Nếu bạn chỉnh sửa trước và kiểm tra sau, bạn có thể sửa một thay đổi không đúng mục tiêu vào bản sao. Tôi sẽ giữ quy trình làm việc đơn giản: chọn phương pháp chỉnh sửa có rủi ro thấp nhất, giữ thời gian tiếp xúc với trình chỉnh sửa ngắn, và sau đó kiểm tra cả các vị trí không đúng mục tiêu dự đoán và sự ổn định của bản sao trước khi phát hành.
Đối với các kỹ sư quy trình sinh học, các nhà khoa học nuôi cấy tế bào, và các đội R&D thịt nuôi cấy, điểm chính rất rõ ràng. Hệ thống CRISPR vẫn có thể cắt tại các vị trí gần giống, thường với 3–6 sai lệch được chấp nhận, và những lỗi đó có thể mang vào các bản sao tế bào đơn mở rộng. Bài viết chia kiểm soát rủi ro thành ba giai đoạn: trước khi chỉnh sửa, trong khi chỉnh sửa, và sau khi chỉnh sửa.
Đây là danh sách kiểm tra đầy đủ bằng ngôn ngữ đơn giản:
-
Chọn công cụ chỉnh sửa có rủi ro thấp nhất cho công việc
- Sử dụng chỉnh sửa cơ bản hoặc chỉnh sửa tiên tiến khi chúng có thể thực hiện chỉnh sửa mà không cần phá vỡ chuỗi kép
- Sử dụng điều chỉnh dựa trên dCas9 nếu bạn chỉ cần điều chỉnh gen
- Nếu bạn cần một nuclease, hãy bắt đầu với một biến thể Cas9 có độ chính xác cao
-
Khóa chặt vật liệu ban đầu
- Xác nhận nhận dạng dòng tế bào
- Kiểm tra mycoplasma
- Ghi lại số lần truyền qua
- Giải trình tự vị trí mục tiêu thực tế trong dòng làm việc, không chỉ là bộ gen tham chiếu
-
Sàng lọc hướng dẫn trước khi làm việc ướt
- Sử dụng công cụ dựa trên căn chỉnh và công cụ dựa trên điểm số ngoài mục tiêu cùng nhau
- Ưu tiên một hướng dẫn có hồ sơ ngoài mục tiêu sạch hơn so với một hướng dẫn chỉ có hoạt động trên mục tiêu cao hơn
- Chú ý đến độ dài hướng dẫn, 40–60% nội dung GC, và các chuỗi đồng nhất
- Giới hạn sự tiếp xúc bên trong tế bào
- Sử dụng RNP hoặc mRNA thay vì hệ thống plasmid hoặc virus nếu có thể
- Sử dụng liều hiệu quả tối thiểu
- Tránh kéo dài sự tồn tại của trình chỉnh sửa chỉ để ép kết quả chuyển nạp
- Thêm các kiểm soát bổ sung cho các trường hợp có rủi ro cao hơn
- Xem xét nickase ghép đôi
- Sử dụng hệ thống có thể kích hoạt, Cas9 tách rời, hoặc hệ thống điều khiển bằng ánh sáng khi thời gian là quan trọng
- Thêm protein chống CRISPR như một bước tắt khi cần thiết
-
Xác nhận đúng sau khi chỉnh sửa
- Xác nhận chỉnh sửa đúng mục tiêu trước tiên
- Kiểm tra mọi vị trí ngoài mục tiêu dự đoán với NGS amplicon mục tiêu
- Chuyển sang GUIDE-seq, CIRCLE-seq, CAST-seq, UDiTaS, hoặc WGS khi rủi ro dự án cao hơn
- Đối với biên tập cơ sở hoặc biên tập chính, thêm kiểm tra mức RNA khi cần thiết
-
Không phát hành một dòng đơn lẻ chỉ dựa trên trình tự
- So sánh 2–3 dòng độc lập
- Sử dụng một đối chứng cha mẹ chưa chỉnh sửa
- Loại bỏ các dòng có sự không ổn định hoặc trôi dạt kiểu hình
- Chỉ phát hành khi trạng thái chỉnh sửa, sàng lọc ngoài mục tiêu và hồ sơ đều hoàn tất
Một cách ngắn gọn để suy nghĩ về nó: thiết kế để tránh cắt ngoài mục tiêu, giao hàng để giới hạn thời gian trong tế bào, sau đó xác nhận ở mức độ mà rủi ro dự án yêu cầu. Đó là sợi chỉ xuyên suốt toàn bộ tác phẩm.
