Jika anda membandingkan nilai kLa tanpa memadankan kaedah, medium, suhu, dan tindak balas probe, anda boleh membuat keputusan peningkatan skala yang salah.
Bagi jurutera bioproses, saintis kultur sel, dan pasukan R&D daging ternakan, jawapan ringkasnya adalah mudah: pengeluaran gas statik adalah terbaik untuk penanda aras vesel, manakala kaedah keseimbangan oksigen dinamik dan gas keluar lebih berguna apabila anda mahukan data yang berfokuskan proses di bawah keadaan sup hidup. Nombor kLa berasaskan air boleh mengelirukan, kelewatan probe boleh memesongkan kadar pemindahan yang cepat, dan bahan tambahan media seperti Pluronic F-68 boleh mengurangkan kLa sebanyak 50% atau lebih dalam beberapa susunan.
Berikut adalah artikel dalam satu laluan:
- kLa bukanlah sasaran yang berdiri sendiri. Saya akan menggunakannya bersama P/V, had ricih, aliran gas, dan masa pencampuran.
- Penyahgasan statik memberikan perbandingan perkakasan yang bersih, tetapi ia mengabaikan KAMI dan tidak mencerminkan budaya aktif.
- Kaedah dinamik menjejaki pemindahan oksigen semasa budaya dan lebih hampir kepada apa yang anda jalankan pada skala besar, walaupun jeda dalam pengudaraan boleh menekan sel.
- Kaedah keseimbangan oksigen menggunakan data gas masuk dan keluar dan sesuai untuk kapal yang lebih besar, tetapi mereka memerlukan analisis gas yang ketat.
- Pengoksidaan sulfit dan kaedah langkah tekanan adalah terutamanya untuk pencirian peralatan, bukan untuk sup daging yang ditanam secara langsung.
- Masa tindak balas probe penting: probe DO optik sering bertindak balas dalam 3-10 s , manakala probe polarografik sering 8-30 s.
- Suhu dan medium penting: kLa yang diukur dalam air pada 20°C tidak memetakan dengan bersih kepada medium budaya pada 37°C .
- Julat yang dilaporkan dalam artikel adalah 50-200 h⁻¹ pada 2-10 L dan 80-300 h⁻¹ pada 50-500 L , tetapi hanya jika asas ujian penuh sepadan.
H.E.L Menjelaskan | Mencapai Pemindahan Oksigen yang Konsisten: Kesan kLa pada Penskalaan Fermentasi
sbb-itb-ffee270
Perbandingan Pantas
Kaedah Pengukuran kLa untuk Penskalaan Bioreaktor: Perbandingan Sisi-ke-Sisi
| Kaedah | Terbaik untuk | Kelemahan utama | Padanan proses |
|---|---|---|---|
| Pengeluaran gas statik | Perbandingan kapal dan sparger | Tiada permintaan oksigen sel hidup | Rendah ke sederhana |
| Kaedah dinamik | Kerja penskalaan kultur aktif | Penghentian pengudaraan boleh mengganggu sel | Tinggi |
| Seimbang oksigen | Pemantauan skala lebih besar | Memerlukan data gas buangan yang ketat | Tinggi |
| Pengoksidaan sulfit | Pemeriksaan perkakasan pemindahan maksimum | Tidak seperti media proses | Rendah |
| Langkah tekanan | Pencirian kapal besar | Memerlukan persediaan bertekanan | Sederhana |
Jika saya menetapkan rancangan peningkatan skala, terutamanya apabila beralih kepada sistem skala perintis, saya akan menganggap pemilihan kaedah sebagai sebahagian daripada pemeriksaan kualiti data, bukan sebagai pemikiran selepas.
2. Kaedah pengukuran kLa utama yang digunakan dalam kajian bioreaktor
Literatur cenderung mengelompokkan pengukuran kLa kepada tiga keluarga kaedah utama: pengeluaran gas statik, kaedah dinamik dan keseimbangan oksigen, dan teknik kimia atau berasaskan tekanan. Setiap satu melihat pemindahan oksigen dari sudut yang sedikit berbeza. Ini penting, kerana kaedah itu sendiri boleh membentuk bagaimana data penskalaan dibaca.
