सेल लाइनों के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन प्रोटोकॉल

Q: What are the advantages of using chemically defined media for cryopreserving cell lines in cultivated meat production?

Chemically defined media bring multiple benefits when it comes to cryopreserving cell lines for cultivated meat production. By removing undefined components, like animal-derived serum, they ensure consistent and predictable outcomes - a crucial factor for maintaining the long-term reliability of cell lines. Another key advantage is the reduced risk of contamination and variability. This not only supports higher quality and safety standards but also aligns perfectly with the precision and scalability required to meet both regulatory demands and consumer expectations in the cultivated meat industry.

Q: How does the choice of cryoprotectant influence cell survival during freezing and thawing?

The choice of cryoprotectant is a key factor in preserving cell health during freezing and thawing. Two widely used options are dimethyl sulfoxide (DMSO) and glycerol , each with distinct characteristics. DMSO is known for its ability to penetrate cells quickly and provide strong protection. However, it comes with a caveat: at high concentrations or with extended exposure, it can become toxic, potentially lowering cell viability. Glycerol, in contrast, is less toxic and can be applied directly. Its downside lies in its slower rate of cell penetration, which may result in less immediate protection compared to DMSO. Achieving the right balance is crucial. Properly adjusting the concentration and exposure time of the cryoprotectant helps safeguard cells while minimising the risk of toxicity. Additionally, adhering to best practices for cooling rates and storage conditions is essential to ensure the highest possible recovery rates after thawing.

Q: Why is it important to control the cooling rate during cryopreservation?

Maintaining a steady cooling rate, usually between –1°C and –3°C per minute , is key to keeping cells viable. Cooling gradually allows cells to dehydrate at a controlled pace, reducing the chance of harmful ice crystals forming, which can tear or damage cell membranes. This measured approach safeguards the cells' structure, boosting their survival and functionality once thawed. Following precise cooling protocols is essential to ensure successful long-term storage and recovery of cell lines.

क्रायोप्रीज़र्वेशन जीवित कोशिकाओं को अल्ट्रा-लो तापमान पर फ्रीज़ करने और स्टोर करने की प्रक्रिया है ताकि समय के साथ उनकी जीवंतता बनाए रखी जा सके। यह विधि उगाए गए मांस के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है, स्थिर, सुसंगत कोशिका रेखाओं को सुनिश्चित करती है और संदूषण या उपकरण विफलता से होने वाले नुकसान से सुरक्षा प्रदान करती है। मुख्य चरणों में शामिल हैं:

तैयारी: कोशिकाओं को उनके विकास चरण के दौरान इकट्ठा करें, जीवंतता की जांच करें (≥90% का लक्ष्य रखें), और उन्हें DMSO या ग्लिसरॉल जैसे क्रायोप्रोटेक्टेंट के साथ फ्रीज़िंग मीडिया में तैयार करें।
फ्रीज़िंग: बर्फ के क्रिस्टल के नुकसान से बचने के लिए नियंत्रित ठंडा करने की दर (-1°C से -3°C प्रति मिनट) का उपयोग करें। दीर्घकालिक संरक्षण के लिए कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन वाष्प (-135°C से -190°C) में स्टोर करें।
थॉइंग: क्रायोप्रोटेक्टेंट की विषाक्तता को कम करने के लिए कोशिकाओं को 37°C के पानी के स्नान में जल्दी से पिघलाएं, फिर उन्हें रिकवरी के लिए विकास मीडिया में स्थानांतरित करें।
गुणवत्ता नियंत्रण: लेबल वायल को सही ढंग से लगाएं, भंडारण की स्थितियों की निगरानी करें, और सफल संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए थॉ के बाद जीवितता का परीक्षण करें।

Complete Cryopreservation Protocol for Cell Lines: 4-Step Process from Preparation to Storage — कोशिका रेखाओं के लिए पूर्ण क्रायोप्रिजर्वेशन प्रोटोकॉल: तैयारी से भंडारण तक 4-चरणीय प्रक्रिया

क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए कोशिकाओं की तैयारी

कोशिका कटाई और जीवितता जांच

थॉ के बाद सबसे अच्छी वसूली सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं को उनके लॉगरिदमिक (लॉग) वृद्धि चरण के दौरान काटें। चिपकने वाली कोशिका रेखाओं के लिए, यह आमतौर पर तब होता है जब वे 80–90% संकुलता तक पहुँच जाते हैं ^[2]^[3]^[6].

