Bảo quản lạnh là quá trình đông lạnh và lưu trữ các tế bào sống ở nhiệt độ cực thấp để duy trì khả năng sống sót của chúng theo thời gian. Phương pháp này rất quan trọng cho sản xuất thịt nuôi cấy, đảm bảo các dòng tế bào ổn định, nhất quán và bảo vệ chống lại tổn thất do ô nhiễm hoặc sự cố thiết bị. Các bước chính bao gồm:
- Chuẩn bị: Thu hoạch tế bào trong giai đoạn tăng trưởng của chúng, kiểm tra khả năng sống sót (nhắm đến ≥90%), và chuẩn bị chúng trong môi trường đông lạnh với các chất bảo vệ như DMSO hoặc glycerol.
- Đông lạnh: Sử dụng tốc độ làm lạnh có kiểm soát (-1°C đến -3°C mỗi phút) để ngăn ngừa tổn thương do tinh thể băng. Lưu trữ tế bào trong hơi nitơ lỏng (-135°C đến -190°C) để bảo quản lâu dài.
- Giải đông: Giải đông nhanh tế bào trong bể nước 37°C để giảm thiểu độc tính của chất bảo vệ, sau đó chuyển chúng sang môi trường tăng trưởng để phục hồi.
- Kiểm Soát Chất Lượng: Ghi nhãn chính xác các ống nghiệm, theo dõi điều kiện lưu trữ và kiểm tra khả năng sống sót sau khi rã đông để đảm bảo bảo quản thành công.
Quy Trình Bảo Quản Tế Bào Toàn Diện: Quy Trình 4 Bước từ Chuẩn Bị đến Lưu Trữ
Chuẩn Bị Tế Bào cho Bảo Quản
Thu Hoạch Tế Bào và Kiểm Tra Khả Năng Sống Sót
Để đảm bảo phục hồi tốt nhất sau khi rã đông, thu hoạch tế bào trong giai đoạn tăng trưởng logarit (log). Đối với các dòng tế bào bám dính, điều này thường xảy ra khi chúng đạt 80–90% độ confluency [2][3][6].
Kiểm tra khả năng sống sót của các tế bào bằng phương pháp loại trừ Trypan Blue. Trộn các phần bằng nhau (1:1) của 0.4% Trypan Blue với huyền phù tế bào, sau đó đếm số tế bào bằng cách sử dụng máy đếm tế bào.Các tế bào sống sẽ loại bỏ phẩm nhuộm và xuất hiện sáng dưới kính hiển vi, trong khi các tế bào không sống sẽ nhuộm màu xanh [4]. Lý tưởng nhất, hãy hướng tới tỷ lệ sống ít nhất là 90% để đạt được tỷ lệ phục hồi tốt nhất, mặc dù một số quy trình có thể chấp nhận mức tối thiểu là 75% [1][2][3][5].
Trước khi thu hoạch, hãy sử dụng kính hiển vi để kiểm tra sự nhiễm bẩn vi khuẩn hoặc nấm. Các tế bào huyền phù khỏe mạnh nên xuất hiện sáng, tròn và có khả năng khúc xạ dưới kính hiển vi đảo ngược pha tương phản [2][3].
Khi các tế bào đạt tiêu chuẩn sống cần thiết, hãy tiến hành các bước chuẩn bị trước khi đông lạnh.
Chuẩn bị trước khi đông lạnh
Đối với các tế bào bám dính, sử dụng các phương pháp phân tách nhẹ nhàng, chẳng hạn như trypsin hoặc TrypLE Express, và giới hạn thời gian ủ để tránh làm hỏng màng tế bào [5]. Chuẩn bị các tế bào với nồng độ từ 1 × 10⁶ đến 1 × 10⁷ tế bào/mL, tùy thuộc vào dòng tế bào [1][6]. Trong khi chia aliquot, đảm bảo rằng huyền phù tế bào được trộn thường xuyên để duy trì sự phân bố đồng đều trong các ống cryovial [5].