Kiểm Soát Rủi Ro Ngoài Mục Tiêu CRISPR: Danh Sách Kiểm Tra 3 Giai Đoạn cho Chỉnh Sửa Dòng Tế Bào
Danh sách kiểm tra trước khi chỉnh sửa: giảm rủi ro trước khi bắt đầu chỉnh sửa
Xác định mục tiêu chỉnh sửa và chọn phương pháp chỉnh sửa có rủi ro thấp nhất
Trước khi bạn đặt hàng một hóa chất nào, hãy làm rõ mục đích của chỉnh sửa. Một knockout, một knock-in, một thay đổi nucleotide đơn, và điều hòa phiên mã không mang cùng mức rủi ro ngoài mục tiêu. Chúng cũng không yêu cầu cùng một công cụ.
Thứ tự rủi ro tổng quát là rõ ràng. Các nuclease tạo đứt gãy kép như Cas9 và Cas12 nằm ở mức rủi ro cao nhất vì chúng có thể gây ra các xóa lớn, chuyển đoạn, và phản ứng tổn thương DNA [1] [7]. Các bộ chỉnh sửa cơ sở và bộ chỉnh sửa chính sử dụng nickases, do đó họ tránh được DSBs và giảm nguy cơ biến đổi cấu trúc [1][5]. Đối với điều chỉnh phiên mã, các bộ chỉnh sửa epigenetic như dCas9 kết hợp với các bộ điều chỉnh phiên mã để lại chuỗi DNA không thay đổi [1].
Quy tắc thực tế rất đơn giản: sử dụng phương pháp ít gây độc gen nhất mà vẫn có thể thực hiện chỉnh sửa bạn cần. Đối với các thay đổi đơn nucleotide, CBEs hoặc ABEs phù hợp hơn HDR, phương pháp này vẫn có thể giới thiệu các indels [3] [1]. Đối với các thay thế và chèn hoặc xóa nhỏ, chỉnh sửa chính thường cho thấy hoạt động ngoài mục tiêu thấp hơn so với CRISPR-Cas9 tiêu chuẩn [1]. Nếu bạn phải sử dụng một nuclease, hãy chọn một biến thể có độ chính xác cao như SpCas9-HiFi, eSpCas9, hoặc SpCas9-HF1 [1] [6].
Một khi phương pháp chỉnh sửa đã được thiết lập, hãy khóa dòng tế bào làm việc và chuỗi mục tiêu chính xác.
Xác nhận danh tính dòng tế bào, lịch sử và chuỗi locus mục tiêu
Nếu dòng tế bào bị xác định sai hoặc bị nhiễm chéo, phần còn lại của quy trình làm việc sẽ bắt đầu lung lay. Ngay cả một RNA hướng dẫn được thiết kế tốt cũng không thể cứu vãn vật liệu khởi đầu kém. Kiểm tra danh tính dòng tế bào trước khi bắt đầu bất kỳ chỉnh sửa nào. Đồng thời, xác nhận tình trạng mycoplasma và ghi lại số lần truyền hiện tại, vì các tế bào truyền cao có thể làm thay đổi sự ổn định của bộ gen và hiệu quả chỉnh sửa [1][6].
Cũng quan trọng không kém, đừng chỉ dựa vào một bộ gen tham chiếu. Sắp xếp chính xác vị trí mục tiêu trong dòng tế bào làm việc. Bước đó giúp bạn phát hiện SNPs hoặc indels có thể chặn sự liên kết của hướng dẫn hoặc tạo ra các vị trí ngoài mục tiêu mới [1] [6].
Sau đó, chuyển sang thiết kế hướng dẫn.
Chạy sàng lọc ngoài mục tiêu in silico trước khi chọn thuốc thử
Một khi vị trí mục tiêu được xác nhận, sàng lọc các RNA hướng dẫn ứng viên in silico trước khi bạn cam kết làm việc trong phòng thí nghiệm. Sử dụng cả công cụ dựa trên căn chỉnh, như Cas-OFFinder hoặc FlashFry, và công cụ dựa trên điểm số, như điểm số CFD hoặc DeepCRISPR. Nhóm đầu tiên giúp tìm các vị trí gen có sự tương đồng về trình tự. Nhóm thứ hai giúp xếp hạng các vị trí đó theo xác suất cắt dự đoán [1][5].