कोशिकाओं की जीवितता की जांच करने के लिए ट्रिपैन ब्लू निषेध विधि का उपयोग करें। कोशिका निलंबन के साथ 0.4% ट्रिपैन ब्लू के समान भाग (1:1) मिलाएं, फिर हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।जीवित कोशिकाएँ रंगद्रव्य को बाहर निकालेंगी और सूक्ष्मदर्शी के नीचे उज्ज्वल दिखाई देंगी, जबकि गैर-जीवित कोशिकाएँ नीले रंग में रंग जाएँगी ^[4]। आदर्श रूप से, सर्वोत्तम वसूली दरों के लिए कम से कम 90% जीवितता का लक्ष्य रखें, हालांकि कुछ प्रोटोकॉल न्यूनतम 75% स्वीकार कर सकते हैं ^[1]^[2]^[3]^[5].

कटाई से पहले, बैक्टीरियल या फंगल संदूषण की जांच के लिए एक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें। स्वस्थ निलंबन कोशिकाएँ उल्टे चरण-प्रतिबिंब सूक्ष्मदर्शी के नीचे उज्ज्वल, गोल, और अपवर्तक दिखाई देनी चाहिए ^[2]^[3].

एक बार जब कोशिकाएँ आवश्यक जीवितता मानकों को पूरा कर लें, तो पूर्व-फ्रीज़िंग चरणों पर आगे बढ़ें।

फ्रीज़िंग से पहले की तैयारी

चिपकने वाले कोशिकाओं के लिए, कोमल विघटन विधियों का उपयोग करें, जैसे ट्रिप्सिन या ट्रिपल एक्सप्रेस, और कोशिका झिल्ली को नुकसान से बचाने के लिए इंक्यूबेशन समय को सीमित करें ^[5]. कोशिकाओं को 1 × 10⁶ से 1 × 10⁷ कोशिकाएँ/mL की सांद्रता पर तैयार करें, जो कोशिका रेखा पर निर्भर करता है ^[1]^[6]. एलीक्वोट करते समय, सुनिश्चित करें कि कोशिका निलंबन को क्रायोवायल्स में समान वितरण बनाए रखने के लिए बार-बार मिलाया जाए ^[5].

फ्रीज़िंग प्रक्रिया शुरू होने से पहले क्रायोप्रोटेक्टेंट की विषाक्तता को कम करने के लिए पुनः निलंबन के दौरान फ्रीज़िंग मीडिया को 2°C से 8°C के बीच ठंडा रखें ^[5]. एक बार जब कोशिकाएँ फ्रीज़िंग मीडिया में निलंबित हो जाएँ, तो जल्दी से फ्रीज़िंग प्रोटोकॉल पर आगे बढ़ें ^[1].हमेशा कोशिकाओं को सबसे कम संभव पासेज संख्या पर क्रायोप्रिजर्व करें ताकि आनुवंशिक परिवर्तन या आकृति संबंधी परिवर्तनों के जोखिम को कम किया जा सके ^[5]^[7].

क्रायोप्रोटेक्टेंट और फ्रीजिंग मीडिया का चयन

क्रायोप्रोटेक्टेंट विकल्प और उनके कार्य

डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) को एक क्रायोप्रोटेक्टेंट के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, आमतौर पर 10% की सांद्रता पर ^[2]। यह कोशिका झिल्ली में प्रवेश करके और फ्रीजिंग के दौरान बर्फ के निर्माण को कम करके काम करता है। हालांकि, DMSO कमरे के तापमान पर कोशिकाओं के लिए विषैला हो सकता है, इसलिए तेजी से पिघलाना आवश्यक है ताकि संपर्क को न्यूनतम किया जा सके और इसे जल्दी से पतला किया जा सके ^[1].