Giữ môi trường đông lạnh ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C trong quá trình tái huyền phù để giảm độc tính của chất bảo vệ đông lạnh trước khi bắt đầu quá trình đông lạnh [5]. Khi các tế bào đã được huyền phù trong môi trường đông lạnh, nhanh chóng chuyển sang quy trình đông lạnh [1].Luôn luôn cryopreserve tế bào ở số lần phân chia thấp nhất có thể để giảm thiểu rủi ro về sự trôi gen hoặc thay đổi hình thái [5][7].
Chọn Cryoprotectants và Medias Đóng Băng
Các tùy chọn Cryoprotectant và Chức năng của chúng
Dimethyl sulfoxide (DMSO) được sử dụng rộng rãi như một cryoprotectant, thường ở nồng độ 10% [2]. Nó hoạt động bằng cách thâm nhập vào màng tế bào và giảm hình thành băng trong quá trình đông lạnh. Tuy nhiên, DMSO có thể độc hại cho tế bào ở nhiệt độ phòng, vì vậy việc rã đông nhanh chóng là rất quan trọng để giảm thiểu tiếp xúc và nhanh chóng pha loãng nó [1].
Glycerol là một lựa chọn hữu ích cho các dòng tế bào nhạy cảm với DMSO, thường được sử dụng ở nồng độ từ 5% đến 15% [8].Nó đặc biệt hiệu quả cho các loại tế bào mà DMSO có thể gây ra sự phân hóa không mong muốn [3], và nó có xu hướng có độc tính thấp hơn so với DMSO.
Trong các ứng dụng thịt nuôi cấy, các quy trình đông lạnh truyền thống thường sử dụng một hỗn hợp 90% Sera Bò Thai (FBS) và 10% DMSO [1]. Tuy nhiên, việc phụ thuộc vào các thành phần có nguồn gốc từ động vật hạn chế những phương pháp này về khả năng mở rộng và phê duyệt quy định [9]. Để giải quyết những vấn đề này, media được xác định hóa học - như Synth-a-Freeze hoặc Recovery Cell Culture Medium - cung cấp một lựa chọn không có thành phần động vật. Những media này duy trì khả năng sống sót của tế bào cao sau khi rã đông trong khi vượt qua những thách thức liên quan đến các thành phần có nguồn gốc từ động vật [9].
So sánh các phương tiện đông lạnh
Dưới đây là phân tích về những lợi ích và hạn chế của các phương tiện đông lạnh khác nhau được sử dụng trong sản xuất thịt nuôi trồng:
| Phương tiện | Lợi ích | Hạn chế | Phù hợp với thịt nuôi trồng |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO trong FBS-DMEM | Các quy trình đã được thiết lập [1] | Có thành phần nguồn gốc động vật; biến đổi theo lô [9] | Khả năng mở rộng hạn chế |
| Synth-a-Freeze | Định nghĩa hóa học; chất lượng đồng nhất; không có thành phần động vật [9] | Chi phí ban đầu cao hơn [9] | Có |
| Phương tiện nuôi cấy tế bào phục hồi | Dễ sử dụng; được thiết kế cho việc phục hồi nhanh chóng [9] | Có thể cần tối ưu hóa cho các dòng tế bào cụ thể | Có |
| 10% Glycerol trong FBS | Giải pháp thay thế cho các tế bào nhạy cảm với DMSO [1] | Dựa vào huyết thanh có nguồn gốc từ động vật [9] | Khả năng mở rộng hạn chế |
Vào tháng 2 năm 2023, các nhà nghiên cứu tại Đại học Y Tokyo, do Hironobu Takahashi dẫn đầu, đã chứng minh tầm quan trọng của việc chọn lựa môi trường đông lạnh phù hợp.Sử dụng các tùy chọn thương mại như CELLBANKER 1 và 2, họ đã thành công trong việc bảo quản cryo các tế bào cơ chính của bò ở –80°C trong vòng một năm. Đáng chú ý, những tế bào này vẫn giữ được khả năng sinh sản và phân hóa thành mô cơ co bóp với cấu trúc sarcomere nguyên vẹn sau khi rã đông [10].