2.1 Pengeluaran gas statik
Pengeluaran gas statik bermula dengan penyahoksigenan cecair, selalunya dengan nitrogen. Pengudaraan kemudian dihidupkan semula, dan pemulihan oksigen terlarut (DO) dipantau dari masa ke masa. kLa dikira dari kadar kenaikan DO tersebut.
Kerana ia tidak memerlukan sel hidup atau reagen berbahaya, kaedah ini adalah cara yang mudah untuk menanda aras bioreaktor. Kelemahannya ialah ia tidak mencerminkan respirasi sel atau cara sifat sup berubah semasa pertumbuhan kultur.Keputusan juga bergantung pada medium, reka bentuk impeller, reka bentuk sparger, aliran gas, suhu, dan penggunaan antifoam. Sebagai contoh, dalam tangki pengaduk 400 L, menambah Pluronic F-68 pada 0.02 g/L boleh mengurangkan kLa sekurang-kurangnya 50% berbanding dengan rujukan tanpa aditif [2] .
Satu isu praktikal adalah dinamik probe. Jika tindak balas sensor terlalu perlahan, kLa yang diukur akan terpesong dan memerlukan pembetulan [1].
2.2 Kaedah dinamik dan keseimbangan oksigen di bawah keadaan proses
Jika matlamatnya adalah relevan proses dan bukan penanda aras air bersih, kaedah dinamik biasanya memberikan lebih banyak maklumat. Dalam versi yang paling biasa, pengudaraan dihentikan sebentar supaya respirasi sel menurunkan DO. Pengudaraan kemudian dipulihkan, dan pemulihan transien dianalisis. Ini menjadikan pengukuran lebih hampir kepada apa yang dilakukan oleh sup semasa larian sebenar.
Kaedah keseimbangan oksigen mengambil laluan yang berbeza.Sebaliknya mengganggu pengudaraan, ia menganggarkan kLa daripada OTR tolak OUR, biasanya dengan analisis gas buangan seperti spektrometri jisim [2]. Ia tidak invasif dan amat berguna dalam kapal yang lebih besar. Tetapi ada harga yang perlu dibayar: anda memerlukan perisian kawalan bioproses dan perkakasan analisis gas buangan serta data OUR yang boleh dipercayai.
Untuk kerja daging yang diternak, kaedah-kaedah ini berguna kerana ia mencerminkan pemindahan oksigen di bawah keadaan sup dan sel yang sama dilihat semasa peningkatan skala. Pertukaran ini agak jelas. Dalam kaedah dinamik, DO menurun semasa jeda pengudaraan, dan itu boleh menekan kultur jika gangguan berlanjutan terlalu lama.
Kaedah kimia dan langkah tekanan lebih digunakan untuk pencirian peralatan daripada untuk bacaan proses langsung.
2.3 Kaedah pengoksidaan sulfit dan langkah tekanan
Untuk penanda aras bukan biologi, dua kaedah lain sering muncul.Mereka baik untuk mencirikan perkakasan, tetapi mereka tidak secara langsung mewakili sup daging yang ditanam hidup.
Pengoksidaan sulfit menggunakan natrium sulfit, dioksidakan dengan kehadiran pemangkin, untuk menggunakan oksigen terlarut pada kadar dari mana kLa boleh dikira. Masalahnya mudah: cecair itu tidak mewakili media biologi, jadi hasilnya tidak diterjemahkan secara langsung kepada sup daging yang ditanam [2].
Kaedah langkah tekanan mengubah tekanan bekas secara berperingkat untuk mengalihkan kepekatan tepu oksigen (C*) di bawah undang-undang Henry. Itu mencipta daya pemindahan jisim tanpa mengubah kelajuan pengadukan atau kadar aliran gas [2]. Ia berguna apabila tekanan lebih mudah dikawal daripada pengadukan atau pengudaraan. Namun, ia memerlukan bekas yang dinilai tekanan dan perubahan tekanan yang dikawal ketat, yang mengehadkan penggunaan harian. Walaupun begitu, ia tetap menjadi kaedah penyelidikan yang berguna untuk pencirian peralatan.
