Đông lạnh bảo quản là quá trình đông lạnh và lưu trữ các tế bào sống ở nhiệt độ cực thấp để duy trì khả năng sống của chúng theo thời gian. Phương pháp này rất quan trọng cho sản xuất thịt nuôi cấy, đảm bảo các dòng tế bào ổn định, nhất quán và bảo vệ chống lại tổn thất do ô nhiễm hoặc hỏng hóc thiết bị. Các bước chính bao gồm:
- Chuẩn bị: Thu hoạch tế bào trong giai đoạn phát triển của chúng, kiểm tra khả năng sống (mục tiêu ≥90%), và chuẩn bị chúng trong môi trường đông lạnh với chất bảo vệ đông lạnh như DMSO hoặc glycerol.
- Đông lạnh: Sử dụng tốc độ làm lạnh có kiểm soát (-1°C đến -3°C mỗi phút) để ngăn ngừa tổn thương tinh thể băng. Lưu trữ tế bào trong hơi nitơ lỏng (-135°C đến -190°C) để bảo quản lâu dài.
- Rã đông: Nhanh chóng rã đông tế bào trong bể nước 37°C để giảm thiểu độc tính của chất bảo vệ đông lạnh, sau đó chuyển chúng vào môi trường phát triển để phục hồi.
- Kiểm Soát Chất Lượng: Dán nhãn lọ chính xác, giám sát điều kiện lưu trữ và kiểm tra khả năng sống sót sau khi rã đông để đảm bảo bảo quản thành công.
Quy Trình Bảo Quản Lạnh Hoàn Chỉnh Cho Dòng Tế Bào: Quy Trình 4 Bước Từ Chuẩn Bị Đến Lưu Trữ
Chuẩn Bị Tế Bào Cho Bảo Quản Lạnh
Thu Hoạch Tế Bào và Kiểm Tra Khả Năng Sống Sót
Để đảm bảo phục hồi tốt nhất sau khi rã đông, thu hoạch tế bào trong giai đoạn tăng trưởng logarit (log) của chúng. Đối với các dòng tế bào bám dính, điều này thường xảy ra khi chúng đạt đến 80–90% độ phủ [2][3][6].
Kiểm tra khả năng sống sót của tế bào bằng phương pháp loại trừ Trypan Blue. Trộn các phần bằng nhau (1:1) của Trypan Blue 0,4% với huyền phù tế bào, sau đó đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.Các tế bào khả thi sẽ loại bỏ thuốc nhuộm và xuất hiện sáng dưới kính hiển vi, trong khi các tế bào không khả thi sẽ nhuộm màu xanh [4]. Lý tưởng nhất, hãy nhắm đến tỷ lệ khả thi ít nhất 90% để đạt được tỷ lệ phục hồi tốt nhất, mặc dù một số quy trình có thể chấp nhận tối thiểu 75% [1][2][3][5].
Trước khi thu hoạch, sử dụng kính hiển vi để kiểm tra sự nhiễm khuẩn hoặc nấm. Các tế bào huyền phù khỏe mạnh nên xuất hiện sáng, tròn và khúc xạ dưới kính hiển vi tương phản pha đảo ngược [2][3].
Một khi các tế bào đạt tiêu chuẩn khả thi yêu cầu, chuyển sang các bước trước khi đông lạnh.
Chuẩn Bị Trước Khi Đông Lạnh
Đối với các tế bào bám dính, sử dụng các phương pháp tách nhẹ nhàng, chẳng hạn như trypsin hoặc TrypLE Express, và giới hạn thời gian ủ để tránh làm hỏng màng tế bào [5]. Chuẩn bị tế bào ở nồng độ từ 1 × 10⁶ đến 1 × 10⁷ tế bào/mL, tùy thuộc vào dòng tế bào [1][6]. Trong khi chia mẫu, đảm bảo hỗn dịch tế bào được trộn thường xuyên để duy trì sự phân bố đồng đều trong các ống cryovial [5].
