การรักษาค่า pH ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง เซลล์เจริญเติบโตได้ดีในช่วงค่า pH แคบ ๆ ที่ 7.1 ถึง 7.4, และแม้แต่การเบี่ยงเบนเล็กน้อยก็สามารถรบกวนกระบวนการต่าง ๆ เช่น การเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมของแลคเตท, ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อผลผลิตของผลิตภัณฑ์ นี่คือสิ่งที่คุณจำเป็นต้องรู้:
- ความท้าทาย: เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาดใหญ่เผชิญกับความแตกต่างของค่า pH ในท้องถิ่น การสะสมของ CO₂ และการเพิ่มขึ้นของออสโมลาลิตี้ ซึ่งทั้งหมดนี้สามารถขัดขวางการเจริญเติบโตของเซลล์ได้
-
กลยุทธ์สำคัญ:
- ระบบบัฟเฟอร์: ให้ความเสถียรของค่า pH ในระยะเริ่มต้นแต่มีความจุจำกัด
- การเติมกรด/เบส: มีประสิทธิภาพแต่เพิ่มออสโมลาลิตี้และเสี่ยงต่อการกระจายตัวไม่สม่ำเสมอ
- การพ่นก๊าซ: ปรับค่า pH โดยไม่ส่งผลต่อออสโมลาลิตี้ เหมาะสำหรับการขยายขนาด
- ระบบอัตโนมัติ: การปรับแบบเรียลไทม์โดยใช้เซ็นเซอร์เพื่อการควบคุมที่แม่นยำ
- แนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุด: รวมวิธีการ ใช้เซ็นเซอร์ที่เชื่อถือได้ และชะลอการเติมฐานจนกว่าจะถึงช่วงการเจริญเติบโตแบบทวีคูณเพื่อลดความเครียดต่อเซลล์
สำหรับวิศวกรกระบวนการชีวภาพและทีม R&D การเพิ่มประสิทธิภาพการควบคุม pH หมายถึงการลดความเครียดในท้องถิ่น รักษาความคงตัวของออสโมลาลิตี้ และรับรองการตรวจสอบที่แม่นยำ บทความนี้เจาะลึกถึงวิธีการ อุปกรณ์ และการแก้ไขปัญหาเพื่อปรับปรุงแนวทางของคุณ
การวัดและการตรวจสอบ pH ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ
ประเภทของเซ็นเซอร์ pH และการใช้งาน
การตรวจสอบ pH ที่แม่นยำเป็นรากฐานของการควบคุมเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพที่มีประสิทธิภาพ โพรบโพเทนชิโอเมตริกแบบอินไลน์, เช่น
นอกจากโพรบแบบอินไลน์แล้ว เซ็นเซอร์ก๊าซที่ปล่อยออกมา เช่น BlueInOne ยังใช้ในการวัด CO₂ ที่ละลาย (pCO₂) ในก๊าซที่ปล่อยออกมา เนื่องจากระดับ pCO₂ มีผลโดยตรงต่อค่า pH ของตัวกลาง ข้อมูลก๊าซที่ปล่อยออกมาจึงให้มุมมองที่เป็นทางอ้อมแต่มีข้อมูลสูงเกี่ยวกับสภาพแวดล้อมของ pH ซึ่งมีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อการอ่านค่า pH ของตัวกลางจำนวนมากไม่สามารถจับการเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกภายในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพได้อย่างเต็มที่ [3].
อย่างไรก็ตาม โพรบแบบอินไลน์มีแนวโน้มที่จะเกิดการปนเปื้อนทางชีวภาพ ซึ่งมักเกิดจากเศษเซลล์ที่สะสมบนเซ็นเซอร์ สิ่งนี้สามารถนำไปสู่การลดลงของค่า pH อย่างกะทันหันซึ่งไม่สะท้อนถึงสภาพจริงในตัวกลางจำนวนมาก [3]. หากเกิดการลดลงของค่า pH อย่างไม่คาดคิด สาเหตุน่าจะมาจากการเกิดฟาวลิ่งมากกว่าการเกิดกรดในวัฒนธรรมอย่างแท้จริง เพื่อแก้ไขปัญหานี้ การสอบเทียบและการบำรุงรักษาที่เหมาะสมเป็นสิ่งจำเป็น ตามที่ระบุไว้ด้านล่างนี้
แนวปฏิบัติที่ดีที่สุดในการสอบเทียบและการบำรุงรักษา
การรักษาค่าการอ่านค่า pH ที่แม่นยำตลอดการเพาะเลี้ยงต้องการมากกว่าการสอบเทียบเพียงครั้งเดียวก่อนเริ่มต้น การเปลี่ยนแปลงค่า pH อย่างรวดเร็วและฉับพลันมักบ่งบอกถึงปัญหาของเซ็นเซอร์ ในขณะที่การเกิดกรดอย่างแท้จริงมักส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างค่อยเป็นค่อยไป [3]. การแยกแยะระหว่างสองสถานการณ์นี้เป็นกุญแจสำคัญในการตรวจสอบที่มีประสิทธิภาพ
กลยุทธ์การดำเนินงานบางอย่างยังสามารถเพิ่มความน่าเชื่อถือของเซ็นเซอร์ได้อีกด้วย ตัวอย่างเช่น การชะลอการเติมเบสจนกว่าจะถึงระยะการเจริญเติบโตแบบทวีคูณและการใช้การกระจายก๊าซเพื่อควบคุมค่า pH ในระยะแรกสามารถลดความเสี่ยงของการเกิดฟาวลิ่งและปรับปรุงความเสถียรของวัฒนธรรม [3]. การรวมการวัดค่า pH แบบอินไลน์กับการตรวจสอบ pCO₂ ของก๊าซที่ปล่อยออกมาให้การตรวจสอบที่มีคุณค่า ช่วยในการตรวจจับการเบี่ยงเบนของเซ็นเซอร์ได้เร็วขึ้นและรับประกันการตอบสนองการควบคุมที่แม่นยำ การตรวจสอบค่า pH ในการออกแบบไบโอรีแอคเตอร์ที่แตกต่างกัน เนื่องจากการออกแบบและขนาดของไบโอรีแอคเตอร์แตกต่างกัน ความท้าทายในการตรวจสอบค่า pH ก็เช่นกัน ไบโอรีแอคเตอร์ขนาดใหญ่ก่อให้เกิดความชันที่เกิดจากขนาด ทำให้การวัดค่า pH ที่แม่นยำยิ่งมีความสำคัญมากขึ้นสำหรับการรักษากลยุทธ์การควบคุม ในระบบขนาดเล็กในห้องปฏิบัติการ เช่น ระบบ 3 L Labfors จาก Infors, วัฒนธรรมมักจะผสมกันดี และโพรบอินไลน์เดียวสามารถให้การอ่านค่า pH โดยรวมที่เชื่อถือได้ [3]. อย่างไรก็ตาม ในไบโอรีแอคเตอร์การผลิตขนาดใหญ่ - ซึ่งสามารถบรรจุได้ถึง 25,000 L - เวลาผสมจะนานขึ้น นำไปสู่ ความชันของค่า pH, โดยเฉพาะใกล้จุดเติมเบส [3].