3. Kekuatan, had, dan kebolehbandingan merentasi kaedah-kaedah
Nilai kLa yang diterbitkan hanya boleh dibandingkan apabila persediaan ujian dan andaian asas adalah sama. Malah suhu boleh mengubah keputusan dengan jumlah yang bermakna. Dan jika satu kertas kerja membetulkan masa tindak balas probe oksigen terlarut manakala yang lain tidak, nilai-nilai tersebut tidak boleh dianggap setara, walaupun persediaan yang lain kelihatan sama.
Jurang itu paling penting apabila anda memutuskan apakah nombor itu untuk . Adakah ia penanda aras perkakasan? Atau adakah ia metrik yang berfokuskan proses yang mencerminkan apa yang berlaku dalam kultur?
3.1 Di mana pengeluaran gas statik kekal sebagai kaedah rujukan
Pengeluaran gas statik masih merupakan kaedah pilihan untuk perbandingan perkakasan. Jika tujuannya adalah untuk membandingkan reka bentuk sparger, geometri impeller, atau konfigurasi vesel di bawah keadaan terkawal, ia melakukan tugas dengan baik.Ia mudah, boleh dihasilkan semula, dan tidak memerlukan sel hidup.
Kelemahannya adalah sama jelas: kLa yang diukur dalam air adalah peramal yang lemah bagi pemindahan oksigen dalam media daging yang ditanam. Nilai dari air deionisasi memberitahu anda sesuatu yang berguna tentang bekas itu sendiri, tetapi jauh kurang tentang prestasi apabila medium sebenar digunakan.
Di situlah kaedah dinamik mula menjadi lebih penting. Apabila kerja beralih dari pencirian bekas kepada kultur hidup, kepentingan proses mula mengatasi kawalan sistem bersih.
3.2 Di mana kaedah profil oksigen dinamik dan terlarut menambah kepentingan proses
Kaedah dinamik lebih dekat dengan keadaan proses sebenar kerana mereka mengukur pemindahan oksigen semasa kultur aktif. Ini bermakna mereka menangkap kedua-dua permintaan oksigen dan sifat sebenar sup. Untuk kerja peningkatan skala, ini menjadikan hasilnya jauh lebih berguna daripada anggaran air bersih.
Pendekatan keseimbangan oksigen menambah bacaan berterusan dan tidak invasif di bawah keadaan operasi, walaupun ia bergantung pada analisis gas buangan yang tepat dan operasi yang stabil [2].
Perbezaan lebih mudah dilihat apabila kaedah-kaedah diletakkan bersebelahan.
3.3 Jadual perbandingan: kaedah sesuai untuk peningkatan skala daging yang diternak
| Kaedah | Prinsip | Data diperlukan | Andaian utama | Kekuatan | Keterbatasan | Kegunaan terbaik |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Pengeluaran gas statik | Kenaikan DO selepas penyingkiran N₂ dalam cecair bebas sel | Masa perjalanan DO, masa tindak balas probe | Cecair bercampur baik; tiada OUR | Mudah; boleh dihasilkan semula; tiada sel diperlukan | Mengetepikan OUR; sensitif kepada komposisi media dan kelewatan probe | Pencirian kapal awal; perbandingan perkakasan |
| Kaedah dinamik | Pemulihan DO semasa kultur aktif selepas pemberhentian pengudaraan singkat | Masa perjalanan DO, anggaran OUR | Kultur keadaan hampir stabil; pembetulan sensor digunakan | Mencerminkan keadaan sup dan sel sebenar | Jeda pengudaraan boleh menekan kultur; sensitif terhadap kelewatan sensor | Pengoptimuman proses dan peningkatan skala semasa pertumbuhan aktif |
| Keseimbangan oksigen (analisis fasa gas) | Keseimbangan jisim O₂ antara gas masuk dan keluar | Kadar aliran gas dan kepekatan O₂ yang tepat | Operasi mantap | Tidak invasif; berterusan; tiada gangguan kultur | Memerlukan analisis gas buangan yang sangat tepat | Pemantauan pengeluaran berskala besar |
| Pengoksidaan sulfit | Pengoksidaan kimia natrium sulfit menggunakan O₂ | Kadar penggunaan sulfit | Kadar tindak balas terhad oleh pemindahan jisim | Berguna untuk kapasiti OTR maksimum | Tidak mewakili media biologi; boleh melebihkan anggaran kLa | Penanda aras peralatan sahaja; bukan untuk kerja kultur hidup |
| Kaedah tekanan dinamik (DPM) | Perubahan langkah tekanan untuk mengubah keterlarutan oksigen | Tekanan dan masa perjalanan DO | Tekanan seimbang lebih cepat daripada komposisi gas | Mengelakkan kelewatan fasa gas; sesuai untuk kapal besar | Memerlukan kapal bertekanan dan kawalan tekanan yang tepat | Pencirian skala besar |
Pilihan kaedah ini mempengaruhi bagaimana data kLa harus diubah menjadi sasaran peningkatan skala dan pemilihan peralatan.
