Nếu tôi không thể nhìn xuyên qua giàn giáo, tôi không thể tin tưởng vào kết quả đọc. Trong thịt nuôi cấy, giám sát quang học thường thất bại vì hai lý do đơn giản: tán xạ ánh sáng và sự không khớp chỉ số khúc xạ. Khi các cấu trúc chuyển từ các lớp mỏng sang 1–10 mm mô 3D, những giới hạn đó cắt giảm độ sâu hình ảnh, làm mờ cấu trúc bên trong và che giấu những thay đổi về khả năng sống, sự sắp xếp và sự tích tụ ECM.
Đây là phiên bản ngắn gọn:
- Các giàn giáo mỏng, trong suốt là dễ hình ảnh nhất với kính hiển vi trường rộng hoặc kính hiển vi đồng tiêu
- Các cấu trúc 3D dày hơn thường cần OCT, OCM, hoặc OPT
- Hydrogels có xu hướng hỗ trợ truy cập quang học tốt hơn so với thảm sợi hoặc hỗ trợ polymer xốp
- Mật độ tế bào, sưng phồng, và lắng đọng ma trận thường làm cho việc hình ảnh trở nên tồi tệ hơn theo thời gian
- Một thiết lập hoạt động vào ngày 1 có thể thất bại tại điểm cuối của văn hóa nếu bạn không kiểm tra truyền dẫn và độ sâu khi trưởng thành
- Việc hình ảnh vẫn phải hoạt động bên trong các hệ thống đóng kín, vô trùng, tương thích với lò ấp
Nếu tôi đang chọn một giàn giáo cho việc giám sát trong quá trình, tôi sẽ bắt đầu với một câu hỏi: có bao nhiêu tín hiệu sử dụng được vẫn sẽ truyền qua ở độ dày mô cuối cùng? Kiểm tra đó giúp thu hẹp cả lớp giàn giáo và phương pháp hình ảnh trước khi mở rộng quy mô.
So sánh nhanh
| Giàn giáo hoặc phương pháp | Phù hợp nhất | Giới hạn chính |
|---|---|---|
| Hydrogel trong suốt + kính hiển vi đồng tiêu | Cấu trúc mỏng, hình ảnh bề mặt chi tiết cao và gần bề mặt | Độ sâu giảm nhanh khi độ dày và tán xạ tăng |
| Hydrogel + OPT | Cấu trúc 3D trong suốt, khoảng 1–10 mm | Chi tiết tinh giảm, xử lý dữ liệu nhiều hơn |
| Giàn giáo bán trong suốt + OCT/OCM | Theo dõi không phá hủy lặp lại trong 1–5 mm mô | Tín hiệu vẫn phụ thuộc vào tán xạ từ thấp đến trung bình |
| Giàn giáo sợi hoặc xốp + OCM | Lập bản đồ bề mặt và gần bề mặt trong vật liệu dày đặc hơn | Hình ảnh lõi vẫn bị giới hạn |
| Mô giàu collagen + SHG | Cấu trúc và sắp xếp collagen không cần nhãn | Chỉ hữu ích cho các tín hiệu ma trận cụ thể |
Vì vậy, điểm chính rất đơn giản: thiết kế giàn giáo và lựa chọn hình ảnh phải được chọn cùng nhau, không phải từng cái một.
Các vấn đề chính về độ trong suốt quang học trong vật liệu giàn giáo
Giàn giáo gây cản trở việc giám sát quang học vì hai lý do chính: tán xạ và sự không khớp chỉ số khúc xạ. Cả hai đều trở thành vấn đề lớn hơn khi cấu trúc dày hơn. Điều đó làm cho việc gắn kết, căn chỉnh, khả năng sống sót và lắng đọng ma trận trở nên khó theo dõi hơn trong thời gian thực.
Tán xạ và sự không khớp chỉ số khúc xạ
Tán xạ ánh sáng xảy ra khi ánh sáng chạm vào các lỗ, sợi hoặc hạt có kích thước tương tự với bước sóng đang sử dụng. Mỗi đặc điểm đó tạo ra một giao diện làm lệch hướng ánh sáng. Kết quả là độ tương phản thấp hơn và tín hiệu bị méo tại đầu dò.
Sự không khớp chỉ số khúc xạ (RI) thêm một lớp rắc rối khác. Nếu vật liệu giàn giáo không khớp chặt chẽ với môi trường nước xung quanh, ánh sáng sẽ bị uốn cong tại mỗi giao diện.Điều đó dẫn đến các hiện tượng quang sai, độ phân giải thấp hơn và độ sâu hình ảnh nông hơn.