"การเพิ่มเวลาการผสมในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาดใหญ่สามารถส่งผลให้เกิดการก่อตัวของเกรเดียนท์ การสัมผัสกับเซลล์ไลน์ต่างๆ แม้เพียงเล็กน้อยในแอมพลิจูดของ pH ส่งผลให้ประสิทธิภาพของกระบวนการได้รับผลกระทบในทางลบ" - Katrin Paul et al., Engineering in Life Sciences [3]
ในระบบขนาดใหญ่เช่นนี้ การวางโพรบเพียงตัวเดียวห่างจากโซนการเติมฐานอาจไม่สามารถตรวจจับความผันผวนของ pH ที่เซลล์ประสบได้ ด้วยประมาณ 50% ของชีวเภสัชภัณฑ์ คาดว่าจะผลิตในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาด 5,000 ลิตรหรือใหญ่กว่า, นี่เป็นความท้าทายที่ต้องให้ความสนใจ [3]. เพื่อแก้ไขปัญหานี้ นักวิจัยมักใช้ ระบบสองช่อง (2-CS) ในการศึกษาระดับเบนช์สเกล ระบบเหล่านี้จำลองสภาวะในระดับอุตสาหกรรมโดยการหมุนเวียนส่วนหนึ่งของประชากรเซลล์ผ่านทางบายพาสที่มีการเติมเบส ซึ่งเป็นการสร้างแบบจำลองที่สมจริงของการเปลี่ยนแปลงค่า pH ที่พบในกระบวนการผลิต [3].
สำหรับเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบโยกและแบบเพอร์ฟิวชั่น หลักการที่คล้ายกันจะถูกนำมาใช้ ระบบโยกที่มีการผสมที่นุ่มนวลกว่าจะช่วยลดการเกิดเกรเดียนท์ในท้องถิ่น ระบบเพอร์ฟิวชั่นในทางกลับกันจะเพิ่มความซับซ้อนเพิ่มเติม การแลกเปลี่ยนสื่ออย่างต่อเนื่องในระบบเหล่านี้สามารถเปลี่ยนแปลงความสามารถในการบัฟเฟอร์ของวัฒนธรรมเมื่อเวลาผ่านไป จำเป็นต้องมีการตรวจสอบอย่างใกล้ชิดทั้งค่า pH แบบอินไลน์และข้อมูลก๊าซที่ปล่อยออกมาเพื่อให้แน่ใจว่าสภาวะค่า pH คงที่
ระบบบัฟเฟอร์และการออกแบบสื่อ
ระบบบัฟเฟอร์ที่ใช้ในกระบวนการชีวภาพเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
ในวัฒนธรรมเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ระบบ ไบคาร์บอเนต-CO₂ มีบทบาทสำคัญในการบัฟเฟอร์มันควบคุมความดันบางส่วนของ CO₂ (pCO₂) ภายในไบโอรีแอคเตอร์ ซึ่งจะรักษาสมดุลระหว่างกรดคาร์บอนิกและไบคาร์บอเนตไอออนในตัวกลาง [3]. ระบบนี้เลียนแบบกระบวนการทางสรีรวิทยาของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม แต่สามารถถูกรบกวนได้โดยการกำจัด CO₂ - ที่เกิดจากการกระจายตัวอย่างรุนแรงหรือการกวนที่สูง - นำไปสู่การเพิ่มขึ้นของค่า pH.
สำหรับระบบขนาดเล็กหรือระบบเปิดที่การควบคุม CO₂ ทำได้ยากกว่า บัฟเฟอร์แบบซวิเตอร์ไอออนิก เช่น HEPES มักถูกใช้ HEPES ให้การบัฟเฟอร์ที่เสถียรซึ่งไม่ขึ้นอยู่กับเฟสของก๊าซ อย่างไรก็ตาม ไม่เหมือนไบคาร์บอเนต มันไม่เข้าร่วมในกระบวนการเมตาบอลิซึมของเซลล์ ซึ่งจำกัดการใช้งานในกระบวนการผลิตขนาดใหญ่.
ทั้งสองวิธีเน้นความสำคัญของระบบบัฟเฟอร์ในการรักษาค่า pH ที่เสถียร ซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญที่ได้รับอิทธิพลเพิ่มเติมจากองค์ประกอบของตัวกลาง.