Khi các hướng dẫn đang được rút gọn, một hồ sơ ngoài mục tiêu sạch hơn nên vượt qua hiệu quả trên mục tiêu thô. Một hướng dẫn với 70% hiệu quả trên mục tiêu và không có dự đoán ngoài mục tiêu là một điểm khởi đầu an toàn hơn so với một hướng dẫn với 90% hiệu quả và nhiều vị trí có rủi ro cao [6]. Trong một số cài đặt, rút ngắn độ dài hướng dẫn từ 20 bp xuống 17-18 bp có thể giảm sự kiện ngoài mục tiêu lên đến 500 lần mà không mất nhiều độ chính xác trên mục tiêu [5]. Hướng tới nội dung GC từ 40% đến 60%, và tránh các chuỗi bốn hoặc nhiều hơn các cơ sở giống hệt nhau [6][5].
Tuy nhiên, sàng lọc in silico có giới hạn. Nó không tính đến trạng thái chromatin, chu kỳ tế bào, hoặc ngữ cảnh cụ thể của tế bào [1][6][4]. Hãy nghĩ về nó như một bộ lọc, không phải là bằng chứng.Nó thu hẹp phạm vi, nhưng không thay thế xác nhận thực nghiệm.
Đưa các vị trí dự đoán có rủi ro cao nhất vào kế hoạch chỉnh sửa và xác nhận.
sbb-itb-ffee270
Danh sách kiểm tra chỉnh sửa: lựa chọn trình chỉnh sửa, phân phối và phơi nhiễm
Sử dụng các trình chỉnh sửa có độ đặc hiệu cao và các RNA hướng dẫn được xếp hạng tốt
Bắt đầu với danh sách ngắn các mục tiêu ngoài dự đoán và sử dụng nó để chọn trình chỉnh sửa. Trong hầu hết các trường hợp, một biến thể SpCas9 có độ trung thực cao - SpCas9-HiFi, eSpCas9, hoặc SpCas9-HF1 - là lựa chọn mặc định tốt hơn so với SpCas9 loại hoang dã [6] [1]. SpCas9 loại hoang dã có thể chịu được ba đến năm cặp base không khớp, đặc biệt là trong vùng xa PAM, và điều đó tạo ra rủi ro ngoài mục tiêu đáng kể trong các dòng tế bào nhạy cảm [3].
Một quy tắc đơn giản giúp ích ở đây: sử dụng trình chỉnh sửa độ trung thực cao ít hoạt động nhất mà vẫn thực hiện được chỉnh sửa mong muốn.
Đối với các trình chỉnh sửa cơ bản, theo dõi các chỉnh sửa không chủ ý và các tác động ngoài mục tiêu RNA riêng biệt với rủi ro ngoài mục tiêu DNA [1] [8]. Đó là các chế độ lỗi khác nhau, và chúng cần được kiểm tra riêng biệt. Nếu bạn có thể thực hiện chỉnh sửa mà không cần phá vỡ chuỗi kép, chỉnh sửa cơ bản hoặc chỉnh sửa chính có thể phù hợp hơn trong các quy trình làm việc có rủi ro cao hơn [1][8].
Một khi trình chỉnh sửa được chọn, công việc tiếp theo là giữ thời gian của nó bên trong tế bào ngắn nhất có thể.
Giới hạn sự tồn tại của trình chỉnh sửa với việc cung cấp tạm thời và liều lượng hiệu quả tối thiểu
Sự tồn tại của trình chỉnh sửa quan trọng không kém việc lựa chọn trình chỉnh sửa.Thời gian biên tập viên hoạt động trong tế bào càng lâu, nó càng có nhiều thời gian để tác động tại các vị trí có xác suất thấp. Điều đó làm cho định dạng giao hàng trở thành một điểm kiểm soát quan trọng.
Sử dụng giao hàng tạm thời như RNPs hoặc mRNA , và tránh DNA plasmid hoặc vector virus kéo dài sự biểu hiện của biên tập viên [1] [5]. Trong thực tế, giao hàng RNP nên là mặc định [6].
Liều lượng cũng quan trọng. Nồng độ nuclease cao làm tăng khả năng cắt tại các vị trí ngoài mục tiêu có độ nhạy thấp [5]. Sử dụng liều hiệu quả tối thiểu. Nếu hiệu quả chuyển nạp kém, đừng chỉ thêm nhiều thuốc thử và hy vọng điều tốt nhất. Điều đó thường chuyển vấn đề thay vì khắc phục nó.