ग्लिसरॉल DMSO के प्रति संवेदनशील सेल लाइनों के लिए एक उपयोगी विकल्प के रूप में कार्य करता है, आमतौर पर 5% से 15% की सांद्रता में उपयोग किया जाता है ^[8]।यह विशेष रूप से उन सेल प्रकारों के लिए प्रभावी है जहाँ DMSO अवांछित विभेदन का कारण बन सकता है ^[3], और इसकी विषाक्तता DMSO की तुलना में कम होती है।

संवर्धित मांस अनुप्रयोगों में, पारंपरिक फ्रीजिंग प्रोटोकॉल अक्सर 90% फेटल बोवाइन सीरम (FBS) और 10% DMSO के मिश्रण का उपयोग करते हैं ^[1]। हालाँकि, पशु-व्युत्पन्न घटकों पर निर्भरता इन विधियों को पैमाने पर और नियामक स्वीकृति के मामले में सीमित करती है ^[9]। इन समस्याओं को हल करने के लिए, रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया - जैसे Synth-a-Freeze या Recovery Cell Culture Medium - एक पशु-घटक-मुक्त विकल्प प्रदान करते हैं। ये मीडिया उच्च पोस्ट-थॉ सेल जीवितता बनाए रखते हैं जबकि पशु-उत्पत्ति घटकों से संबंधित चुनौतियों को पार करते हैं ^[9]।

फ्रीज़िंग मीडिया की तुलना

यहाँ विभिन्न फ्रीज़िंग मीडिया के लाभ और सीमाओं का विवरण दिया गया है जो खेती की गई मांस उत्पादन में उपयोग किए जाते हैं:

मीडिया	लाभ	हानियाँ	खेती की गई मांस के लिए उपयुक्तता
10% DMSO in FBS-DMEM	स्थापित प्रोटोकॉल ^[1]	पशु-व्युत्पन्न घटक शामिल हैं; बैच परिवर्तनशीलता ^[9]	सीमित स्केलेबिलिटी
Synth-a-Freeze	रासायनिक रूप से परिभाषित; लगातार गुणवत्ता; पशु घटकों से मुक्त ^[9]	उच्च प्रारंभिक लागत ^[9]	हाँ
रिकवरी सेल कल्चर मीडिया	उपयोग में आसान; त्वरित पुनर्प्राप्ति के लिए डिज़ाइन किया गया ^[9]	विशिष्ट सेल लाइनों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है	हाँ
FBS में 10% ग्लिसरॉल	DMSO-संवेदनशील कोशिकाओं के लिए विकल्प ^[1]	पशु-उत्पत्ति सीरम पर निर्भर ^[9]	सीमित स्केलेबिलिटी

फरवरी 2023 में, टोक्यो महिला चिकित्सा विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं ने, जिनका नेतृत्व हिरोनोबू टाकाहाशी ने किया, सही फ्रीजिंग मीडिया चुनने के महत्व को प्रदर्शित किया।CELLBANKER 1 और 2 का उपयोग करते हुए, उन्होंने प्राथमिक गाय के मायोजेनिक कोशिकाओं को -80°C पर एक वर्ष तक सफलतापूर्वक क्रायोप्रिजर्व किया। आश्चर्यजनक रूप से, इन कोशिकाओं ने पिघलने के बाद प्रोलिफरेट और संकुचन मांसपेशी ऊतकों में विभाजित होने की अपनी क्षमता को बनाए रखा, जिसमें सार्कोमेर संरचनाएं intact थीं ^[10].

कुल्टिवेटेड मांस उत्पादन के लिए, रासायनिक रूप से परिभाषित और GMP-अनुरूप मीडिया को बढ़ती प्राथमिकता दी जा रही है। जैसा कि STEMCELL Technologies ने उजागर किया है:

कोशिका और जीन चिकित्सा जैसे अत्यधिक विनियमित क्षेत्रों में, यह अनुशंसा की जाती है कि GMP-निर्मित, पूरी तरह से परिभाषित क्रायोप्रिजर्वेशन मीडिया का उपयोग किया जाए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उत्पाद लगातार गुणवत्ता मानकों के अनुसार निर्मित और नियंत्रित किए जाते हैं ^[9]।

जैसे प्लेटफार्म Cellbase अब सत्यापित, GMP-अनुरूप फ्रीजिंग मीडिया प्रदान करते हैं जो विशेष रूप से उगाए गए मांस उत्पादन की मांगों को पूरा करने के लिए तैयार किया गया है।

क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रिया और कूलिंग दरें

चरण-दर-चरण फ्रीजिंग प्रोटोकॉल

सफल क्रायोप्रिजर्वेशन की कुंजी -1°C से -3°C प्रति मिनट^[2] की स्थिर कूलिंग दर बनाए रखने में है। यह क्रमिक प्रक्रिया पानी को कोशिकाओं से धीरे-धीरे बाहर निकलने की अनुमति देती है, जिससे हानिकारक अंतःकोशीय बर्फ के क्रिस्टल बनने से रोका जा सकता है जो कोशिका झिल्ली को फाड़ सकते हैं^[1]।