องค์ประกอบของตัวกลางมีผลต่อความเสถียรของค่า pH อย่างไร
เมตาบอลิซึมของเซลล์มีผลกระทบอย่างมากต่อความเสถียรของค่า pH.เมื่อเซลล์เผาผลาญกลูโคสและกรดอะมิโน พวกมันจะผลิตแลคเตท ซึ่งทำให้สื่อมีความเป็นกรดมากขึ้น ระดับของการเกิดกรดนี้ขึ้นอยู่กับปัจจัยต่างๆ เช่น ความหนาแน่นของเซลล์ ระดับกลูโคส และกลยุทธ์การให้อาหารที่ใช้ [3]. ตัวบ่งชี้กระบวนการที่สำคัญที่นี่คือ การเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญแลคเตท, ที่เซลล์เปลี่ยนจากการผลิตแลคเตทไปเป็นการบริโภคมัน แม้แต่การเปลี่ยนแปลงค่า pH เล็กน้อย - เพียง 0.1 หน่วย - ก็สามารถรบกวนการเปลี่ยนแปลงนี้ได้ นำไปสู่การสะสมของแลคเตทและการลดลงของค่า pH ต่อไป [3].
เพื่อแก้ไขปัญหานี้ การรักษาระดับกลูโคสที่ควบคุมได้ (e.g. , 2 g/L ผ่านการให้อาหารอย่างต่อเนื่อง) และการเสริมกรดอะมิโนอย่างเพียงพอเป็นสิ่งสำคัญ [3].
"ความไวของเซลล์ไม่เพียงแต่ต่อการเปลี่ยนแปลงของ pH แต่ยังต่อการเติมเบสเองแสดงให้เห็นถึงความสำคัญของการออกแบบกระบวนการเป็นเครื่องมือในการลดผลกระทบเชิงลบต่อประสิทธิภาพของกระบวนการ" - Katrin Paul et al., Institute of Chemical, Environmental and Bioscience Engineering, TU Wien [3]
สิ่งนี้เน้นย้ำว่าการจัดองค์ประกอบของสื่อและการออกแบบกระบวนการต้องทำงานร่วมกันเพื่อรักษาเสถียรภาพของค่า pH.
ข้อพิจารณาการออกแบบสื่อสำหรับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
เมื่อออกแบบสื่อสำหรับระบบเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง ปัจจัยการบัฟเฟอร์และการเผาผลาญต้องสอดคล้องกับความต้องการเฉพาะของกระบวนการเหล่านี้. สื่อที่ปราศจากเซรั่มและกำหนดทางเคมี เป็นมาตรฐานสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงเนื่องจากความสามารถในการทำซ้ำและการปฏิบัติตามกฎระเบียบ อย่างไรก็ตาม สูตรเหล่านี้ขาดโปรตีนเมทริกซ์ที่พบในเซรั่ม ซึ่งช่วยบัฟเฟอร์ตามธรรมชาติ การขาดนี้ทำให้การจัดการค่า pH ที่แม่นยำยิ่งมีความสำคัญมากขึ้น ต้องการการเลือกบัฟเฟอร์อย่างระมัดระวังและการควบคุมกระบวนการ.
รูปแบบการเพาะเลี้ยงยังมีบทบาทสำคัญในพลวัตของค่า pH. การเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอย และ ระบบที่ใช้ไมโครแคร์ริเออร์ แสดงพฤติกรรมที่แตกต่างกัน ตัวอย่างเช่น ระบบไมโครแคร์ริเออร์สามารถสร้างสภาพแวดล้อมขนาดเล็กที่มีการเปลี่ยนแปลงของ pH ที่แตกต่างจากสื่อกลางทั่วไป เพื่อรักษาเสถียรภาพของ pH จำเป็นต้องปรับความสามารถในการบัฟเฟอร์และกลยุทธ์การให้อาหารให้เหมาะสมกับรูปแบบการเพาะเลี้ยงและระยะการเจริญเติบโตเฉพาะ [3].
ในช่วงระยะการเจริญเติบโตเริ่มต้น การปล่อย CO₂ สามารถเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการควบคุม pH มันหลีกเลี่ยงการสร้างโซนที่มี pH สูงเฉพาะที่ ซึ่งเป็นปัญหาทั่วไปกับการเติมฐานของเหลวโดยตรง [3].
การทำความเข้าใจการวัด pH ในกระบวนการชีวภาพ
กลยุทธ์การเติมกรด/เบสและการปล่อยก๊าซ
วิธีการควบคุม pH ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ: การเติมของเหลว vs.การเติมก๊าซ
การใช้การเติมเบสและกรดเพื่อควบคุมค่า pH
การเติมสารละลายไทแทรนท์เป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการแก้ไขการเปลี่ยนแปลงของค่า pH ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ โดยปกติจะใช้โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) และโซเดียมไบคาร์บอเนต (NaHCO₃) เพื่อเพิ่มค่า pH ในขณะที่ใช้กรดฟอสฟอริก (H₃PO₄) หรือ CO₂ ที่ละลายแล้วเพื่อลดค่า pH วิธีนี้อาศัยวงจรป้อนกลับของปั๊มและเซ็นเซอร์ที่เรียบง่าย ทำให้มีประสิทธิภาพในระดับห้องปฏิบัติการ
อย่างไรก็ตาม เทคนิคนี้มีข้อเสีย สารละลายไทแทรนท์จะเพิ่มความเข้มข้นของสารละลายในตัวกลาง และการผสมที่ไม่เพียงพออาจนำไปสู่โซนที่มีค่า pH สูงเฉพาะที่ ซึ่งอาจทำให้เซลล์เครียด งานวิจัยที่ดำเนินการที่ TU Wien ได้เน้นย้ำถึงปัญหานี้ โดยแสดงให้เห็นว่าการเติมเบสแบบจุ่มส่งผลให้จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตสูงสุดลดลง 22% เมื่อเทียบกับการเติมในพื้นที่ว่าง สาเหตุที่เป็นไปได้คือความเครียดเฉพาะที่อย่างต่อเนื่องการแก้ปัญหาที่เป็นไปได้คือการชะลอการเติมเบสจนกว่าจะผ่านช่วงการเจริญเติบโตแบบทวีคูณ เมื่อเซลล์มีความเสี่ยงต่อการเปลี่ยนแปลงของ pH น้อยลง