Loại giàn giáo thay đổi thách thức giám sát như thế nào
Những giới hạn này trông rất khác nhau tùy thuộc vào loại giàn giáo.
| Lớp giàn giáo | Giới hạn quang học chính | Tác động đến giám sát |
|---|---|---|
| Hydrogel | Thay đổi RI do sưng; độ đục ở mật độ tế bào cao hơn | Hình ảnh trở nên khó khăn hơn khi nuôi cấy trưởng thành |
| Thảm sợi điện quay | Giàn giáo sợi dày đặc tán xạ mạnh; sự lắng đọng ma trận ngoại bào làm tăng độ mờ đục | Mất độ tương phản; hình ảnh đáng tin cậy nhất gần bề mặt |
| Màng mỏng | Tán xạ thấp, nhưng hạn chế liên quan đến 3D | Giám sát quang học dễ dàng hơn; cấu trúc mô 3D hạn chế |
| Giàn giáo polymer xốp | Các giao diện tường lỗ và các hạt bị mắc kẹt tán xạ ánh sáng mạnh mẽ | Kính hiển vi tiêu chuẩn gặp khó khăn |
Trong thực tế, điều này có nghĩa là việc lựa chọn vật liệu không thể chỉ tập trung vào cấu trúc.Giàn giáo cũng cần hạn chế mất ánh sáng nếu bạn muốn hình ảnh trong quá trình sử dụng được.
Nơi mà kính hiển vi tiêu chuẩn không đáp ứng được
Kính hiển vi trường rộng và kính hiển vi đồng tiêu chủ yếu thu nhận tín hiệu gần bề mặt, vì vậy chúng bỏ lỡ những gì đang xảy ra trong lõi của các cấu trúc có kích thước milimet. Điều đó khiến khả năng sống của tế bào, sự sắp xếp và sự lắng đọng của ma trận ngoại bào trong nội thất chỉ được nhìn thấy một phần hoặc hoàn toàn bị che khuất. Đối với các nhóm chuyển từ mô hình sàng lọc mỏng sang mô dày hơn, điều này trở thành một hạn chế trực tiếp của quá trình.
Kế hoạch giám sát cần thay đổi trước khi bắt đầu mở rộng quy mô. Lựa chọn giàn giáo phải tính đến độ trong suốt cùng với hỗ trợ tế bào.
Lựa chọn vật liệu cải thiện độ trong suốt mà không làm mất chức năng của giàn giáo
Phần trước đã chỉ ra rằng loại giàn giáo xác định điểm mà giám sát quang học bắt đầu thất bại.Bước tiếp theo là lựa chọn vật liệu: làm thế nào để giảm thiểu tổn thất quang học mà không từ bỏ cấu trúc và các tín hiệu hướng tế bào mà tế bào cơ và mỡ cần?
Hydrogel và chất nền polymer có chỉ số khúc xạ phù hợp
Khi độ trong suốt quang học quan trọng hơn độ bền cơ học, hydrogel thường là vật liệu dễ làm việc nhất. Hàm lượng nước cao của chúng có thể đưa chỉ số khúc xạ gần với 1.33, giảm sự biến dạng tại các ranh giới vật liệu và hỗ trợ sự phát triển mô cơ và mỡ 3D. Trong thực tế, điều đó có nghĩa là bản thân vật liệu thường đặt ra giới hạn trên về những gì hệ thống hình ảnh có thể giải quyết.
Các màng polymer trong suốt cũng có thể cung cấp truyền dẫn quang học cao, nhưng chúng thường có chỉ số khúc xạ cao hơn nước. Vì lý do đó, chúng thường hoạt động tốt nhất khi được giữ mỏng, nơi sự không khớp chỉ số có ít tác động hơn.Điều đó làm cho chúng phù hợp hơn với các lớp tế bào bám dính và định dạng lắp ráp từ 2D đến 3D hơn là cho các cấu trúc mô 3D dày hơn.
Phương pháp tiệt trùng cũng quan trọng. Các hydrogel và màng nhạy cảm với nhiệt có thể cần tiệt trùng không nhiệt, và điều đó có thể thay đổi cả cách xử lý và độ trong suốt quang học.
Màng trong suốt, giá đỡ xốp và hydrogel chức năng hóa
Một khi các giới hạn quang học được hiểu rõ, việc lựa chọn giàn giáo trở thành một hành động cân bằng giữa độ trong suốt, vận chuyển khối lượng và kiểm soát phân hóa.