Giữ môi trường đông lạnh ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C trong quá trình hòa tan để giảm độc tính của chất bảo vệ đông lạnh trước khi bắt đầu quá trình đông lạnh [5]. Khi tế bào đã được hòa tan trong môi trường đông lạnh, nhanh chóng chuyển sang quy trình đông lạnh [1].Luôn bảo quản lạnh tế bào ở số lần cấy thấp nhất có thể để giảm nguy cơ trôi dạt di truyền hoặc thay đổi hình thái [5][7].
Chọn chất bảo vệ lạnh và môi trường đông lạnh
Tùy chọn chất bảo vệ lạnh và chức năng của chúng
Dimethyl sulfoxide (DMSO) được sử dụng rộng rãi như một chất bảo vệ lạnh, thường ở nồng độ 10% [2]. Nó hoạt động bằng cách thâm nhập màng tế bào và giảm hình thành băng trong quá trình đông lạnh. Tuy nhiên, DMSO có thể gây độc cho tế bào ở nhiệt độ phòng, vì vậy cần rã đông nhanh chóng để giảm thiểu tiếp xúc và nhanh chóng pha loãng nó [1].
Glycerol là một lựa chọn thay thế hữu ích cho các dòng tế bào nhạy cảm với DMSO, thường được sử dụng ở nồng độ từ 5% đến 15% [8].Nó đặc biệt hiệu quả cho các loại tế bào mà DMSO có thể gây ra sự phân hóa không mong muốn [3], và nó có xu hướng có độc tính thấp hơn so với DMSO.
Trong các ứng dụng thịt nuôi cấy, các giao thức đông lạnh truyền thống thường sử dụng hỗn hợp 90% Huyết thanh Bò Thai (FBS) và 10% DMSO [1]. Tuy nhiên, sự phụ thuộc vào các thành phần có nguồn gốc từ động vật hạn chế các phương pháp này về khả năng mở rộng và phê duyệt quy định [9]. Để giải quyết những vấn đề này, môi trường hóa học xác định - như Synth-a-Freeze hoặc Recovery Cell Culture Medium - cung cấp một giải pháp thay thế không có thành phần từ động vật. Các môi trường này duy trì khả năng sống sót của tế bào sau khi rã đông cao trong khi vượt qua các thách thức liên quan đến các thành phần có nguồn gốc từ động vật [9].
So sánh các phương tiện đông lạnh
Dưới đây là phân tích về ưu điểm và hạn chế của các phương tiện đông lạnh khác nhau được sử dụng trong sản xuất thịt nuôi cấy:
| Phương tiện | Ưu điểm | Nhược điểm | Phù hợp với thịt nuôi cấy |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO trong FBS-DMEM | Quy trình đã được thiết lập [1] | Chứa thành phần có nguồn gốc động vật; biến đổi theo lô [9] | Khả năng mở rộng hạn chế |
| Synth-a-Freeze | Định nghĩa hóa học; chất lượng đồng nhất; không có thành phần động vật [9] | Chi phí ban đầu cao hơn [9] | Có |
| Phương tiện nuôi cấy tế bào phục hồi | Dễ sử dụng; thiết kế cho phục hồi nhanh chóng [9] | Có thể cần tối ưu hóa cho các dòng tế bào cụ thể | Có |
| 10% Glycerol trong FBS | Thay thế cho các tế bào nhạy cảm với DMSO [1] | Dựa vào huyết thanh có nguồn gốc động vật [9] | Khả năng mở rộng hạn chế |
Vào tháng 2 năm 2023, các nhà nghiên cứu tại Đại học Y Tokyo Women's, do Hironobu Takahashi dẫn đầu, đã chứng minh tầm quan trọng của việc lựa chọn môi trường đông lạnh phù hợp. Sử dụng các tùy chọn thương mại như CELLBANKER 1 và 2, họ đã bảo quản đông lạnh thành công các tế bào cơ myogenic bò sơ cấp ở –80°C trong thời gian lên đến một năm. Đáng chú ý, những tế bào này vẫn giữ được khả năng sinh sản và phân hóa thành mô cơ co bóp với cấu trúc sarcomere nguyên vẹn sau khi rã đông [10] .
