Nếu một knockout không cải thiện một đặc điểm quy trình đã xác định, thì đó chỉ là một chỉnh sửa, không phải là một dòng tế bào có thể sử dụng được.
Đối với các kỹ sư quy trình sinh học, các nhà khoa học nuôi cấy tế bào và các đội ngũ R&D thịt nuôi cấy, điểm chính của bài viết rất đơn giản: Tôi bắt đầu với điểm nghẽn, đặt ngưỡng đạt/không đạt trước khi chỉnh sửa, sau đó xây dựng quy trình xung quanh một chỉ số sản xuất có thể đo lường như thời gian nhân đôi ngắn hơn, tăng trưởng trong huyền phù, hoặc loại bỏ một kháng nguyên bề mặt. Bài viết cũng làm rõ rằng dữ liệu chỉnh sửa ở mức độ bể chứa có ích cho việc xếp hạng hướng dẫn, nhưng một knockout đạt tiêu chuẩn phát hành cần có dữ liệu kiểu gen ở mức độ dòng, dữ liệu mất protein, kiểm tra dòng dõi và thử nghiệm quy trình đa lần truyền (thường liên quan đến các dòng tế bào sơ cấp so với bất tử hóa).
Một trường hợp vào tháng 7 năm 2024 từ Ivy Farm đã liên kết NF2 knockout trong các tế bào cơ và tế bào gốc từ mô mỡ của lợn và bò với thời gian nhân đôi ngắn hơn, hỗ trợ cho nuôi cấy trong huyền phù và duy trì các dấu hiệu dòng dõi. Nhưng bài báo không coi đó là phổ quát. Tôi vẫn cần xác nhận cụ thể theo loài, dòng dõi và mục tiêu trước khi tiến hành với bất kỳ dòng nhân bản đã chỉnh sửa nào.
Những điều bài viết khuyên làm:
- Xác định mục tiêu chỉnh sửa theo quy trình, không phải theo chi phí
- Thiết lập ngưỡng trước cho sự phát triển, độ phù hợp của việc đình chỉ, sự giữ lại của dấu hiệu và sự ổn định của quá trình
- Chọn gen mục tiêu chỉ sau khi kiểm tra vai trò của đường dẫn, hiệu ứng dòng dõi và các rủi ro liên quan đến an toàn
- Thiết kế hướng dẫn chống lại các exon mã hóa liên tục và kiểm tra locus gốc bằng PCR và Sanger trước tiên
- Sử dụng quy trình không có nhà tài trợ với việc chuyển giao RNP nếu có thể để giới hạn thời gian tiếp xúc của biên tập viên
- Xem các nhóm số lượng lớn như một màn hình sớm, không phải là bằng chứng của knockout
- Xác nhận sự mất biallelic, sau đó kiểm tra sự vắng mặt của protein
- Xác nhận bản sao chống lại các đối chứng phù hợp với cha mẹ hoặc chỉ Cas9, không có sgRNA
- Chỉ phát hành các dòng vượt qua bốn lớp: nhận dạng chỉnh sửa, hậu quả phân tử, chức năng tế bào và độ phù hợp sản xuất
Một vài điểm kỹ thuật nổi bật.Bài viết lưu ý rằng SpCas9 loại hoang dã có thể chịu được 3 đến 5 sai lệch, đó là lý do tại sao việc xem xét ngoài mục tiêu không thể là một suy nghĩ sau. Nó cũng chỉ ra rằng hướng dẫn bị cắt ngắn 17 đến 18 bp có thể giảm hoạt động ngoài mục tiêu lên đến 500 lần mà không giảm nhiều hiệu suất trên mục tiêu. Và vì sửa chữa không có nhà tài trợ thường cho kết quả là các indel hỗn hợp, tôi không thể giả định rằng “đã chỉnh sửa” có nghĩa là “null” - các alen trong khung có thể vẫn giữ chức năng.
Nơi tôi thấy phần này hữu ích nhất là kỷ luật của nó: chỉ riêng kiểu gen là không đủ, chỉ riêng sự phát triển nhanh là không đủ, và dữ liệu đình chỉ từ một lần chuyển không đủ. Một dòng knockout chỉ quan trọng nếu nó giữ được danh tính dòng dõi, duy trì ổn định qua ít nhất bốn lần chuyển trong ba lần lặp lại, và vẫn hoạt động dưới cùng định dạng và mật độ nuôi cấy mà nó sẽ đối mặt trong sản xuất.
Đó là khung cho phần còn lại của bài viết: di chuyển từ nút thắt cổ chai, đến chỉnh sửa thiết kế, đến sao chép màn hình, đến quyết định phát hành mà không trộn lẫn các bước đó với nhau.