Đối với sản xuất thịt nuôi cấy, các môi trường được xác định hóa học và tuân thủ GMP ngày càng được ưa chuộng. Như STEMCELL Technologies nhấn mạnh:
Trong các lĩnh vực được quản lý chặt chẽ như liệu pháp tế bào và gen, nên sử dụng môi trường bảo quản cryo được sản xuất theo GMP, hoàn toàn xác định để đảm bảo rằng các sản phẩm được sản xuất và kiểm soát một cách nhất quán theo các tiêu chuẩn chất lượng [9].
Các nền tảng như
Quy trình Bảo quản Cryo và Tốc độ Làm lạnh
Giao thức Đông lạnh Từng Bước
Chìa khóa để bảo quản cryo thành công nằm ở việc duy trì tốc độ làm lạnh ổn định từ -1°C đến -3°C mỗi phút[2]. Quá trình dần dần này cho phép nước rời khỏi tế bào một cách chậm rãi, ngăn chặn sự hình thành các tinh thể băng nội bào gây hại có thể làm vỡ màng tế bào[1].
Bắt đầu bằng cách ly tâm các tế bào ở 150 x g trong 5 phút[3]. Sau khi ly tâm, hòa lại cặn tế bào trong một môi trường đông lạnh lạnh chứa 10% DMSO với nồng độ 2–4×10⁶ tế bào/mL[3].Để giảm thiểu tiếp xúc với DMSO, hãy nhanh chóng chuyển sang bước tiếp theo - đông lạnh.
Phân phối huyết thanh tế bào vào các ống cryogenic đã được gán nhãn trước. Mỗi ống nên rõ ràng chỉ ra các chi tiết thiết yếu như tên dòng tế bào, số lần truyền, số lô, nồng độ tế bào và ngày đông lạnh[3]. Khi các ống đã được chuẩn bị, đã đến lúc chọn và sử dụng thiết bị làm lạnh phù hợp.
Thiết bị và Kỹ thuật Làm Lạnh
Đặt các ống ngay lập tức vào thiết bị làm lạnh có kiểm soát. Các thùng đông lạnh thụ động, như Nalgene "Mr Frosty" (sử dụng isopropanol) hoặc Corning "CoolCell", là những lựa chọn phổ biến. Những công cụ này có thể đạt được tốc độ làm lạnh khoảng 1°C mỗi phút khi được đặt trong tủ đông -80°C[2].
Đối với các hoạt động quy mô lớn mà sự nhất quán là rất quan trọng, một chiếc tủ đông điều khiển tốc độ lập trình là lựa chọn tốt nhất. Như đã nêu bởi Sigma-Aldrich:
ECACC thường xuyên sử dụng một chiếc tủ đông điều khiển tốc độ lập trình. Đây là cách đáng tin cậy và có thể tái tạo nhất để đông lạnh tế bào[3].
Sau khoảng 24 giờ ở -80°C, chuyển các ống nghiệm vào pha hơi của nitơ lỏng, nơi nhiệt độ dao động giữa -135°C và -190°C, để lưu trữ lâu dài[4]. Tránh lưu trữ tế bào ở -80°C lâu hơn một tuần, vì điều này có thể làm giảm khả năng sống sót của chúng. Nhiệt độ dưới -135°C là cần thiết cho việc bảo quản vô thời hạn[2]. Sử dụng pha hơi thay vì pha lỏng giảm nguy cơ ô nhiễm chéo trong khi vẫn duy trì nhiệt độ đủ thấp.