Giá đỡ xốp hữu ích cho sự phát triển 3D và dòng chảy dinh dưỡng, nhưng sự tán xạ thường giới hạn những gì các phương pháp quang học tiêu chuẩn có thể làm. Trong hầu hết các trường hợp, điều đó đẩy việc giám sát về phía OCT, OCM hoặc OPT.
Hydrogel chức năng hóa nằm ở một vị trí trung gian hữu ích. Chúng có thể cung cấp độ bám dính có thể điều chỉnh và phân hóa có hướng dẫn trong khi vẫn giữ được độ trong suốt cao.Chỉ số khúc xạ của chúng cũng có thể được điều chỉnh để phù hợp với môi trường nuôi cấy, điều này làm cho chúng trở thành một lựa chọn tốt khi cả hiệu suất tế bào và chất lượng hình ảnh đều quan trọng.
So sánh các tùy chọn giàn giáo để theo dõi sử dụng
| Chiến lược giàn giáo | Truyền dẫn quang học | Hành vi RI | Phương pháp hình ảnh tốt nhất | Phù hợp với nuôi cấy |
|---|---|---|---|---|
| Hydrogel có chỉ số khúc xạ phù hợp | Cao | Phù hợp với nước (~1.33); giảm biến dạng trong các vùng dày | Confocal, OCT, OCM | Sự phát triển mô cơ/mỡ 3D |
| Phim polymer trong suốt | Cao | Chỉ số RI cao hơn nước (~1.5+); yêu cầu các lớp mỏng để giảm thiểu sự không phù hợp | Trường rộng, tương phản pha | Các lớp tế bào bám dính; Lắp ráp từ 2D đến 3D |
| Giá đỡ xốp | Trung bình đến thấp | Tán xạ cao do sự không phù hợp RI giữa lỗ và môi trường | OCT, OCM, OPT | Sự phát triển 3D mật độ cao; dòng chất dinh dưỡng |
| Hydrogel chức năng hóa | Cao | Có thể điều chỉnh; có thể phù hợp với môi trường | Confocal, huỳnh quang | Kết dính có mục tiêu và phân hóa có định hướng |
Không có chiến lược giàn giáo đơn lẻ nào hoạt động tốt nhất trong mọi trường hợp.
- Sử dụng hydrogel khi độ rõ ràng là mối quan tâm chính.
- Sử dụng màng phim cho các lớp bám dính mỏng.
- Sử dụng giá đỡ xốp khi vận chuyển quan trọng hơn sự dễ dàng trong việc hình ảnh.
- Sử dụng hydrogel chức năng hóa khi kiểm soát độ bám dính là ưu tiên hàng đầu.
Những sự đánh đổi đó quyết định phương pháp hình ảnh nào vẫn có thể trả về dữ liệu sử dụng được qua giàn giáo.
sbb-itb-ffee270
Phương pháp hình ảnh phù hợp với giới hạn độ trong suốt của giàn giáo
Mô hình quyết định Phương pháp Hình ảnh-Đến-Giàn giáo cho Giám sát Thịt Nuôi cấy
Một khi bạn biết giàn giáo nào vẫn trong suốt, công việc tiếp theo là chọn phương pháp hình ảnh có thể thực sự nhìn xuyên qua chúng. Độ rõ của giàn giáo, độ dày của cấu trúc và kết quả cần thiết - chi tiết bề mặt, lập bản đồ thể tích hoặc dữ liệu không nhãn lặp lại - nhanh chóng thu hẹp danh sách.
Nơi mà mỗi phương pháp hình ảnh như confocal, OCT, OCM, OPT và hình ảnh phi tuyến tính hoạt động tốt nhất
Kính hiển vi confocal là điểm khởi đầu tốt nhất cho các giàn giáo mỏng, trong suốt dưới 500 µm. Trong các hydrogel trong suốt, nó có thể cung cấp chi tiết dưới micron . Đổi lại là độ sâu. Khi độ dày tăng lên, sự tán xạ bắt đầu làm giảm chất lượng hình ảnh, do đó, kính hiển vi đồng tiêu không còn thực tế cho các cấu trúc dày hơn.