4. Menggunakan data kLa dalam peningkatan skala dan pemilihan peralatan
4.1 Menetapkan sasaran peningkatan skala dari makmal ke skala perintis
Setelah anda mengukur kLa, tugas seterusnya adalah menukar nombor itu menjadi had operasi untuk pengadukan, aliran gas dan pencampuran. kLa harus dianggap sebagai satu kekangan, bukan keseluruhan keputusan. Ia perlu cukup tinggi untuk memenuhi permintaan oksigen, tetapi tidak terlalu tinggi sehingga proses melayang ke dalam rejim ricih yang sel anda tidak akan tahan.
Keseimbangan itu penting dalam daging yang diternak. Memegang kLa tetap pada skala yang lebih besar boleh mendorong anda ke arah kelajuan hujung impeller yang lebih tinggi dan, dengan itu, ricih yang lebih tinggi [4]. Dalam kultur sel mamalia, kelajuan hujung impeller 0.1-0.5 m/s sering digunakan untuk mengimbangi pemindahan oksigen terhadap tekanan ricih [5]. Jadi dalam praktiknya, kLa berada dalam tingkap operasi yang lebih luas yang juga merangkumi input kuasa per unit isipadu (P/V) , halaju gas permukaan dan masa pencampuran [4] [5] .
Penanda aras yang berguna membantu di sini. Dalam reaktor tangki kacau skala makmal 2-10 L, kLa sering berada dalam julat 50-200 h⁻¹. Dalam bekas skala perintis 50-500 L, julat biasa adalah 80-300 h⁻¹ [4] . Langkah utama adalah mencari pertindihan yang semua bekas boleh capai. Itulah yang mengubah sasaran peningkatan skala dari idea yang baik di atas kertas menjadi sesuatu yang boleh dijalankan.
4.2 Memilih sensor dan perkakasan untuk kerja kLa yang boleh dipercayai
Data peningkatan skala yang baik bermula dengan instrumen dan perkakasan gas yang tidak memutarbelitkan hasil.
Masa tindak balas sensor mempunyai kesan langsung terhadap ketepatan kLa.Dalam sistem high-kLa, gunakan probe DO respons pantas. Probe polarografik yang lambat memerlukan pembetulan dan boleh membaca kLa dengan kurang tepat. Probe polarografik biasanya mempunyai masa tindak balas 8-30 saat, manakala probe berasaskan pendarfluor optik bertindak balas dalam 3-10 saat [4]. Satu peraturan yang baik ialah masa tindak balas sensor sepatutnya kurang daripada satu per sepuluh pemalar masa pemindahan jisim (1/kLa) [1]. Jika anda tidak dapat memenuhi syarat itu, probe optik biasanya adalah pilihan yang lebih selamat.
Penyampaian gas adalah sama penting. Pengawal aliran jisim terma membantu mengekalkan aliran gas stabil, yang menjadikan pengukuran lebih konsisten. Pilihan sparger juga mempunyai kesan langsung pada kLa yang boleh dicapai [2][3] . Buih yang lebih kecil memberikan lebih banyak kawasan antara muka gas-cecair, tetapi ada satu kelemahan: bahan tambahan media boleh mengurangkan kLa dengan ketara [2].
5. Pengajaran utama untuk mentafsir pengukuran kLa
Secara keseluruhan, kaedah yang anda pilih harus sepadan dengan soalan peningkatan skala yang anda cuba jawab. Dalam praktiknya, ini bermakna anda perlu jelas sama ada anda memerlukan pencirian perkakasan atau data peningkatan skala berfokuskan proses.