Quy trình Giải đông và Phục hồi
Quy trình Giải đông
Giải đông tế bào nhanh chóng là rất quan trọng để hạn chế sự tiếp xúc với cryoprotectant độc hại và ngăn chặn tinh thể băng gây hại. Hãy chắc chắn đeo mặt nạ toàn mặt và găng tay cách nhiệt để đảm bảo an toàn. Bắt đầu bằng cách lấy ống cryovial ra khỏi nitơ lỏng và nới lỏng nắp một chút để giải phóng áp suất tích tụ. Sau đó, siết chặt nắp lại.
Đặt ống vào bể nước 37°C, đảm bảo nắp ống nằm trên mặt nước. Để nó giải đông trong 1–2 phút, hoặc cho đến khi chỉ còn một vài tinh thể băng. Khi đã giải đông, lau bên ngoài ống bằng cồn 70% để duy trì độ vô trùng.
Chuyển nội dung của ống vào một ống chứa 5–10 mL môi trường nuôi cấy đã được làm ấm trước. Thêm môi trường từ từ để giúp giảm sốc thẩm thấu. Nếu bạn đang làm việc với các dòng tế bào treo, hãy ly tâm huyền phù tế bào ngay lập tức ở 300 × g trong 5 phút ở 4°C.Bước này giúp tạo viên các tế bào và loại bỏ cryoprotectant. Sau khi ly tâm, hòa tan lại các tế bào trong môi trường mới. Đối với các tế bào bám dính, thường thì không cần ly tâm. Thay vào đó, hãy trực tiếp gieo các tế bào vào một bình nuôi cấy phù hợp và loại bỏ bất kỳ DMSO dư thừa nào trong lần thay môi trường đầu tiên, thường là sau 24 giờ.
Đánh giá sau khi rã đông
Ngay sau khi rã đông, kiểm tra khả năng sống sót của tế bào để đảm bảo quá trình phục hồi đã thành công. Sử dụng phương pháp loại trừ Trypan Blue cho đánh giá này. Lý tưởng nhất, khả năng sống sót của tế bào nên vượt quá 90% [11], nhưng tối thiểu 75% là chấp nhận được. Sau 24 giờ, kiểm tra các tế bào dưới kính hiển vi tương phản pha để xác nhận sự bám dính, đánh giá mật độ tế bào và kiểm tra bất kỳ dấu hiệu nào của sự nhiễm bẩn.
Tiếp tục theo dõi các tế bào qua các lần chuyển 1–3 để đảm bảo sự phát triển bình thường và rằng chúng giữ được các đặc tính mong đợi.Đối với các dòng tế bào phục hồi chậm hơn, bạn có thể cải thiện khả năng sống sót bằng cách tăng nồng độ huyết thanh bò thai ban đầu lên khoảng 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Bảo quản và Khả năng sống lâu dài
Điều kiện và Thời gian Bảo quản
Để duy trì khả năng sống của dòng tế bào trong thời gian dài, điều quan trọng là phải bảo quản chúng ở nhiệt độ dưới -135°C [7][2]. Điều này đảm bảo chúng được bảo quản vô thời hạn.
Phương pháp ưa thích để bảo quản các dòng tế bào thịt nuôi cấy là nitơ lỏng pha hơi. Kỹ thuật này giữ nhiệt độ giữa -135°C và -190°C, làm cho nó lý tưởng cho việc bảo quản lâu dài trong khi cung cấp độ an toàn cao hơn so với bảo quản pha lỏng.
Nếu bạn cần bảo quản tế bào ở -80°C, hãy giới hạn thời gian này trong khoảng 24 giờ đến một tuần. Ngoài thời gian này, khả năng sống của tế bào có thể giảm.Để lưu trữ tạm thời ở nhiệt độ này, hãy chuyển các tế bào vào kho lạnh nitơ lỏng càng sớm càng tốt.