สำหรับผู้ที่ต้องการหลีกเลี่ยงความท้าทายเหล่านี้ การใช้ก๊าซสปาร์จเป็นวิธีการทางเลือก
เทคนิคการใช้ก๊าซสปาร์จเพื่อควบคุม pH
การใช้ก๊าซสปาร์จปรับ pH โดยการนำ CO₂ เข้ามาเพื่อสร้างกรดคาร์บอนิกซึ่งจะลด pH หรือโดยการใช้ก๊าซอากาศ ออกซิเจน หรือไนโตรเจนเพื่อกำจัด CO₂ ที่ละลายและเพิ่ม pH ซึ่งต่างจากการเติมสารละลายไทแทรนท์ การใช้ก๊าซสปาร์จไม่ส่งผลต่อความเข้มข้นของสารละลาย
"ฟองก๊าซจากสปาร์จเจอร์สามารถผสมและกระจายได้อย่างรวดเร็วกว่าเบส และด้วยการกวนที่น้อยกว่ามาก" - Alicat Scientific[1]
ประสิทธิภาพของการใช้ก๊าซสปาร์จขึ้นอยู่กับการออกแบบสปาร์จเจอร์เป็นอย่างมาก ไมโครสปาร์จเจอร์ที่มีพื้นที่ผิวสูงมีประสิทธิภาพในการละลายก๊าซเช่น CO₂ และ O₂ ลงในตัวกลางในทางกลับกัน, macro-spargers ซึ่งผลิตฟองอากาศขนาดใหญ่กว่า มีประสิทธิภาพมากกว่าในการกำจัด CO₂ อย่างไรก็ตาม การรักษาจุดตั้งค่า CO₂ อย่างเข้มงวดผ่านการ sparging อย่างต่อเนื่องสามารถนำไปสู่การสะสมของ CO₂ ซึ่งส่งผลกระทบในทางลบต่อการเจริญเติบโตของเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและการผลิตโปรตีน ตามที่ Stephanie R. Klaubert et al. กล่าวไว้ใน Biotechnology Progress, "สำหรับวัฒนธรรมที่ควบคุม CO₂ การใช้จุดตั้งค่าสามารถส่งผลให้เกิดการสะสมของ CO₂ ซึ่งมีผลเสียต่อการเจริญเติบโตของเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและการผลิตโปรตีน" [4]. การปรับจุดตั้งค่าแบบไดนามิกในช่วงเฟสเอ็กซ์โพเนนเชียลสามารถช่วยบรรเทาปัญหานี้ได้
การปรับขนาดวิธีการที่ใช้กรด/เบสและก๊าซ
ในขณะที่การเติมสารละลายไตแทรนท์ทำงานได้ดีในระดับห้องปฏิบัติการ ความสามารถในการขยายขนาดถูกขัดขวางโดยความท้าทายในการผสมและการเพิ่มขึ้นของ osmolalityการพ่นก๊าซในทางกลับกันให้การถ่ายโอนมวลที่สม่ำเสมอและหลีกเลี่ยงปัญหาความเข้มข้นของสารละลายแม้ในกระบวนการขนาดใหญ่:
| คุณสมบัติ | การเติมของเหลว/กรด | การพ่นก๊าซ |
|---|---|---|
| ตัวแทนหลัก | NaOH, NaHCO₃, H₃PO₄ | CO₂, อากาศ, N₂, O₂ |
| ผลกระทบต่อความเข้มข้นของสารละลาย | เพิ่มขึ้นทุกครั้งที่เติม | ไม่มี |
| ความเสี่ยงในการผสม | โซนที่มีค่า pH สูงเฉพาะที่ | การกระจายฟองอากาศที่สม่ำเสมอ |
| ความสามารถในการขยายขนาด | จำกัดด้วยเวลาการผสม | สูง เนื่องจากการถ่ายโอนมวลที่สม่ำเสมอ |
| ความเครียดเฉือน | สูง (ต้องการการกวนอย่างมาก) | ต่ำถึงปานกลาง (ขึ้นอยู่กับอัตราการไหล) |
ในเดือนกุมภาพันธ์ 2024 นักวิจัยที่ AGC Biologics ได้สาธิตแบบจำลองการถ่ายโอนมวลที่สามารถทำนายได้สำหรับการควบคุม CO₂ ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาด 15,000 ลิตรโมเดลนี้ได้รับการทดสอบกับวัฒนธรรมเซลล์ CHO ที่มีความหนาแน่นสูงสุดถึง 20×10⁶ เซลล์/มล. โดยสามารถรักษาระดับ CO₂ ที่ละลายอยู่ในช่วงเป้าหมาย 5–15% ได้สำเร็จ ลดการพึ่งพาการปรับเปลี่ยนตามประสบการณ์ สำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง ซึ่งเซลล์ต้องการช่วง pH ที่ 7.1–7.4 การใช้ก๊าซแบบมีข้อมูลจากโมเดลนี้มีประโยชน์อย่างยิ่ง แนวทางเหล่านี้เน้นความสำคัญของการปรับวิธีการควบคุม pH ให้สอดคล้องกับขนาดของเครื่องปฏิกรณ์และความต้องการของกระบวนการ ซึ่งมีความสำคัญต่อการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง sbb-itb-ffee270 การควบคุม pH อัตโนมัติและกลยุทธ์ขั้นสูง ระบบควบคุม pH อัตโนมัติมาตรฐาน การควบคุม pH อัตโนมัติอาศัยระบบวงปิดที่เซ็นเซอร์ตรวจสอบระดับ pH ตัวควบคุมประมวลผลข้อมูล (โดยปกติใช้ตรรกะ PI หรือ PID) และตัวกระตุ้นทำการปรับเปลี่ยน - มักผ่านปั๊มของเหลวหรือตัวควบคุมการไหลของมวลThe proportional band (p-band) determines how aggressively the controller responds to pH changes. Beckman Coulter Life Sciences illustrated this in their BioLector Pro technical note (2026), which examined E. coli cultivations in Wilms-MOPS medium with 3 M NaOH. They found:
- แถบสัดส่วน (p-band) ที่ 0.1 รักษาค่า pH ให้อยู่ในช่วงเป้าหมาย
- แถบสัดส่วน (p-band) ที่ 0.01 ทำให้เกิดการเกินเป้าหมาย
- แถบสัดส่วน (p-band) ที่ 5 ตอบสนองช้าเกินไปในการต่อต้านการผลิตกรดเมตาบอลิก [6].