Thêm các biện pháp bảo vệ chính xác cho quy trình làm việc có rủi ro cao hơn
Một số quy trình làm việc cần có thêm các biện pháp bảo vệ. Điều này đặc biệt đúng với các mục tiêu gần gen sinh ung thư, gen ức chế khối u, hoặc trong dòng tế bào nhạy cảm với p53, nơi mà một sự kiện ngoài mục tiêu có thể gây ra chi phí lớn [1][6][3].
Các biện pháp bảo vệ hữu ích bao gồm:
- Nickase ghép đôi, yêu cầu hai vết cắt gần nhau. Một vết cắt ngoài mục tiêu thường được sửa chữa mà không gây đột biến, do đó rủi ro ngoài mục tiêu giảm nhiều so với thiết lập nuclease tiêu chuẩn [4][1].
- Hệ thống Cas9 có thể cảm ứng, điều khiển bằng ánh sáng, hoặc chia tách, giúp giữ hoạt động của trình chỉnh sửa trong một khoảng thời gian ngắn khi việc phân phối hiệu quả và tiếp xúc phải ngắn gọn [1].
- Protein chống CRISPR (Acr), hoạt động như một công tắc tắt. Những protein Acr tự nhiên này có thể vô hiệu hóa phức hợp CRISPR-Cas sau một khoảng thời gian xác định, cung cấp cho bạn một phanh phân tử trên hoạt động của trình chỉnh sửa [1].
Danh sách kiểm tra sau chỉnh sửa: phát hiện các sự kiện ngoài mục tiêu và xác nhận các dòng tế bào
Sàng lọc các vị trí ngoài mục tiêu dự đoán bằng cách giải trình tự có mục tiêu
Sau khi chỉnh sửa xong, xác nhận thay đổi dự định tại vị trí mục tiêu trước. Để có một lần kiểm tra nhanh đầu tiên trong các tế bào được gộp, bạn có thể sử dụng một xét nghiệm cắt ghép không khớp như T7 Endonuclease I, một tiêu hóa hạn chế, hoặc một PCR bao quanh.Chỉ cần cẩn thận với việc diễn giải: mỗi phương pháp này đều có giới hạn độ nhạy, đặc biệt đối với các chỉnh sửa hiếm hoặc biến thể đồng hợp tử [9].
Đối với xác nhận cấp độ dòng vô tính, NGS amplicon mục tiêu là tiêu chuẩn. Nó cung cấp cho bạn cái nhìn định lượng về tần số alen và có thể phát hiện các biến thể xuống đến 0,01% đến 0,1% [3] .
Giải trình tự mọi vị trí dự đoán ngoài mục tiêu với NGS amplicon mục tiêu. Đó nên là bước xác nhận mặc định.
Nâng cấp lên các xét nghiệm toàn bộ hệ gen hoặc cấu trúc khi rủi ro dự án cao hơn
Sàng lọc từng vị trí không phải lúc nào cũng đủ. Nếu trình chỉnh sửa, vị trí mục tiêu hoặc dòng tế bào gợi ý rủi ro tiềm ẩn, hãy chuyển sang các xét nghiệm có thể phát hiện các sự kiện mà bạn không dự đoán trước.
Các xét nghiệm khám phá toàn bộ hệ gen như GUIDE-seq và CIRCLE-seq không cần danh sách vị trí ngoài mục tiêu trước.GUIDE-seq có thể phát hiện các vị trí ngoài mục tiêu với tần suất indel thấp tới 0.03% [2] . CIRCLE-seq có thể xác định lên đến 94% các vị trí ngoài mục tiêu in vitro [3] . Các phương pháp này hữu ích khi bối cảnh loại tế bào có thể che giấu hoạt động ngoài mục tiêu.
Nếu bạn lo lắng về các sắp xếp lại lớn, các đọc amplicon tiêu chuẩn có thể bỏ sót vấn đề chính. Các xóa, đảo ngược và chuyển vị cần các xét nghiệm được xây dựng cho các thay đổi cấu trúc, chẳng hạn như CAST-seq và UDiTaS [1] .
Giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) là lựa chọn rộng nhất. Nó có thể phát hiện indel, biến thể cấu trúc và thay đổi số lượng bản sao trên toàn bộ bộ gen [1]. Sự đánh đổi là độ sâu và chi phí: nó thường cần 20–60× độ phủ, điều này làm cho nó không phù hợp cho việc sàng lọc định kỳ các quần thể lớn [1].
Sử dụng NGS amplicon mục tiêu cho các vị trí dự đoán. Chuyển sang các xét nghiệm toàn bộ genome hoặc cấu trúc cho các dự án có nguy cơ cao hơn. Đối với các trình chỉnh sửa base hoặc prime, thêm RNA-seq để kiểm tra các hiệu ứng ngoài mục tiêu ở mức RNA.