Đối với sản xuất thịt nuôi cấy, các môi trường hóa học được định nghĩa và tuân thủ GMP ngày càng được ưa chuộng. Như STEMCELL Technologies nhấn mạnh:
Trong các lĩnh vực được quản lý chặt chẽ như liệu pháp tế bào và gen, nên sử dụng môi trường bảo quản đông lạnh được sản xuất theo GMP và được định nghĩa hoàn toàn để đảm bảo rằng các sản phẩm được sản xuất và kiểm soát nhất quán theo các tiêu chuẩn chất lượng [9].
Các nền tảng như
Quy trình bảo quản lạnh và tốc độ làm lạnh
Quy trình đông lạnh từng bước
Chìa khóa để bảo quản lạnh thành công là duy trì tốc độ làm lạnh ổn định từ -1°C đến -3°C mỗi phút[2]. Quá trình từ từ này cho phép nước rời khỏi tế bào một cách chậm rãi, ngăn chặn sự hình thành của các tinh thể băng nội bào có thể làm vỡ màng tế bào[1].
Bắt đầu bằng cách ly tâm các tế bào ở 150 x g trong 5 phút[3]. Sau khi ly tâm, hòa tan lại viên tế bào trong môi trường đông lạnh lạnh chứa 10% DMSO với nồng độ 2–4×10⁶ tế bào/mL [3].Để giảm tiếp xúc với DMSO, nhanh chóng chuyển sang bước tiếp theo - đông lạnh.
Phân phối huyền phù tế bào vào các ống cryo đã được dán nhãn trước. Mỗi ống nên ghi rõ các chi tiết cần thiết như tên dòng tế bào, số lần truyền, số lô, nồng độ tế bào và ngày đông lạnh[3]. Với các ống đã chuẩn bị, đã đến lúc chọn và sử dụng thiết bị làm lạnh phù hợp.
Thiết bị và Kỹ thuật Làm lạnh
Đặt ngay các ống vào thiết bị làm lạnh có tốc độ kiểm soát. Các hộp đông lạnh thụ động, như Nalgene "Mr Frosty" (sử dụng isopropanol) hoặc Corning "CoolCell", là những lựa chọn phổ biến. Những công cụ này có thể đạt tốc độ làm lạnh khoảng 1°C mỗi phút khi được đặt trong tủ đông -80°C[2] .
Đối với các hoạt động quy mô lớn hơn, nơi mà sự nhất quán là rất quan trọng, một tủ đông có thể lập trình điều khiển tốc độ là lựa chọn tốt nhất. Như đã được Sigma-Aldrich tuyên bố:
ECACC thường xuyên sử dụng một tủ đông có thể lập trình điều khiển tốc độ. Đây là cách đáng tin cậy và có thể tái tạo nhất để đông lạnh tế bào[3].
Sau khoảng 24 giờ ở -80°C, chuyển các ống nghiệm sang pha hơi của nitơ lỏng, nơi mà nhiệt độ dao động từ -135°C đến -190°C, để lưu trữ lâu dài [4]. Tránh lưu trữ tế bào ở -80°C lâu hơn một tuần, vì điều này có thể làm giảm khả năng sống sót của chúng. Nhiệt độ dưới -135°C là cần thiết để bảo quản vô thời hạn[2]. Sử dụng pha hơi thay vì pha lỏng giảm nguy cơ nhiễm chéo trong khi vẫn duy trì nhiệt độ đủ thấp.