สำหรับสื่อที่มีความสามารถในการบัฟเฟอร์สูง ค่าของแถบสัดส่วน (p-band) ที่เล็กลงสามารถปรับปรุงเวลาตอบสนองได้ แต่ต้องมีการตรวจสอบอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการเกินเป้าหมาย
ระบบส่วนใหญ่มีแถบตาย (โดยทั่วไป ±0.02 ถึง 0.05 หน่วย pH) เพื่อป้องกันการแก้ไขที่ไม่จำเป็นเมื่อค่า pH อยู่ในช่วงที่ยอมรับได้แล้วคุณสมบัติเหล่านี้ เมื่อรวมกับความก้าวหน้าในกลยุทธ์เซ็นเซอร์และการกระจายก๊าซ ทำให้สามารถจัดการค่า pH ได้อย่างแม่นยำในสภาวะไบโอรีแอคเตอร์ที่มีการเปลี่ยนแปลง
วงจรควบคุมค่า pH และออกซิเจนละลายรวมกัน
ระบบขั้นสูงรวมการควบคุมค่า pH และออกซิเจนละลาย (DO) เข้าด้วยกันในวงจรเดียว โดยปรับส่วนผสมของอากาศ, O₂, N₂, และ CO₂ ตามข้อมูลจากเซ็นเซอร์ pH, DO, และ pCO₂ [1].
"การตั้งค่าที่ทันสมัยที่สุดใช้ก๊าซกระจายเพื่อควบคุมค่า pH... เพื่อมุ่งเน้นการเพิ่มประสิทธิภาพวงจรควบคุมสำหรับก๊าซกระจายโดยใช้ข้อมูลจากค่า pH และพารามิเตอร์กระบวนการที่สำคัญอื่น ๆ - รวมถึง pCO₂" - Alicat Scientific [1]
วิธีการแบบบูรณาการนี้ช่วยเพิ่มความสามารถในการขยายตัว เมื่อปริมาตรของไบโอรีแอคเตอร์เพิ่มขึ้น อัตราการกระจายและขนาดฟองมักจะคงที่ ลดความเครียดจากการเฉือนบนเซลล์เมื่อเทียบกับการผสมสารละลายของเหลวนอกจากนี้ ความเข้มข้นของสารละลายยังคงเสถียร ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบในการรักษาความมีชีวิตของเซลล์ [1][2]. อย่างไรก็ตาม ระบบการกระจายก๊าซหลายชนิดต้องการตัวควบคุมการไหลของมวลที่แม่นยำและตัวกระจายที่ออกแบบมาอย่างดี ซึ่งสามารถเพิ่มความซับซ้อนและค่าใช้จ่าย - โดยเฉพาะใน R&D ที่การเติมของเหลวยังคงเป็นตัวเลือกที่ใช้งานได้จริง
จุดสำคัญหนึ่ง: pCO₂ และ pH ไม่ได้สัมพันธ์กันโดยตรงเสมอไป ในสื่อที่มีการบัฟเฟอร์ ผลพลอยได้จากการเผาผลาญเช่นแลคเตทมีส่วนทำให้เกิดความเป็นกรดแต่ไม่อาจสะท้อนในระดับ pCO₂ [1]. การตรวจสอบทั้ง pCO₂ และ pH ให้มุมมองที่ครอบคลุมมากขึ้นของสภาพแวดล้อมการเพาะเลี้ยง แม้ว่าจะไม่ควรใช้เป็นตัวบ่งชี้เดี่ยว
เทคนิคการควบคุมที่ใช้โมเดลและขับเคลื่อนด้วยข้อมูล
เทคนิคขั้นสูงไปไกลกว่าลูป PID มาตรฐานเพื่อปรับปรุงการควบคุม pH ให้ดียิ่งขึ้นการควบคุมแบบใช้โมเดล ใช้สมการสมดุลเคมีในการทำนายปริมาณของ CO₂ หรือโซเดียมไบคาร์บอเนตที่จำเป็นเพื่อให้ได้ค่า pH ที่ต้องการ แทนที่จะตอบสนองต่อการเบี่ยงเบนเท่านั้น วิธีการทำนายนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งในช่วงที่มีการเติบโตอย่างรวดเร็วเมื่อการผลิตกรดเมตาบอลิกสามารถเกินการควบคุมแบบตอบสนอง [7].
ตัวอย่างของการตรวจสอบที่ขับเคลื่อนด้วยข้อมูลมาจากนักวิจัยที่ École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) ในปี 2008 พวกเขาได้แสดงระบบควบคุม pH แบบใช้โมเดลโดยใช้ สเปกโทรสโกปีอินฟราเรดกลาง (MIR) ใน การเพาะเลี้ยงแบทช์ของ E. coli โดยการวิเคราะห์การดูดกลืนโมลาร์ของชนิดบัฟเฟอร์และใช้ทฤษฎี Debye–Hückel เพื่อประมาณค่าตัวประกอบกิจกรรม ระบบสามารถทำให้ความคลาดเคลื่อนของ pH น้อยกว่า 0.12 หน่วยเมื่อเทียบกับโพรบอิเล็กโทรเคมีแบบดั้งเดิม วิธีการนี้ช่วยลดความจำเป็นในการใช้เซ็นเซอร์หรือสีย้อมที่รุกราน [5]. การวิเคราะห์ด้วยสเปกโทรสโกปี MIR แสดงให้เห็นถึงข้อผิดพลาดมาตรฐานของการทำนายที่ต่ำกว่า 0.15 หน่วย pH ทำให้เป็นทางเลือกที่มีแนวโน้มในการตรวจวัดแบบไม่รุกรานเมื่อเทคโนโลยีการตรวจจับด้วยแสงก้าวหน้า [5].