Chọn nhiều dòng độc lập và ghi lại tiêu chí phát hành
Sau khi kiểm tra trình tự, kiểm tra kiểu hình trong nhiều hơn một dòng.
Không tiến hành với một dòng đã chỉnh sửa duy nhất. Cô lập và mở rộng ít nhất hai đến ba quần thể dòng độc lập và so sánh chúng với một đối chứng cha mẹ chưa chỉnh sửa [4][9] . Loại bỏ các dòng cho thấy sự không ổn định hoặc trôi dạt kiểu hình [3]. Sau đó xác nhận chỉnh sửa dự định tại trạng thái allele yêu cầu, dù là dị hợp tử hay đồng hợp tử, bằng cách sử dụng NGS amplicon mục tiêu [9].
Tài liệu không phải là công việc quản trị cuối cùng. Nó là một phần của việc phát hành dòng nhân bản. Ghi lại nền tảng dòng cha mẹ, thiết kế sgRNA, biến thể nuclease, phương pháp chuyển giao, và tất cả kết quả QC [3]. Một dòng nhân bản chỉ nên tiến hành khi chỉnh sửa dự định được xác nhận, các vị trí ngoài mục tiêu dự đoán rõ ràng, và hồ sơ đầy đủ đã có.
Chỉnh sửa Genome với CRISPR: Làm thế nào để giảm thiểu hiệu quả các hiệu ứng ngoài mục tiêu
Kết luận: danh sách kiểm tra ba giai đoạn cho các chỉnh sửa dòng tế bào sạch hơn
Tổng hợp lại, danh sách kiểm tra coi việc kiểm soát ngoài mục tiêu như một quy trình theo giai đoạn, không phải là một kiểm tra QC một lần. Mục tiêu rất đơn giản: giảm rủi ro sớm, giới hạn hoạt động của trình chỉnh sửa, sau đó xác minh kết quả.
Độ sâu xác nhận nên phù hợp với rủi ro. Chỉ phát hành các bản sao độc lập đã được xác nhận ở trạng thái alen dự định.
Câu hỏi thường gặp
Tại sao không dựa vào một bản sao?
Dựa vào một bản sao duy nhất là rủi ro. Chỉnh sửa CRISPR không hoàn toàn cụ thể, nên có thể giới thiệu các đột biến ngoài mục tiêu không mong muốn.
Đó là lý do tại sao các nhóm thường mở rộng nhiều quần thể bản sao. Làm điều này giúp dễ dàng tìm thấy một dòng mang chỉnh sửa mục tiêu mà không có thay đổi ngoài mục tiêu có hại.
Còn một lý do khác nữa: các dòng tế bào có thể cho thấy sự không đồng nhất về di truyền. Giải trình tự nhiều bản sao giúp xác nhận rằng knockout đồng hợp tử hoặc sửa đổi vị trí mục tiêu khác có mặt trên các loci mục tiêu.
Khi nào thì NGS amplicon là đủ?
Phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo dựa trên amplicon thường đủ khi bạn cần một cách nhắm mục tiêu và tiết kiệm chi phí để xác nhận các vị trí ngoài mục tiêu tiềm năng được đánh dấu bởi các công cụ tính toán hoặc các phương pháp sàng lọc khác.
Giải trình tự toàn bộ bộ gen vẫn là cách duy nhất để định lượng đầy đủ các hiệu ứng ngoài mục tiêu. Nhưng đối với nhiều ứng dụng, mức độ phân tích đó không cần thiết.
Làm thế nào để tôi chọn trình chỉnh sửa an toàn nhất?
Chọn biến thể CRISPR nuclease ít hoạt động nhất mà vẫn cắt tốt vị trí mục tiêu của bạn.
Bạn không thể chọn biến thể tốt nhất chỉ từ dự đoán. Cách đáng tin cậy duy nhất là thực hiện một sàng lọc nhỏ trên các biến thể nuclease đã chọn và đọc kết quả chỉnh sửa với giải trình tự thế hệ tiếp theo.
Đối với nghiên cứu và phát triển thịt nuôi cấy R&D, điều này mang lại cho bạn một con đường thực tế: bắt đầu với một danh sách ngắn các biến thể, sau đó kiểm tra từng bước các biến thể yếu hơn cho đến khi bạn tìm thấy tùy chọn ít hoạt động nhất mà vẫn chỉnh sửa hiệu quả vị trí mục tiêu.