Quy trình rã đông và phục hồi
Quá trình rã đông
Rã đông tế bào nhanh chóng là rất quan trọng để hạn chế tiếp xúc với chất bảo vệ đông lạnh độc hại và ngăn ngừa tinh thể băng gây hư hại. Hãy chắc chắn đeo kính che mặt toàn phần và găng tay cách nhiệt để đảm bảo an toàn. Bắt đầu bằng cách lấy ống cryo ra khỏi nitơ lỏng và nới lỏng nắp một chút để giải phóng áp suất tích tụ. Sau đó, vặn chặt nắp lại.
Đặt ống vào bể nước 37°C, đảm bảo nắp luôn ở trên mực nước. Để nó rã đông trong 1–2 phút, hoặc cho đến khi chỉ còn vài tinh thể băng. Khi đã rã đông, lau bên ngoài ống bằng cồn 70% để duy trì vô trùng.
Chuyển nội dung của ống vào một ống chứa 5–10 mL môi trường tăng trưởng đã được làm ấm trước. Thêm môi trường từ từ để giúp giảm sốc thẩm thấu. Nếu bạn đang làm việc với các dòng tế bào treo, ly tâm hỗn dịch tế bào ngay lập tức ở 300 × g trong 5 phút ở 4°C.Bước này giúp kết tủa các tế bào và loại bỏ chất bảo vệ đông lạnh. Sau khi ly tâm, hòa tan lại các tế bào trong môi trường mới. Đối với các tế bào bám dính, thường không cần ly tâm. Thay vào đó, trực tiếp gieo các tế bào vào một bình nuôi cấy phù hợp và loại bỏ bất kỳ DMSO còn sót lại trong lần thay môi trường đầu tiên, thường là sau 24 giờ.
Đánh giá sau khi rã đông
Ngay sau khi rã đông, kiểm tra khả năng sống của tế bào để đảm bảo quá trình phục hồi đã thành công. Sử dụng phương pháp loại trừ Trypan Blue cho đánh giá này. Lý tưởng nhất, khả năng sống của tế bào nên vượt quá 90% [11], nhưng tối thiểu 75% là chấp nhận được. Sau 24 giờ, kiểm tra các tế bào dưới kính hiển vi tương phản pha để xác nhận sự bám dính, đánh giá mật độ tế bào và kiểm tra bất kỳ dấu hiệu nhiễm bẩn nào.
Tiếp tục theo dõi các tế bào qua các lần chuyển 1–3 để đảm bảo sự phát triển bình thường và chúng giữ được các đặc điểm mong đợi.Đối với các dòng tế bào phục hồi chậm hơn, bạn có thể cải thiện sự sống sót bằng cách tăng nồng độ huyết thanh bò thai ban đầu lên khoảng 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Lưu trữ và Khả năng Sống sót Dài hạn
Điều kiện và Thời gian Lưu trữ
Để duy trì khả năng sống sót của dòng tế bào trong thời gian dài, điều cần thiết là lưu trữ chúng ở nhiệt độ dưới -135°C [7][2]. Điều này đảm bảo chúng được bảo quản vô thời hạn.
Phương pháp ưa thích để lưu trữ các dòng tế bào thịt nuôi cấy là nitơ lỏng pha hơi. Kỹ thuật này giữ nhiệt độ từ -135°C đến -190°C, làm cho nó lý tưởng cho việc bảo quản lâu dài trong khi cung cấp sự an toàn cao hơn so với lưu trữ pha lỏng.
Nếu bạn cần lưu trữ tế bào ở -80°C, hãy giới hạn trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến một tuần. Sau thời gian này, khả năng sống sót của tế bào có thể giảm.Để lưu trữ tạm thời ở nhiệt độ này, chuyển các tế bào vào kho lưu trữ nitơ lỏng càng sớm càng tốt.