สำหรับทีมที่ใช้เซ็นเซอร์แสง ควรให้เวลาช่วงหนึ่งชั่วโมงหลังจากเพิ่มสื่อเพื่อให้เซ็นเซอร์ปรับสมดุลกับสื่อก่อนเริ่มวงจรควบคุม เพื่อหลีกเลี่ยงการแก้ไขก่อนเวลาอันควร [6].
ตารางด้านล่างสรุปวิธีการเหล่านี้ โดยระบุจุดแข็งและข้อจำกัด:
| วิธีการควบคุม | กลไก | ข้อดีหลัก | ข้อจำกัดหลัก |
|---|---|---|---|
| PID (การเติมของเหลว) | วงจรป้อนกลับของปั๊ม | ง่าย; มีประสิทธิภาพในขนาดเล็ก | ขยายขนาดได้ไม่ดี; เพิ่มความเข้มข้นของสารละลาย[1][6] |
| วงจรการผสมก๊าซหลายชนิด | การควบคุมการผสม CO₂/N₂/อากาศ | ขยายขนาดได้; ความเข้มข้นของสารละลายคงที่[1] | ต้องการวิศวกรรมสปาร์เกอร์ที่ซับซ้อน[1] |
| MIR Spectroscopy | การทำนายตามการดูดซับ | ไม่รุกราน; ไม่ต้องใช้สีย้อม [5] | การสอบเทียบที่ซับซ้อน; ต้องใช้โมเดลหลายตัวแปร [5] |
| การสร้างแบบจำลองสมดุล | การป้อนข้อมูลล่วงหน้าทางคณิตศาสตร์ | การทำนาย; ลดการแก้ไข [7] | อาศัยข้อมูลองค์ประกอบของสื่อที่ถูกต้อง [7] |
การเพิ่มประสิทธิภาพและการแก้ไขปัญหาสำหรับการควบคุม pH
ปัญหา pH ทั่วไปในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
เซลล์เนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงต้องการช่วง pH ที่ 7.1–7.4 เพื่อเจริญเติบโต [1]. แม้แต่การเบี่ยงเบนเล็กน้อยของหน่วย pH 0.1 ก็สามารถรบกวนการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมของแลคเตทได้ [3]. เมื่อปริมาตรของไบโอรีแอคเตอร์เพิ่มขึ้น การรักษาความคงที่ของ pH จะยิ่งท้าทายมากขึ้น ในรีแอคเตอร์ที่มีขนาดถึง 25,000 ลิตร กระเป๋า pH ที่เกิดขึ้นเฉพาะที่สามารถเบี่ยงเบนได้มากถึง 0.4 หน่วยเนื่องจากเวลาผสมที่นานขึ้น [2]. การเติมฐานของเหลวบ่อยครั้งไปยังพื้นที่ว่างด้านบนสามารถทำให้ความผันผวนเหล่านี้แย่ลง [3]. ระดับความเข้มข้นของออสโมลาลิตี้สูง โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่สูงกว่า 400 mOsmol/kg จะยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์เพิ่มเติม [2]. ที่สำคัญ การใช้ NaOH 2 M สำหรับการปรับ pH ได้แสดงให้เห็นว่าสามารถบล็อกการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมของแลคเตทได้อย่างสมบูรณ์ ซึ่งแตกต่างจากความเข้มข้นที่ต่ำกว่าเช่น 0.5 M หรือ 1 M ซึ่งมีผลกระทบต่อประสิทธิภาพของกระบวนการน้อยกว่า [2].
อีกปัญหาหนึ่งคือผลพลอยได้จากการสลายเซลล์ โดยเฉพาะ DNA ซึ่งสามารถทำให้โพรบวัดค่า pH เสียหายและนำไปสู่การอ่านค่าที่ไม่ถูกต้อง [3]. สัญญาณเท็จเหล่านี้มักจะกระตุ้นการเติมเบสที่ไม่จำเป็น ทำให้เกิดปัญหาเช่นการเพิ่มขึ้นของออสโมลาลิตี้และความไม่สมดุลของ pH ในท้องถิ่น
วิธีแก้ไขปัญหาการควบคุม pH
ขั้นตอนแรกในการแก้ไขปัญหาคือการแยกแยะระหว่างข้อผิดพลาดของเซ็นเซอร์และการเปลี่ยนแปลง pH ที่แท้จริง หากเกิดการลดลงของ pH อย่างรวดเร็วโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่สอดคล้องกันในกิจกรรมการเผาผลาญหรือระดับ CO₂ การเสียหายของโพรบอาจเป็นสาเหตุ การทำความสะอาดหรือปรับเทียบโพรบใหม่และตรวจสอบการอ่านค่าด้วยการวัดแบบออฟไลน์ควรทำให้สถานการณ์ชัดเจนขึ้น