Nilai kLa yang diukur dalam air pada 20°C tidak boleh dibawa terus ke media kultur pada 37°C. Pembetulan suhu sahaja mencipta kira-kira perbezaan 45% [4]. Dan kLa bukan sesuatu yang boleh anda ramalkan dengan teori sahaja. Setiap bioreaktor memerlukan kLa yang diukur sendiri [1].
Ini lebih penting lagi apabila anda bergerak dari skala makmal ke skala perintis. Pelepasan gas statik dalam penimbal yang sepadan dengan garam seperti PBS memberikan anda penanda aras peralatan yang bersih. Tetapi apabila skala meningkat, pengukuran dinamik dalam medium kultur sebenar memberitahu anda lebih banyak tentang apa yang akan dilakukan oleh proses dalam amalan, kerana bahan tambahan media boleh mengubah kLa dengan margin yang besar [4] . Jika anda bergantung pada nilai berasaskan air, anda boleh berakhir dengan menentukan kapasiti pemindahan oksigen secara berlebihan pada skala.
Semakan terakhir adalah sama ada kLa berada dalam tingkap operasi penuh. Anggap kLa sebagai satu kekangan proses, bukan sasaran tersendiri. Gunakannya bersama P/V dan had ricih apabila memilih sistem bioreaktor terbaik dan strategi pengadukan [4] .
Soalan Lazim
Kaedah kLa mana yang patut saya gunakan untuk peningkatan skala?
Kaedah pengeluaran gas dinamik adalah cara yang paling banyak digunakan untuk menentukan kLa dalam bioreaktor tangki kacau, dan ia adalah kaedah yang paling disyorkan oleh pasukan dalam amalan. Ia agak cepat, dan ia mengelakkan keperluan untuk bahan kimia berbahaya atau organisma hidup.
Untuk peningkatan skala daging yang diternak, adalah lebih baik untuk mengukur tanpa sel supaya metabolisme sel tidak mengganggu hasilnya. Gunakan penimbal PBS pada 37 °C untuk lebih sepadan dengan medium proses. Dan jika probe oksigen terlarut mempunyai masa tindak balas yang perlahan, gunakan pembetulan. Jika tidak, anda boleh berakhir dengan meremehkan kLa.
Mengapa nilai kLa berasaskan air sering mengelirukan?
Nilai kLa berasaskan air boleh mengelirukan kerana ia tidak mencerminkan tingkah laku fizikokimia media kultur sel sebenar. Media sebenar bukan sekadar air dengan nutrien yang dicampur. Kepekatan garam, kelikatan, ketegangan permukaan, dan antifoam semuanya mengubah pemindahan jisim oksigen dengan cara yang ujian air tidak akan tunjukkan.
Jurang itu penting. Jika anda mengabaikan kesan media, anggaran penghantaran oksigen anda boleh menyimpang jauh dari apa yang dilakukan oleh bioreaktor dalam amalan. Contoh yang baik ialah antifoam: ia boleh meningkatkan penggabungan gelembung, mengurangkan kawasan antara muka, dan menurunkan kLa sehingga 50%. Dalam pengeluaran daging yang ditanam, itu bukanlah perincian kecil. Ia boleh mengubah sama ada proses mempunyai ruang kepala pemindahan oksigen yang mencukupi atau berjalan lebih dekat ke hadnya.
Bagaimana kelewatan probe dan bahan tambahan media mempengaruhi kLa?
Kelewatan probe boleh memesongkan pengukuran kLa. Jika sensor oksigen terlarut bertindak balas terlalu perlahan berbanding kadar pemindahan oksigen, hasilnya boleh tersasar dan mungkin memerlukan pembetulan bukan linear.
Bahan tambahan media juga boleh mengubah pemindahan oksigen dengan cara yang penting.Elektrolit dan garam boleh menekan penggabungan gelembung. Pluronic F68 mungkin mengurangkan saiz gelembung. Antifoam sering meningkatkan penggabungan gelembung, yang mengurangkan kawasan antara muka yang berkesan dan menurunkan kLa.