Đối với các cấu trúc trong phạm vi 1–5 mm, chụp cắt lớp quang học (OCT) và kính hiển vi quang học (OCM) xử lý sự tán xạ tốt hơn nhiều so với đồng tiêu. OCT đặc biệt hữu ích cho việc giám sát quy trình thường xuyên vì tốc độ quét nhanh hơn của nó làm cho việc kiểm tra lặp lại trong quá trình nuôi cấy trở nên thực tế hơn. OCM phù hợp với các trường hợp bạn cần cái nhìn có độ phân giải cao hơn về tổ chức gần bề mặt, thường trong phạm vi 1–15 µm . Đối với các giá đỡ không trong suốt hoặc xốp dày hơn 2 mm , OCM thường là lựa chọn thực tế cho việc lập bản đồ bề mặt và gần bề mặt.
Chụp cắt lớp quang học (OPT) hoạt động tốt cho các hydrogel trong suốt trong phạm vi 1–10 mm và cung cấp dữ liệu thể tích 10–50 µm. Điều này làm cho nó hữu ích để theo dõi sự phân bố tế bào trên toàn bộ cấu trúc, thay vì cố gắng giải quyết cấu trúc nội bào tinh vi. Trong các ma trận giàu collagen, sự tạo ra hài hòa thứ hai (SHG) có thể hình dung collagen dạng sợi mà không cần nhãn huỳnh quang. Điều này hữu ích khi bạn muốn theo dõi sự tái cấu trúc ma trận và sự sắp xếp cấu trúc.
Cách xây dựng quy trình giám sát không phá hủy
Giữ mẫu trong môi trường nuôi cấy bất cứ khi nào có thể. Mỗi lần chuyển đều tăng nguy cơ nhiễm bẩn và làm cho cấu trúc tiếp xúc với sự thay đổi nhiệt độ, cân bằng khí và căng thẳng xử lý. Hình ảnh tích hợp trong lò ấp giúp giữ cho việc giám sát không phá hủy [1].
Lấy mẫu lặp lại làm giảm một trong những lợi thế chính của giàn giáo trong suốt. Hình ảnh không nhãn cho phép bạn theo dõi sự thay đổi mà không làm xáo trộn điều kiện nuôi cấy. Trong thực tế, OCT, OCM và SHG phù hợp hơn cho các phép đo lặp lại vì chúng tránh được độc tính quang học liên quan đến thuốc nhuộm huỳnh quang và tiếp xúc với laser cường độ cao. Đối với việc giám sát quy trình thường xuyên, thường có ý nghĩa hơn khi ưu tiên các phương thức quét nhanh hơn thay vì độ phân giải cao nhất có thể. Trong công việc thí điểm, thông lượng thường quan trọng hơn chi tiết siêu mịn.
Ma trận quyết định từ giàn giáo đến hình ảnh
Sử dụng ma trận dưới đây để chọn phương pháp ít xâm lấn nhất mà vẫn cung cấp dữ liệu sử dụng được.
| Lớp giàn giáo | Độ dày điển hình | Phương thức khuyến nghị | Độ phân giải kỳ vọng | Trường hợp sử dụng giám sát |
|---|---|---|---|---|
| Hydrogel trong suốt | < 500 µm | Kính hiển vi đồng tiêu | Dưới micron | Chi tiết nội bào độ phân giải cao |
| Hydrogel trong suốt | 1–10 mm | OPT | 10–50 µm | Phân bố tế bào theo thể tích |
| Giàn giáo bán trong suốt | 1–5 mm | OCT / OCM | 1–15 µm | Theo dõi tăng trưởng không phá hủy |
| Mạng lưới giàu collagen | Biến đổi | SHG (phi tuyến) | Dưới micron | Tái cấu trúc và sắp xếp ma trận |
| Hỗ trợ mờ / xốp | > 2 mm | OCM | 10–100 µm | Lập bản đồ bề mặt và gần bề mặt |
Phù hợp phương pháp hình ảnh với độ trong suốt và độ dày của giàn giáo ngay từ đầu giúp tránh một vấn đề phổ biến giữa thí nghiệm: phát hiện ra quá muộn rằng hệ thống đã chọn không thể trả lại dữ liệu sử dụng được qua cấu trúc.
Ưu tiên triển khai cho các nhóm thịt nuôi cấy
Kiểm tra xác nhận trước khi mở rộng quy mô
Một khi phương pháp chụp ảnh phù hợp với giàn giáo, công việc tiếp theo là chứng minh rằng thiết lập vẫn hoạt động trong quá trình nuôi cấy. Một cặp giàn giáo–chụp ảnh trông ổn vào ngày đầu tiên có thể bị hỏng khi cấu trúc dày lên và mật độ tế bào tăng lên.