कोशिकाओं को 150 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करके शुरू करें^[3]। एक बार सेंट्रीफ्यूज होने के बाद, कोशिका पैलेट को 10% DMSO वाले ठंडे फ्रीजिंग मीडिया में पुनः निलंबित करें, जिसकी सांद्रता 2–4×10⁶ कोशिकाएँ/mL^[3] है।DMSO के संपर्क को कम करने के लिए, अगले चरण - फ्रीजिंग - की ओर तेजी से बढ़ें।

सेल सस्पेंशन को पूर्व-लेबल किए गए क्रायोजेनिक वायल में वितरित करें। प्रत्येक वायल में सेल लाइन का नाम, पासेज नंबर, लॉट नंबर, सेल सांद्रता, और फ्रीजिंग की तारीख जैसे आवश्यक विवरण स्पष्ट रूप से इंगित होने चाहिए^[3]। वायल तैयार होने के बाद, उपयुक्त कूलिंग उपकरण का चयन और उपयोग करने का समय है।

कूलिंग उपकरण और तकनीकें

वायल को तुरंत नियंत्रित दर कूलिंग उपकरण में रखें। पैसिव फ्रीजिंग कंटेनर, जैसे कि Nalgene "Mr Frosty" (जो आइसोप्रोपेनॉल का उपयोग करता है) या Corning "CoolCell", लोकप्रिय विकल्प हैं। ये उपकरण -80°C फ्रीजर में रखे जाने पर लगभग 1°C प्रति मिनट की कूलिंग दर प्राप्त कर सकते हैं^[2]।

बड़े पैमाने पर संचालन के लिए जहां स्थिरता महत्वपूर्ण है, एक प्रोग्रामेबल दर-नियंत्रित फ्रीजर सबसे अच्छा विकल्प है। Sigma-Aldrich के अनुसार:

ECACC नियमित रूप से एक प्रोग्रामेबल दर-नियंत्रित फ्रीजर का उपयोग करता है। यह कोशिकाओं को फ्रीज करने का सबसे विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय तरीका है^[3].

लगभग 24 घंटे -80°C पर रखने के बाद, वायल को तरल नाइट्रोजन के वाष्प चरण में स्थानांतरित करें, जहां तापमान -135°C और -190°C के बीच होता है, दीर्घकालिक भंडारण के लिए^[4]। कोशिकाओं को -80°C पर एक सप्ताह से अधिक समय तक स्टोर करने से बचें, क्योंकि इससे उनकी जीवंतता प्रभावित हो सकती है। अनिश्चितकालीन संरक्षण के लिए -135°C से नीचे के तापमान आवश्यक हैं^[2]। तरल चरण के बजाय वाष्प चरण का उपयोग करने से क्रॉस-संक्रमण का जोखिम कम होता है जबकि पर्याप्त रूप से कम तापमान बनाए रखा जाता है।

पिघलने और पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल

पिघलने की प्रक्रिया

कोशिकाओं को जल्दी पिघलाना विषैले क्रायोप्रोटेक्टेंट के संपर्क को सीमित करने और बर्फ के क्रिस्टल के कारण होने वाले नुकसान को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। सुरक्षा के लिए पूर्ण चेहरे का वाइज़र और इंसुलेटेड दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें। सबसे पहले, क्रायोवायल को तरल नाइट्रोजन से निकालें और किसी भी संचित दबाव को छोड़ने के लिए ढक्कन को थोड़ा ढीला करें। फिर, ढक्कन को फिर से कस लें।

वायल को 37°C के पानी के स्नान में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ढक्कन पानी की रेखा के ऊपर रहे। इसे 1-2 मिनट के लिए पिघलने दें, या जब तक केवल कुछ बर्फ के क्रिस्टल रह जाएं। एक बार पिघलने के बाद, वायल के बाहरी हिस्से को 70% अल्कोहल से पोंछें ताकि स्वच्छता बनी रहे।