Sử dụng các lọ đông lạnh tiêu chuẩn vô trùng (1–2 mL) với ren bên trong và vòng O để lưu trữ an toàn [4][5]. Luôn đặt các lọ đông lạnh kín trong pha khí thay vì pha lỏng của nitơ để giảm nguy cơ nổ lọ trong quá trình rã đông [5]. Ngoài ra, đảm bảo các bình nitơ lỏng số lượng lớn được giữ ít nhất nửa đầy để duy trì một vùng đệm an toàn.
Cuối cùng, các biện pháp kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt là rất quan trọng để đảm bảo khả năng tồn tại lâu dài của các tế bào.
Kiểm Tra Chất Lượng
Để đảm bảo độ tin cậy của các dòng tế bào được lưu trữ, tuân theo các giao thức nghiêm ngặt về kiểm soát chất lượng. Bắt đầu bằng cách dán nhãn chính xác từng lọ với nhãn chống nitơ lỏng.Bao gồm các chi tiết cần thiết như danh tính dòng tế bào, số lô, số lần truyền, và ngày đông lạnh. Duy trì cơ sở dữ liệu điện tử để ghi lại vị trí chính xác của mỗi lọ, giúp giảm thời gian các bình lưu trữ cần mở [7][2].
Trước khi cam kết lưu trữ dài hạn toàn bộ lô, hãy kiểm tra khả năng sống sót của một lọ sau khi lưu trữ ngắn hạn trong pha khí. Bước này giúp xác nhận quá trình đông lạnh đã thành công và xác định bất kỳ vấn đề tiềm ẩn nào [4][7][2]. Đối với các kho tế bào có giá trị cao, nên lưu trữ bản sao tại một địa điểm thứ cấp để bảo vệ chống lại sự cố thiết bị hoặc thảm họa địa phương [7][2].
Trang bị tất cả các bình chứa với hệ thống giám sát nhiệt độ và báo động để phát hiện mức nitơ lỏng thấp [7]. Ngoài ra, lắp đặt báo động oxy trong các khu vực lưu trữ, được cài đặt để kích hoạt ở mức 18% oxy (v/v), nhằm giảm thiểu rủi ro ngạt thở cho nhân viên làm việc với nitơ lỏng [7][2].
Quy trình video bảo quản lạnh các dòng tế bào động vật có vú
Kết luận và Điểm chính cần lưu ý
Dưới đây là tóm tắt nhanh các bước và khuyến nghị thiết yếu để bảo quản lạnh hiệu quả trong sản xuất thịt nuôi cấy:
- Thu hoạch tế bào: Thu thập tế bào trong giai đoạn tăng trưởng logarit của chúng, đảm bảo tỷ lệ sống sót vượt quá 90%. Sử dụng 10% DMSO làm chất bảo vệ lạnh, mặc dù glycerol có thể là một lựa chọn thay thế cho các dòng tế bào nhạy cảm hơn [11][1].
- Làm lạnh và Lưu trữ: Duy trì tốc độ làm lạnh được kiểm soát và nhanh chóng chuyển các lọ vào kho lưu trữ nitơ lỏng pha hơi để bảo vệ tính toàn vẹn của tế bào [11]
Một nghiên cứu của Roka Kakehi và cộng sự nhấn mạnh tầm quan trọng của độ chính xác trong bảo quản lạnh [10]:
"Đảm bảo nguồn tế bào đáng tin cậy và nhất quán bằng cách sử dụng bảo quản lạnh sẽ cho phép chúng tôi tăng nguồn cung ổn định của các tế bào tiềm năng cho sản xuất thịt nuôi cấy." - Roka Kakehi và cộng sự, Đại học Y khoa Phụ nữ Tokyo
- Quá trình rã đông: Rã đông tế bào trong bể nước 37°C trong khoảng hai phút, dừng lại khi 80% băng đã tan chảy. Điều này giảm độc tính của DMSO và cải thiện khả năng phục hồi tế bào [1]. Tiếp theo là kiểm tra khả năng sống sót sau rã đông để đảm bảo thành công và điều chỉnh các quy trình trong tương lai.
