn định nhiệt độ giải quyết vấn đề đó trực tiếp. Chúng giúp giữ cho tín hiệu nhất quán hơn trong suốt các lần nuôi cấy dài [1].
Vận hành môi trường xác định hàng ngày: lịch trình cho ăn và kết quả chất lượng
Một khi công thức đã được cố định, công việc tiếp theo là giữ cho nó ổn định từ lần cho ăn này đến lần cho ăn tiếp theo.
Thức ăn hàng ngày, định dạng bỏ qua ngày và thích ứng bioreactor
Một công thức tốt chỉ hoạt động nếu kế hoạch cho ăn tôn trọng nó. Trong các quy trình sản xuất thịt nuôi cấy quy mô công nghiệp, một mô hình liên tục có thể di chuyển 30–50% của nền văn hóa mỗi ngày để giữ cho sự phát triển ổn định [5].
Khi các nền văn hóa ổn định, tốc độ cho ăn có thể được cắt giảm, nhưng chỉ khi tiêu thụ chất dinh dưỡng, tải trọng chất chuyển hóa và thời gian nhân đôi vẫn ổn định. Đó là lý do tại sao chiến lược cho ăn và giám sát quy trình phải được đọc cùng nhau, không phải riêng lẻ. Theo dõi lactate và ammonia cùng với các dấu hiệu đa năng.
Các chỉ số chất lượng xác nhận chất lượng bảo trì
Sử dụng lịch trình cố định để theo dõi OCT4, SOX2 và NANOG, hình thái, thời gian nhân đôi và kiểu nhân. OCT4, SOX2 và NANOG nên được sử dụng như một bảng điều khiển thường xuyên, không phải là các chỉ số độc lập.
Hình thái học hoạt động tốt như một phương pháp sàng lọc nhanh cho sức khỏe của thuộc địa và sự mất đi sớm của tính đa năng. Thời gian nhân đôi và mật độ tế bào liên kết chiến lược cho ăn với sự ổn định của văn hóa. Nếu thời gian nhân đôi bắt đầu chậm lại, điều đó có thể chỉ ra sự phân hóa tự phát hoặc sự trôi dạt di truyền sớm [5]. Kiểm tra kiểu nhân ở các khoảng thời gian cố định vẫn quan trọng để xác nhận sự ổn định lâu dài.
Kết hợp lại, những chỉ số này cung cấp cho bạn một khung chấp nhận thực tế:
- hình thái học thường xuyên
- thời gian nhân đôi từ lần chuyển tiếp này sang lần chuyển tiếp khác
- kiểu nhân theo nhịp độ xác định
Nếu một công thức hoặc lô phương tiện thay đổi, hãy kiểm tra lại toàn bộ bảng chỉ thị trước khi quy trình tiếp tục.
Áp dụng bảo trì PSC đã xác định cho quy trình làm thịt nuôi cấy
Nơi mà môi trường bảo trì phù hợp trong quy trình làm thịt nuôi cấy
Một khi công thức đã được thiết lập, công việc tiếp theo đơn giản về lý thuyết nhưng nghiêm ngặt trong thực tế: sử dụng nó như một bước chuyển giao có kiểm soát vào giai đoạn phân hóa.
Môi trường bảo trì PSC đã xác định có vai trò hẹp. Chúng xây dựng một quần thể khởi đầu chất lượng cao trước khi các tế bào chuyển sang phân hóa theo dòng dõi cụ thể. Sự tách biệt đó rất quan trọng. Nếu bảo trì và phân hóa được pha trộn với nhau, sự không ổn định có thể len lỏi vào và trở nên rất khó truy tìm sau này.
Trong thực tế, sự mở rộng diễn ra dưới các điều kiện kiểm soát chặt chẽ, không có thành phần động vật cho đến khi văn hóa đạt đến bảng QC bảo trì đã đặt ra. Báo cáo tháng 11 năm 2024 của SuperMeat là một ví dụ điển hình: dòng tế bào gốc phôi của nó đã đạt 80 triệu tế bào/mL trong chín ngày dưới một công thức môi trường không có thành phần động vật được kiểm soát hoàn toàn [5]. Nói cách khác, giai đoạn duy trì là điểm kiểm soát chính cho khả năng tái tạo ở hạ nguồn.