Sử dụng ống cryogenic vô trùng tiêu chuẩn (1–2 mL) với ren bên trong và vòng O để lưu trữ an toàn [4][5]. Luôn đặt các ống cryovial đã niêm phong trong pha khí thay vì pha lỏng của nitơ để giảm nguy cơ nổ ống trong quá trình rã đông [5]. Ngoài ra, hãy đảm bảo rằng các bình nitơ lỏng lớn được giữ ít nhất một nửa đầy để duy trì một khoảng đệm an toàn.
Cuối cùng, các biện pháp kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt là rất quan trọng để đảm bảo khả năng sống lâu dài của các tế bào.
Kiểm Tra Kiểm Soát Chất Lượng
Để đảm bảo độ tin cậy của các dòng tế bào đã lưu trữ, hãy tuân theo các quy trình nghiêm ngặt cho kiểm soát chất lượng. Bắt đầu bằng cách ghi nhãn chính xác từng ống bằng nhãn chống chịu nitơ lỏng.Bao gồm các chi tiết cần thiết như danh tính dòng tế bào, số lô, số lần truyền và ngày đông lạnh. Duy trì một cơ sở dữ liệu điện tử để ghi lại vị trí chính xác của mỗi ống, điều này giảm thời gian mà các bình chứa cần phải mở [7][2].
Trước khi cam kết toàn bộ lô hàng vào kho lưu trữ dài hạn, hãy kiểm tra khả năng sống sót của một ống sau khi lưu trữ ngắn hạn trong pha khí. Bước này giúp xác nhận rằng quá trình đông lạnh đã thành công và xác định bất kỳ vấn đề tiềm ẩn nào [4][7][2]. Đối với các nguồn tế bào có giá trị cao, nên lưu trữ bản sao tại một địa điểm thứ cấp để bảo vệ chống lại sự cố thiết bị hoặc thảm họa địa phương [7][2].
Trang bị tất cả các bình chứa với hệ thống giám sát nhiệt độ và báo động để phát hiện mức nitơ lỏng thấp [7]. Ngoài ra, lắp đặt báo động oxy trong các khu vực lưu trữ, được cài đặt để kích hoạt ở mức 18% oxy (v/v), nhằm giảm thiểu rủi ro ngạt thở cho nhân viên làm việc với nitơ lỏng [7][2].
Video hướng dẫn bảo quản lạnh các dòng tế bào động vật có vú
Kết luận và Những điểm chính
Dưới đây là tóm tắt nhanh các bước thiết yếu và khuyến nghị cho việc bảo quản lạnh hiệu quả trong sản xuất thịt nuôi trồng:
- Thu hoạch tế bào: Thu thập tế bào trong giai đoạn tăng trưởng logarit, đảm bảo khả năng sống sót vượt quá 90%. Sử dụng 10% DMSO làm chất bảo vệ lạnh, mặc dù glycerol có thể là một lựa chọn thay thế cho các dòng tế bào nhạy cảm hơn [11][1].
- Quá trình làm lạnh và lưu trữ: Duy trì tốc độ làm lạnh được kiểm soát và nhanh chóng chuyển các ống nghiệm vào kho lưu trữ nitơ lỏng pha hơi để bảo vệ tính toàn vẹn của tế bào [11]
Một nghiên cứu của Roka Kakehi et al. nhấn mạnh tầm quan trọng của độ chính xác trong quá trình đông lạnh tế bào [10]:
"Đảm bảo một nguồn tế bào đáng tin cậy và nhất quán bằng cách sử dụng đông lạnh sẽ cho phép chúng tôi tăng cường nguồn cung ổn định của các tế bào tiềm năng cho sản xuất thịt nuôi cấy." - Roka Kakehi et al., Đại học Y Tokyo
- Quá trình rã đông: Rã đông tế bào trong bể nước 37°C khoảng hai phút, dừng lại khi 80% băng đã tan. Điều này giảm độc tính DMSO và cải thiện khả năng phục hồi của tế bào [1]. Theo dõi bằng các kiểm tra khả năng sống sót sau khi rã đông để đảm bảo thành công và điều chỉnh các quy trình trong tương lai.