वायल की सामग्री को 5-10 मीलि.लीटर पूर्व-गर्म ग्रोथ मीडियम वाले ट्यूब में स्थानांतरित करें। ओस्मोटिक शॉक को कम करने में मदद करने के लिए मीडियम को धीरे-धीरे डालें। यदि आप सस्पेंशन सेल लाइनों के साथ काम कर रहे हैं, तो कोशिका सस्पेंशन को तुरंत 300 × g पर 5 मिनट के लिए 4°C पर सेंट्रीफ्यूज करें।यह कदम कोशिकाओं को पैलेट करने में मदद करता है और क्रायोप्रोटेक्टेंट को हटा देता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, कोशिकाओं को ताजे माध्यम में फिर से निलंबित करें। चिपकने वाली कोशिकाओं के लिए, सेंट्रीफ्यूजेशन आमतौर पर आवश्यक नहीं होता है। इसके बजाय, कोशिकाओं को सीधे एक उपयुक्त संस्कृति पात्र में बोएं और पहले माध्यम परिवर्तन के दौरान किसी भी अवशिष्ट DMSO को हटा दें, जो आमतौर पर 24 घंटे बाद होता है।

थॉ के बाद मूल्यांकन

थॉ करने के तुरंत बाद, कोशिका जीवितता की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पुनर्प्राप्ति सफल रही है। इस मूल्यांकन के लिए ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करें। आदर्श रूप से, कोशिका जीवितता 90% से अधिक होनी चाहिए ^[11], लेकिन न्यूनतम 75% स्वीकार्य है। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं की जांच करें एक फेज-कॉन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे चिपकी हुई हैं, कोशिका घनत्व का मूल्यांकन करें, और किसी भी संदूषण के संकेतों की जांच करें।

सामान्य प्रजनन सुनिश्चित करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे अपनी अपेक्षित विशेषताओं को बनाए रखते हैं, कोशिकाओं की निगरानी जारी रखें 1–3 पासेज के माध्यम से।धीरे-धीरे ठीक होने वाली सेल लाइनों के लिए, आप प्रारंभिक भ्रूणीय गाय के सीरम की सांद्रता को लगभग 20% v/v तक बढ़ाकर जीवित रहने में सुधार कर सकते हैं।

भंडारण और दीर्घकालिक जीवितता

भंडारण की स्थिति और अवधि

दीर्घकालिक में सेल लाइन की जीवितता बनाए रखने के लिए, उन्हें -135°C से नीचे के तापमान पर संग्रहीत करना आवश्यक है ^[7]^[2]। यह सुनिश्चित करता है कि वे अनिश्चितकाल के लिए संरक्षित रहें।

संवर्धित मांस सेल लाइनों को संग्रहीत करने के लिए पसंदीदा विधि वाष्प चरण तरल नाइट्रोजन है। यह तकनीक -135°C और -190°C के बीच तापमान बनाए रखती है, जो दीर्घकालिक संरक्षण के लिए आदर्श है जबकि तरल चरण भंडारण की तुलना में सुरक्षा में वृद्धि प्रदान करती है।

यदि आपको -80°C पर कोशिकाओं को संग्रहीत करने की आवश्यकता है, तो इसे 24 घंटे से एक सप्ताह की अवधि तक सीमित रखें। इसके बाद, कोशिका की जीवितता में कमी आ सकती है।इस तापमान पर अस्थायी भंडारण के लिए, कोशिकाओं को यथाशीघ्र तरल नाइट्रोजन भंडारण में स्थानांतरित करें।

सुरक्षित भंडारण के लिए मानक निर्जंतुकीय क्रायोजेनिक वायल (1–2 मL) का उपयोग करें जिसमें आंतरिक थ्रेडिंग और एक ओ-रिंग हो।^[4]^[5]। हमेशा सील किए गए क्रायोवायल को नाइट्रोजन के तरल चरण के बजाय गैस चरण में रखें ताकि पिघलने के दौरान वायल विस्फोट के जोखिम को कम किया जा सके।^[5]। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि बल्क तरल नाइट्रोजन कंटेनर कम से कम आधे भरे रहें ताकि सुरक्षा बफर बनाए रखा जा सके।

अंत में, कोशिकाओं की दीर्घकालिक जीवंतता सुनिश्चित करने के लिए कठोर गुणवत्ता नियंत्रण उपाय महत्वपूर्ण हैं।

गुणवत्ता नियंत्रण जांच

संग्रहित सेल लाइनों की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए सख्त प्रोटोकॉल का पालन करें। प्रत्येक वायल को तरल नाइट्रोजन-प्रतिरोधी लेबल के साथ सटीक रूप से लेबलिंग करके शुरू करें।आवश्यक विवरण शामिल करें जैसे कि सेल लाइन पहचान, लॉट नंबर, पासेज नंबर, और फ्रीजिंग तिथि। प्रत्येक वायल के सटीक स्थान को रिकॉर्ड करने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक डेटाबेस बनाए रखें, जिससे भंडारण उपकरणों को खुला रखने का समय कम हो जाता है ^[7]^[2].