สำหรับการลดลงของ pH ที่แท้จริง การระบุสาเหตุที่แท้จริง - ไม่ว่าจะเป็นการสะสมของ CO₂ หรือการผลิตแลคเตท - เป็นสิ่งสำคัญ ในสื่อที่มีการบัฟเฟอร์ pCO₂ และ pH ไม่ได้เชื่อมโยงกันอย่างแน่นหนาเสมอไป [1]. การตรวจสอบระดับแลคเตทสามารถช่วยระบุปัญหาที่การปล่อยก๊าซเพียงอย่างเดียวอาจไม่สามารถแก้ไขได้ ในระดับที่ใหญ่ขึ้น การแก้ไขปัญหาการกระจายตัวของ pH ต้องการการพิจารณาอย่างรอบคอบ แม้ว่าการเพิ่มการกวนอาจดูเหมือนเป็นวิธีแก้ปัญหาที่ชัดเจน แต่ความเร็วของใบพัดที่สูงขึ้นสามารถทำให้เกิดความเครียดจากแรงเฉือนที่ทำลายเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้ แทนที่จะเป็นเช่นนั้น การเพิ่มการระบายอากาศในพื้นที่ว่างมักจะมีประสิทธิภาพมากกว่า การศึกษาปี 2018 โดย Hoshan et al. แสดงให้เห็นว่าการรักษาอัตราการปล่อยก๊าซคงที่ในขณะที่เพิ่มการระบายอากาศในพื้นที่ว่างระหว่างการขยายขนาดจาก 30 L เป็น 250 L สามารถรักษาระดับผลิตภัณฑ์ได้โดยไม่เพิ่มความเครียดจากแรงเฉือน "ฟองก๊าซจาก spargers สามารถผสมและกระจายได้อย่างรวดเร็วกว่าเบส และด้วยการกวนน้อยกว่ามาก" - Alicat Scientific เมื่อการเติมเบสเป็นสิ่งที่หลีกเลี่ยงไม่ได้ การเลือกเวลาที่เหมาะสมสามารถสร้างความแตกต่างได้อย่างมากการชะลอการเติมเบสจนกว่าจะผ่านช่วงการเติบโตแบบทวีคูณช่วยลดความเครียดในเซลล์ที่แบ่งตัวและลดปริมาณเบสที่ต้องใช้โดยรวม [3]. ขั้นตอนเหล่านี้ให้จุดเริ่มต้นที่แข็งแกร่งสำหรับการปรับกลยุทธ์การควบคุม pH ผ่านการทดลองที่มีเป้าหมายเฉพาะ
การใช้การออกแบบการทดลองเพื่อปรับกลยุทธ์ pH
หลังจากการแก้ไขปัญหา การใช้วิธีการออกแบบการทดลอง (DoE) ที่มีโครงสร้างสามารถปรับกลยุทธ์การจัดการ pH ได้อย่างละเอียด DoE ช่วยให้สามารถประเมินปัจจัยหลายอย่างพร้อมกันได้ และค้นพบปฏิสัมพันธ์ที่อาจพลาดไปในการทดสอบตัวแปรเดียว พารามิเตอร์ที่ควรทดสอบรวมถึงความเข้มข้นของเบส ความกว้างของเดดแบนด์ อัตราส่วนผสมของก๊าซ และอัตราการไหลของการสปาร์จ
การปรับให้เหมาะสมของเดดแบนด์มีผลกระทบอย่างมาก การระบุเดดแบนด์ที่กว้างที่สุดที่ไม่ส่งผลกระทบต่อการเติบโตของเซลล์ช่วยลดความถี่ในการเติมเบสและจำกัดการเพิ่มขึ้นของออสโมลาลิตี้ [2]. ในทำนองเดียวกัน การทดสอบความเข้มข้นของสารละลายเบสที่แตกต่างกันสามารถเน้นการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึม [2].
ข้อจำกัดหนึ่งของการศึกษาการออกแบบการทดลอง (DoE) ขนาดเล็กคือเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพบนโต๊ะไม่สามารถจำลองความไม่สม่ำเสมอของค่า pH ในระบบขนาดใหญ่ได้ นักวิจัยที่ TU Wien แนะนำให้ใช้ระบบสองช่องเพื่อเลียนแบบเวลาการหมุนเวียน (ประมาณ 35–44 วินาที) และความลาดเอียงของค่า pH ที่เฉพาะเจาะจงซึ่งเป็นลักษณะของเครื่องปฏิกรณ์ในระดับการผลิต [2]. วิธีการนี้ช่วยเพิ่มมูลค่าการทำนายของการทดลองขนาดเล็กสำหรับการใช้งานในขนาดใหญ่
"เพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดเหล่านี้ในระหว่างการขยายขนาด ควรออกแบบกลยุทธ์การแก้ไขค่า pH อย่างดี ไม่ว่าจะเป็นการเติมเบสในปริมาณเล็กน้อยอย่างต่อเนื่อง การมีช่วงค่า pH ที่กว้าง หรือการควบคุมค่า pH ด้วยการเติมก๊าซเท่านั้น ทั้งหมดนี้เป็นตัวเลือกที่ใช้ได้" - Katrin Paul et al., Institute of Chemical, Environmental and Bioscience Engineering, TU Wien [2]
การใช้การบริโภคแลคเตทเป็นตัวชี้วัดหลักในงานวิจัย DoE เป็นที่แนะนำอย่างยิ่ง มันให้การวัดที่ไวกว่าในการควบคุม pH ที่เหมาะสมสำหรับสุขภาพของเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เผยให้เห็นผลกระทบทางเมตาบอลิซึมที่อาจไม่ปรากฏจากข้อมูลจำนวนเซลล์หรือความมีชีวิตของเซลล์เพียงอย่างเดียว [2].