Các phương pháp này hoạt động song song với các thực hành kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Luôn ghi nhãn chính xác các ống nghiệm, duy trì hồ sơ có tổ chức và thực hiện các kiểm tra kỹ lưỡng trước khi lưu trữ lâu dài [11]. Đối với các nhu cầu cryopreservation chuyên biệt, các nền tảng như
Câu hỏi thường gặp
Các lợi ích của việc sử dụng môi trường hóa học xác định để cryopreserve các dòng tế bào trong sản xuất thịt nuôi cấy là gì?
Môi trường hóa học xác định mang lại nhiều lợi ích khi nói đến việc cryopreserve các dòng tế bào cho sản xuất thịt nuôi cấy. Bằng cách loại bỏ các thành phần không xác định, như huyết thanh có nguồn gốc từ động vật, chúng đảm bảo các kết quả nhất quán và có thể dự đoán - một yếu tố quan trọng để duy trì độ tin cậy lâu dài của các dòng tế bào.
Một lợi thế chính khác là giảm nguy cơ ô nhiễm và biến đổi. Điều này không chỉ hỗ trợ các tiêu chuẩn chất lượng và an toàn cao hơn mà còn hoàn toàn phù hợp với độ chính xác và khả năng mở rộng cần thiết để đáp ứng cả yêu cầu quy định và mong đợi của người tiêu dùng trong ngành thịt nuôi trồng.
Việc lựa chọn chất bảo vệ lạnh ảnh hưởng như thế nào đến sự sống sót của tế bào trong quá trình đông lạnh và rã đông?
Việc lựa chọn chất bảo vệ lạnh là một yếu tố chính trong việc bảo tồn sức khỏe tế bào trong quá trình đông lạnh và rã đông. Hai lựa chọn phổ biến là dimethyl sulfoxide (DMSO) và glycerol, mỗi loại có những đặc điểm riêng. DMSO được biết đến với khả năng thâm nhập vào tế bào nhanh chóng và cung cấp sự bảo vệ mạnh mẽ. Tuy nhiên, nó có một điều cần lưu ý: ở nồng độ cao hoặc với thời gian tiếp xúc kéo dài, nó có thể trở nên độc hại, có khả năng làm giảm khả năng sống sót của tế bào.
Glycerol, ngược lại, ít độc hại hơn và có thể được áp dụng trực tiếp.Nhược điểm của nó nằm ở tốc độ thâm nhập tế bào chậm hơn, điều này có thể dẫn đến việc bảo vệ ngay lập tức kém hơn so với DMSO.
Đạt được sự cân bằng đúng là rất quan trọng. Điều chỉnh đúng nồng độ và thời gian tiếp xúc của cryoprotectant giúp bảo vệ tế bào trong khi giảm thiểu nguy cơ độc tính. Ngoài ra, tuân thủ các thực hành tốt nhất về tốc độ làm lạnh và điều kiện lưu trữ là điều cần thiết để đảm bảo tỷ lệ phục hồi cao nhất có thể sau khi rã đông.
Tại sao việc kiểm soát tốc độ làm lạnh trong quá trình cryopreservation lại quan trọng?
Giữ cho tốc độ làm lạnh ổn định, thường nằm trong khoảng –1°C và –3°C mỗi phút, là chìa khóa để giữ cho tế bào sống sót. Làm lạnh từ từ cho phép tế bào mất nước với tốc độ kiểm soát, giảm khả năng hình thành tinh thể băng có hại, có thể làm rách hoặc hư hại màng tế bào.
Cách tiếp cận có tính toán này bảo vệ cấu trúc của tế bào, tăng cường khả năng sống sót và chức năng của chúng sau khi rã đông.Việc tuân thủ các quy trình làm mát chính xác là rất quan trọng để đảm bảo việc lưu trữ và phục hồi các dòng tế bào lâu dài thành công.