पूरी बैचों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए समर्पित करने से पहले, एक वायल की जीवितता को अल्पकालिक गैस चरण भंडारण के बाद परीक्षण करें। यह कदम यह पुष्टि करने में मदद करता है कि फ्रीजिंग प्रक्रिया सफल रही और किसी भी संभावित समस्याओं की पहचान करता है ^[4]^[7]^[2]। अत्यधिक मूल्यवान सेल स्टॉक्स के लिए, उपकरण विफलताओं या स्थानीय आपदाओं के खिलाफ सुरक्षा के लिए एक द्वितीयक स्थान पर डुप्लिकेट स्टोर करना समझदारी है ^[7]^[2]।

सभी भंडारण पात्रों को तापमान निगरानी प्रणालियों और अलार्मों से लैस करें ताकि तरल नाइट्रोजन के निम्न स्तर का पता लगाया जा सके ^[7]. इसके अतिरिक्त, भंडारण क्षेत्रों में ऑक्सीजन अलार्म स्थापित करें, जो 18% ऑक्सीजन (v/v) पर सक्रिय होंगे, ताकि तरल नाइट्रोजन के साथ काम करने वाले कर्मचारियों के लिए दम घुटने के जोखिम को कम किया जा सके ^[7]^[2].

स्तनधारी कोशिका रेखाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन का वीडियो प्रोटोकॉल

निष्कर्ष और मुख्य बिंदु

यहाँ पर खेती की गई मांस उत्पादन में प्रभावी क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए आवश्यक कदमों और सिफारिशों का त्वरित पुनरावलोकन है:

कोशिका संग्रह: कोशिकाओं को उनके लघुगणकीय वृद्धि चरण के दौरान एकत्र करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि जीवित रहने की दर 90% से अधिक हो। क्रायोप्रोटेक्टेंट के रूप में 10% DMSO का उपयोग करें, हालांकि अधिक नाजुक कोशिका रेखाओं के लिए ग्लिसरॉल एक विकल्प हो सकता है ^[11]^[1].
ठंडा करना और भंडारण: कोशिका की अखंडता की रक्षा के लिए नियंत्रित ठंडा करने की दर बनाए रखें और शीशियों को वाष्प-चरण तरल नाइट्रोजन भंडारण में तेजी से स्थानांतरित करें ^[11]

रोका काकेही और अन्य द्वारा किए गए एक अध्ययन में क्रायोप्रीज़र्वेशन में सटीकता के महत्व को उजागर किया गया है ^[10]:

"क्रायोप्रीज़र्वेशन का उपयोग करके कोशिकाओं का एक विश्वसनीय और स्थिर स्रोत सुनिश्चित करना हमें उगाए गए मांस उत्पादन के लिए आशाजनक कोशिकाओं की स्थिर आपूर्ति बढ़ाने की अनुमति देगा।" - रोका काकेही और अन्य, टोक्यो महिला चिकित्सा विश्वविद्यालय

पिघलाने की प्रक्रिया: कोशिकाओं को 37°C के पानी के स्नान में लगभग दो मिनट के लिए पिघलाएं, जब तक कि बर्फ का 80% पिघल न जाए तब रुकें। यह DMSO विषाक्तता को कम करता है और कोशिका की वसूली में सुधार करता है ^[1]. सफलता सुनिश्चित करने और भविष्य की प्रक्रियाओं को ठीक करने के लिए पिघलने के बाद की जीवितता जांच करें।