บทสรุป: ประเด็นสำคัญสำหรับการควบคุม pH ในการผลิตเนื้อสัตว์เพาะเลี้ยง
แนวปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการควบคุม pH
การรักษา pH ให้อยู่ในช่วง 7.1 ถึง 7.4 เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการรักษาความมีชีวิตของเซลล์และเพิ่มผลผลิตในกระบวนการผลิตเนื้อสัตว์เพาะเลี้ยง[1]. เพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้, หัววัด pH แบบอินไลน์ที่ปรับเทียบเป็นประจำ, มักจะจับคู่กับเซ็นเซอร์ออกซิเจนละลาย (DO) ซึ่งเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้การผสมผสานนี้ช่วยให้สามารถตรวจจับการเบี่ยงเบนของเซ็นเซอร์ได้เร็วและปรับระบบได้อย่างรวดเร็วในช่วงการเจริญเติบโตที่สำคัญ การรวมเซ็นเซอร์ pH และ DO ช่วยเพิ่มความตอบสนองของวงจรควบคุม โดยเฉพาะในช่วงการเจริญเติบโตแบบทวีคูณ
สำหรับการปรับค่า pH การใช้ก๊าซสปาร์จิ้งเป็นวิธีที่นิยมใช้ในระดับใหญ่ ฟองก๊าซช่วยให้การกระจายตัวสม่ำเสมอด้วยการกวนที่น้อยที่สุด ลดความเสี่ยงของความไม่สมดุลของ pH ในท้องถิ่นและการเพิ่มขึ้นของออสโมลาลิตี้ที่อาจเกิดขึ้นจากการเติมฐานของเหลว[1]. การเลื่อนการเติมฐานของเหลวออกไปจนกว่าจะผ่านช่วงการเจริญเติบโตแบบทวีคูณสามารถลดการรบกวนทางเมตาบอลิซึมได้มากขึ้น[3]. การปรับระบบควบคุมให้มีเดดแบนด์ที่กว้างขึ้นยังสามารถลดความถี่ในการแทรกแซง ช่วยให้เสถียรภาพของออสโมลาลิตี้ ในขณะที่ระบบบัฟเฟอร์ให้ชั้นแรกของความเสถียรของ pH แต่จะมีประสิทธิภาพน้อยลงเมื่อการผลิต CO₂ เพิ่มขึ้นดังนั้น การผสมผสานระหว่างสื่อที่ออกแบบมาอย่างดีและมาตรการควบคุมที่มีประสิทธิภาพจึงเป็นสิ่งสำคัญ
กลยุทธ์เหล่านี้ให้กรอบการทำงานที่มั่นคงสำหรับการเลือกอุปกรณ์ที่สอดคล้องกับความต้องการเฉพาะของการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
การใช้
คำถามที่พบบ่อย
ฉันจะเลือกอย่างไรระหว่างการเติมฐานของเหลวและการพ่นก๊าซเพื่อควบคุมค่า pH?
การตัดสินใจขึ้นอยู่กับขนาดของการผลิตและระดับความแม่นยำที่ต้องการ การพ่นก๊าซ เหมาะสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงในขนาดใหญ่ มันให้การควบคุมค่า pH ที่สม่ำเสมอ ลดความเครียดจากการเฉือน และหลีกเลี่ยงการเพิ่มความเข้มข้นของสารละลาย ในทางกลับกัน การเติมฐานของเหลว เหมาะสำหรับระบบขนาดเล็กหรือเมื่อจำเป็นต้องปรับค่า pH อย่างแม่นยำในพื้นที่เฉพาะ อย่างไรก็ตาม การจัดการที่ไม่เหมาะสมอาจนำไปสู่ความไม่สมดุลของค่า pH และความเครียดจากออสโมติก สำหรับการตั้งค่าขนาดใหญ่ ระบบการพ่นก๊าซอัตโนมัติเป็นที่ต้องการเพื่อรักษาความสม่ำเสมอและสนับสนุนความมีชีวิตของเซลล์
วิธีที่ดีที่สุดในการตรวจสอบการอุดตันของหัววัด pH เทียบกับการเปลี่ยนแปลง pH จริงคืออะไร?
เพื่อพิจารณาว่าหัววัด pH ถูกอุดตันแทนที่จะตรวจจับการเปลี่ยนแปลง pH จริง ให้สังเกตสัญญาณเช่น เวลาตอบสนองที่ช้า, ศักย์อสมมาตรที่สูงขึ้น, ความลาดเอียงที่ลดลง, หรือ ข้อผิดพลาดของศักย์การแพร่. ทำการวินิจฉัยโดยตรวจสอบจุดเชื่อมต่อสำหรับการอุดตันหรือการเคลือบและตรวจสอบบันทึกการสอบเทียบและการบำรุงรักษาของหัววัด มาตรการเหล่านี้ช่วยระบุปัญหาที่เกี่ยวข้องกับหัววัดแทนที่จะเป็นการเปลี่ยนแปลง pH ที่แท้จริง
ฉันจะลดความชันของ pH ได้อย่างไรเมื่อขยายไปยังเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาดใหญ่?
เพื่อควบคุมความชันของ pH ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาดใหญ่ การใช้การกระจายก๊าซร่วมกับระบบควบคุมอัตโนมัติเป็นวิธีที่เชื่อถือได้ วิธีนี้ส่งเสริมการควบคุม pH ที่สม่ำเสมอในขณะที่รักษาความเครียดเฉือนต่ำการใช้ตัวควบคุมการไหลของมวลช่วยให้คุณปรับอัตราการกระจายก๊าซ เช่น CO₂ และอากาศได้อย่างละเอียด เพื่อช่วยในการรักษาระดับ pH ให้คงที่อย่างมีประสิทธิภาพ
เซ็นเซอร์ขั้นสูงที่จับคู่กับวงจรป้อนกลับช่วยให้สามารถปรับเปลี่ยนได้แบบเรียลไทม์ เพื่อให้มั่นใจว่าการจัดการ pH เป็นไปอย่างแม่นยำตลอดกระบวนการ นอกจากนี้ การหลีกเลี่ยงการเติมเบสช่วยลดความไม่สม่ำเสมอ ซึ่งสนับสนุนระดับ pH ที่คงที่ เทคนิคเหล่านี้ไม่เพียงแต่เพิ่มประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของเซลล์ แต่ยังรักษาความสม่ำเสมอของผลิตภัณฑ์ในระหว่างการขยายขนาดการผลิต