Các phương pháp này hoạt động song song với các thực hành kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Luôn dán nhãn lọ chính xác, duy trì hồ sơ có tổ chức và thực hiện kiểm tra kỹ lưỡng trước khi lưu trữ dài hạn [11]. Đối với nhu cầu bảo quản lạnh chuyên biệt, các nền tảng như
Câu hỏi thường gặp
Lợi ích của việc sử dụng môi trường hóa học xác định để bảo quản lạnh các dòng tế bào trong sản xuất thịt nuôi cấy là gì?
Môi trường hóa học xác định mang lại nhiều lợi ích khi bảo quản lạnh các dòng tế bào cho sản xuất thịt nuôi cấy. Bằng cách loại bỏ các thành phần không xác định, như huyết thanh có nguồn gốc từ động vật, chúng đảm bảo kết quả nhất quán và có thể dự đoán được - một yếu tố quan trọng để duy trì độ tin cậy lâu dài của các dòng tế bào.
Một lợi thế quan trọng khác là giảm nguy cơ ô nhiễm và biến đổi. Điều này không chỉ hỗ trợ các tiêu chuẩn chất lượng và an toàn cao hơn mà còn hoàn toàn phù hợp với độ chính xác và khả năng mở rộng cần thiết để đáp ứng cả yêu cầu quy định và kỳ vọng của người tiêu dùng trong ngành công nghiệp thịt nuôi cấy.
Lựa chọn chất bảo vệ đông lạnh ảnh hưởng như thế nào đến sự sống sót của tế bào trong quá trình đông lạnh và rã đông?
Lựa chọn chất bảo vệ đông lạnh là một yếu tố quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe tế bào trong quá trình đông lạnh và rã đông. Hai lựa chọn được sử dụng rộng rãi là dimethyl sulfoxide (DMSO) và glycerol, mỗi loại có đặc điểm riêng biệt. DMSO được biết đến với khả năng thâm nhập tế bào nhanh chóng và cung cấp sự bảo vệ mạnh mẽ. Tuy nhiên, nó đi kèm với một cảnh báo: ở nồng độ cao hoặc khi tiếp xúc kéo dài, nó có thể trở nên độc hại, có thể làm giảm khả năng sống sót của tế bào.
Glycerol, ngược lại, ít độc hại hơn và có thể được áp dụng trực tiếp.Nhược điểm của nó nằm ở tốc độ thâm nhập tế bào chậm hơn, điều này có thể dẫn đến sự bảo vệ ít tức thì hơn so với DMSO.
Đạt được sự cân bằng đúng là rất quan trọng. Điều chỉnh đúng nồng độ và thời gian tiếp xúc của chất bảo vệ lạnh giúp bảo vệ tế bào trong khi giảm thiểu nguy cơ độc tính. Ngoài ra, tuân thủ các thực hành tốt nhất về tốc độ làm lạnh và điều kiện lưu trữ là cần thiết để đảm bảo tỷ lệ phục hồi cao nhất có thể sau khi rã đông.
Tại sao việc kiểm soát tốc độ làm lạnh trong quá trình bảo quản lạnh lại quan trọng?
Duy trì tốc độ làm lạnh ổn định, thường là giữa –1°C và –3°C mỗi phút, là chìa khóa để giữ cho tế bào sống sót. Làm lạnh dần dần cho phép tế bào mất nước ở một tốc độ kiểm soát, giảm khả năng hình thành các tinh thể băng có hại, có thể xé rách hoặc làm hỏng màng tế bào.
Cách tiếp cận đo lường này bảo vệ cấu trúc của tế bào, tăng cường khả năng sống sót và chức năng của chúng sau khi rã đông.Tuân thủ các quy trình làm lạnh chính xác là điều cần thiết để đảm bảo lưu trữ và phục hồi lâu dài thành công các dòng tế bào.