ये तरीके सख्त गुणवत्ता नियंत्रण प्रथाओं के साथ मिलकर काम करते हैं। हमेशा वायल को सही ढंग से लेबल करें, व्यवस्थित रिकॉर्ड बनाए रखें, और दीर्घकालिक भंडारण से पहले Thorough checks लागू करें ^[11]। विशेष क्रायोप्रिजर्वेशन आवश्यकताओं के लिए, प्लेटफार्म जैसे Cellbase शोधकर्ताओं को नियंत्रित दर फ्रीजर, क्रायोजेनिक भंडारण प्रणालियों, और अन्य आवश्यक उपकरणों के विश्वसनीय आपूर्तिकर्ताओं से जोड़ते हैं जो उगाए गए मांस उत्पादन के लिए अनुकूलित हैं।

अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

उगाए गए मांस उत्पादन में सेल लाइनों को क्रायोप्रिजर्व करने के लिए रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया का उपयोग करने के क्या लाभ हैं?

रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया उगाए गए मांस उत्पादन के लिए सेल लाइनों को क्रायोप्रिजर्व करने के मामले में कई लाभ लाते हैं। जानवरों से प्राप्त सीरम जैसे अपरिभाषित घटकों को हटाकर, वे सुसंगत और पूर्वानुमानित परिणाम सुनिश्चित करते हैं - जो सेल लाइनों की दीर्घकालिक विश्वसनीयता बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है।

एक और प्रमुख लाभ यह है कि यह संदूषण और परिवर्तनशीलता के जोखिम को कम करता है। यह न केवल उच्च गुणवत्ता और सुरक्षा मानकों का समर्थन करता है बल्कि यह संवर्धित मांस उद्योग में नियामक मांगों और उपभोक्ता अपेक्षाओं को पूरा करने के लिए आवश्यक सटीकता और पैमाने के साथ भी पूरी तरह से मेल खाता है।

फ्रीजिंग और थॉविंग के दौरान सेल जीवित रहने पर क्रायोप्रोटेक्टेंट के चयन का क्या प्रभाव पड़ता है?

क्रायोप्रोटेक्टेंट का चयन फ्रीजिंग और थॉविंग के दौरान सेल स्वास्थ्य को बनाए रखने में एक प्रमुख कारक है। दो व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले विकल्प हैं डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) और ग्लिसरोल, प्रत्येक की अपनी विशिष्ट विशेषताएँ हैं। DMSO को सेल में तेजी से प्रवेश करने और मजबूत सुरक्षा प्रदान करने की क्षमता के लिए जाना जाता है। हालाँकि, इसमें एक चेतावनी है: उच्च सांद्रता या लंबे समय तक संपर्क में रहने पर, यह विषाक्त हो सकता है, जिससे सेल जीवित रहने की क्षमता कम हो सकती है।

इसके विपरीत, ग्लिसरोल कम विषाक्त है और इसे सीधे लागू किया जा सकता है।इसका नकारात्मक पहलू इसकी धीमी सेल प्रवेश दर में है, जो DMSO की तुलना में कम तात्कालिक सुरक्षा का परिणाम हो सकता है।

सही संतुलन प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। क्रायोप्रोटेक्टेंट की सांद्रता और एक्सपोजर समय को सही ढंग से समायोजित करना कोशिकाओं की सुरक्षा में मदद करता है जबकि विषाक्तता के जोखिम को कम करता है। इसके अतिरिक्त, ठंडा करने की दरों और भंडारण की स्थितियों के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का पालन करना आवश्यक है ताकि पिघलने के बाद उच्चतम संभव वसूली दर सुनिश्चित की जा सके।

क्रायोप्रीज़र्वेशन के दौरान ठंडा करने की दर को नियंत्रित करना क्यों महत्वपूर्ण है?

एक स्थिर ठंडा करने की दर बनाए रखना, आमतौर पर –1°C और –3°C प्रति मिनट के बीच, कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए कुंजी है। धीरे-धीरे ठंडा करने से कोशिकाओं को नियंत्रित गति से निर्जलीकरण करने की अनुमति मिलती है, हानिकारक बर्फ के क्रिस्टल बनने की संभावना को कम करता है, जो कोशिका झिल्ली को फाड़ या नुकसान पहुंचा सकते हैं।

यह मापी गई विधि कोशिकाओं की संरचना की सुरक्षा करती है, उनके जीवित रहने और कार्यक्षमता को बढ़ाती है जब वे पिघलती हैं।सटीक कूलिंग प्रोटोकॉल का पालन करना सेल लाइनों के सफल दीर्घकालिक भंडारण और पुनर्प्राप्ति के लिए आवश्यक है।