Trước khi khóa giàn giáo và quy trình giám sát để mở rộng quy mô, các nhóm nên kiểm tra độ ổn định truyền dẫn trong suốt thời gian nuôi cấy và xác nhận độ sâu chụp ảnh khi trưởng thành, khi cấu trúc đạt độ dày đặc nhất. Họ cũng nên xác minh tính tương thích của bioreactor và môi trường nuôi cấy, vì hình dạng bình chứa và chỉ số khúc xạ của môi trường có thể ảnh hưởng đến chất lượng tín hiệu.Nếu mục tiêu là độ tin cậy rộng hơn, cũng nên kiểm tra trên các loại tế bào và giai đoạn nuôi cấy để xác nhận rằng thiết lập vẫn nhất quán khi điều kiện thay đổi, và kiểm tra rằng xử lý dữ liệu giảm thiểu hiệu ứng lô [2] .
Thực hiện các kiểm tra này ở quy mô thí điểm trước khi chuyển sang các cấu trúc lớn hơn có thể phát hiện sớm các sự không tương thích và giúp tránh các thiết kế lại ở giai đoạn muộn.
Thu mua giàn giáo và giám sát các thành phần thông qua Cellbase
Sau khi xác nhận, bước tiếp theo là thu mua các thành phần phù hợp với quy trình giám sát đã chọn.
Kết luận: con đường thực tế để cải thiện độ chính xác giám sát
Quy trình giám sát đáng tin cậy cần được xác nhận trong suốt thời kỳ nuôi cấy. Sự ổn định truyền dẫn, độ sâu hình ảnh khi trưởng thành, và khả năng tương thích của bioreactor và môi trường đều cần được xác nhận trước khi mở rộng quy mô để duy trì độ chính xác giám sát khi điều kiện nuôi cấy thay đổi [2] .
Câu hỏi thường gặp
Tại sao hình ảnh thất bại khi mô 3D dày hơn?
Khi mô 3D dày hơn, việc chụp ảnh trở nên khó khăn hơn. Lý do chính rất đơn giản: cấu trúc thịt nuôi in vitro không có mạch máu. Trong các hệ thống sống, mạng lưới mạch máu vận chuyển oxy và chất dinh dưỡng vào, và mang chất thải ra, qua khoảng cách lớn hơn nhiều.
Không có những con đường vận chuyển đó, các phần sâu hơn của mô khó duy trì sự sống và khó quan sát hơn. Sự mất sức khỏe của mô đó cũng làm giảm độ trong suốt quang học cần thiết cho việc chụp ảnh chính xác, theo thời gian thực.
Làm thế nào để tôi chọn phương pháp hình ảnh phù hợp cho giàn giáo của mình?
Bắt đầu bằng cách đảm bảo giàn giáo phù hợp với nhu cầu sinh học của tế bào của bạn, đặc biệt là độ cứng cơ bắp tự nhiên, hóa học kết dính, và kiến trúc lỗ chân lông.
Giàn giáo cũng định hình mức độ bạn có thể giám sát hệ thống tốt như thế nào. Vì vậy, hãy chọn một vật liệu giữ được tính toàn vẹn cấu trúc và độ trong suốt quang học dưới điều kiện thử nghiệm của bạn.
Tôi nên xác nhận điều gì trước khi mở rộng giám sát quang học?
Trước khi bạn mở rộng giám sát quang học, hãy đảm bảo rằng các dòng tế bào của bạn ổn định và đáng tin cậy qua nhiều lần truyền. Chúng cần phải duy trì tính nhất quán về mặt di truyền và kiểu hình, nếu không kết quả đọc của bạn có thể bị lệch và trở nên khó tin cậy.
Đáng kiểm tra xem độ trong suốt của giàn giáo có cho phép giám sát chính xác mà không can thiệp vào sự phát triển của mô hay không. Một giàn giáo có thể trông phù hợp trên giấy, nhưng nếu nó phân tán ánh sáng, tự phát huỳnh quang, hoặc thay đổi cách mô hình thành, dữ liệu cảm biến của bạn có thể trở nên sai lệch.
Cài đặt bioreactor của bạn cũng cần phải hoạt động với các hệ thống cảm biến mà bạn dự định sử dụng. Điều đó bao gồm tích hợp vật lý, truy cập quang học, hạn chế tiệt trùng và khả năng tương thích tín hiệu.