Môi trường không có thành phần động vật cũng hỗ trợ đảm bảo chất lượng, lập kế hoạch quy định và chuyển giao công nghệ [4][2]. Aleph Farms đã chứng minh điều này trong một trường hợp hữu ích giữa các công ty. Môi trường tăng trưởng không có thành phần động vật độc quyền của họ đã nuôi cấy các dòng tế bào bò được phát triển bên ngoài bởi
Thu mua các thành phần phương tiện truyền thông và đầu vào đủ tiêu chuẩn thông qua Cellbase
Một khi các đầu vào được xác định, việc mua sắm không còn là một nhiệm vụ hậu trường mà trở thành một phần của kiểm soát quy trình.
Kết luận: các bước quan trọng để duy trì trạng thái đa năng ổn định
Duy trì PSC được xác định chỉ hoạt động khi công thức, thời gian cho ăn và kết quả QC được giữ cố định qua các lần chuyển.
Câu hỏi thường gặp
Làm thế nào để tôi biết liệu môi trường PSC của tôi có thực sự được xác định không?
Một môi trường tế bào gốc đa năng được xác định không chứa các thành phần có nguồn gốc từ động vật như huyết thanh bò thai. Huyết thanh là một hỗn hợp phức tạp, biến đổi, không xác định, làm cho việc kiểm soát quy trình trở nên khó khăn hơn.
Trong một môi trường xác định, mọi thành phần đều được biết và thêm vào với một nồng độ nhất định. Điều đó bao gồm muối cơ bản, axit amin, vitamin, glucose, và cytokine tái tổ hợp hoặc yếu tố tăng trưởng. Kết quả là hiệu suất môi trường ổn định hơn và chất lượng tế bào ổn định hơn.
Khi nào tôi nên chọn môi trường không chứa albumin thay vì môi trường có chứa albumin?
Chọn môi trường không chứa albumin khi mục tiêu chính là sản xuất thịt nuôi cấy có hiệu quả chi phí và có thể mở rộng.
Loại bỏ albumin và các protein có nguồn gốc từ động vật khác có thể giảm chi phí môi trường chính, cải thiện sự nhất quán giữa các lô bằng cách giảm các đầu vào sinh học biến đổi, và hỗ trợ chuyển đổi sang các công thức hoàn toàn không có nguồn gốc từ động vật, được xác định hóa học để sản xuất tái tạo ở quy mô thương mại.
Tôi nên kiểm tra tính đa năng và ổn định di truyền bao lâu một lần?
Văn bản được cung cấp không nêu rõ tần suất cần kiểm tra tính đa năng hoặc ổn định di truyền.
Trong công việc phòng thí nghiệm hàng ngày, việc duy trì tế bào gốc đa năng thường bao gồm kiểm tra định kỳ biểu hiện dấu ấn và tính toàn vẹn của bộ gen. Lịch trình chính xác phụ thuộc vào dòng tế bào, lịch sử truyền, môi trường, quy trình xử lý và mức độ rủi ro mà nhóm sẵn sàng chấp nhận trước khi chuyển tế bào vào công việc hạ nguồn.
Đối với các nhóm sản xuất thịt nuôi cấy, điều đó quan trọng vì một lý do đơn giản: một dòng có thể trông ổn trong nuôi cấy nhưng vẫn có thể thay đổi theo thời gian. Việc xác minh thường xuyên giúp phát hiện mất tính đa năng, thay đổi kiểu nhân, biến đổi số lượng bản sao, hoặc các thay đổi khác trước khi chúng ảnh hưởng đến hiệu suất phân biệt, hành vi tăng trưởng, hoặc chất lượng dữ liệu.