Quy trình Gene Knockout cho Dòng Tế Bào Thịt Nuôi Cấy
Chọn gen mục tiêu và chọn chiến lược chỉnh sửa phù hợp
Lập bản đồ đặc điểm đến một con đường hoặc nút điều tiết có thể nhắm mục tiêu
Một khi mục tiêu chỉnh sửa đã rõ ràng, bước tiếp theo là truy ngược nút thắt cổ chai sản xuất về một nút điều tiết cụ thể. Thời gian nhân đôi chậm hoặc tăng trưởng treo yếu thường được lập bản đồ đến một nút con đường xác định, đưa ra những thách thức đáng kể cho việc mở rộng quy mô thịt nuôi cấy, như Hippo, RAS, WNT/β-catenin hoặc NOTCH [1].
Điều đó nghe có vẻ đơn giản trên giấy. Trong thực tế, hiếm khi như vậy. Một gen hỗ trợ tăng trưởng trong một môi trường có thể cần thiết cho sự sống sót hoặc phân hóa trong môi trường khác.Trước khi bạn cam kết với một mục tiêu, hãy kiểm tra bằng chứng trong loài và loại tế bào mà bạn quan tâm. Xem xét liệu chức năng của gen có dư thừa hay không, và xác nhận rằng mất chức năng sẽ không gây hại cho tiềm năng sinh cơ hoặc sinh mỡ, sự ổn định của bộ gen, hoặc bất kỳ đặc điểm nào liên quan đến an toàn của sản phẩm cuối cùng [1].
Đánh giá các mục tiêu ứng viên mà không giả định rằng bất kỳ gen nào đều phù hợp một cách phổ quát
NF2 - mã hóa protein Merlin - là một ví dụ tốt về mục tiêu knockout trong nghiên cứu thịt nuôi cấy. Ivy Farm Technologies đã chỉ ra rằng NF2 knockout giảm thời gian nhân đôi và hỗ trợ thích nghi treo trong dòng lợn và bò trong khi vẫn giữ được các dấu hiệu dòng dõi [1]. Bởi vì NF2 nằm trên các tín hiệu Hippo, RAS, WNT/β-catenin và NOTCH, một knockout có thể thay đổi nhiều con đường tăng trưởng cùng một lúc mà không cần chỉnh sửa đa điểm [1].
MSTN (myostatin) là một mục tiêu khác thường xuất hiện, đặc biệt khi mục tiêu là cải thiện sản lượng tế bào cơ. Các chất điều hòa chu kỳ tế bào như RB1 và TP53 cũng xuất hiện trong các chiến lược đa mục tiêu được xây dựng để mở rộng khả năng sinh sản. Nhưng không có cái gọi là mục tiêu phổ quát. Một gen hoạt động trong một loài hoặc loại tế bào vẫn cần xác nhận riêng biệt trong loài khác. Cùng một chỉnh sửa có thể cho ra kiểu hình khác nhau, hoặc mang theo sự bất ổn. Nếu bạn không có dữ liệu trong dòng dõi trước mặt bạn, đừng cho rằng kết quả sẽ chuyển giao [1].
So sánh knockout với knockdown, chỉnh sửa multiplex và các phương pháp tăng cường chức năng
| Chiến lược chỉnh sửa | Khi nào sử dụng | Hạn chế chính | Bằng chứng cần thiết |
|---|---|---|---|
| Knockout gen đơn | Để loại bỏ vĩnh viễn một chất điều hòa tiêu cực (e.g. , NF2, MSTN) mà trực tiếp hạn chế sự phát triển hoặc thích nghi treo [1] | Khả năng mất không thể đảo ngược các chức năng phụ cần thiết | Xác nhận tính không cần thiết cho khả năng sống và phân biệt trong dòng mục tiêu [1] |
| Knockout multiplex | Khi các con đường dư thừa phải được ức chế đồng thời (e.g. , RB1, TP53, và RAS kết hợp) [1] | Tăng nguy cơ bất ổn định bộ gen và hiệu ứng ngoài mục tiêu tích lũy [1] | Dữ liệu hiệu ứng hiệp đồng và sàng lọc ngoài mục tiêu nghiêm ngặt trên tất cả các vị trí đã chỉnh sửa [1] |
| Knockdown (RNAi/siRNA/CRISPRi) | Khi một gen là thiết yếu hoặc giảm một phần là đủ để đạt được đặc điểm [1] | Thường là tạm thời; yêu cầu cung cấp liên tục hoặc tích hợp shRNA ổn định | Dữ liệu đáp ứng liều lượng cho thấy giảm một phần đạt được kiểu hình mục tiêu [1] |
| Gain-of-function (CRISPRa hoặc knock-in) | Để kích hoạt một con đường thúc đẩy tăng trưởng hoặc thêm một khả năng mới [1] | Quy trình chèn phức tạp; nguy cơ biến đổi ung thư hoặc gánh nặng chuyển hóa [1] | Xác minh rằng sự gia tăng biểu hiện không cản trở tiềm năng phân biệt [1] |
Sử dụng so sánh này để quyết định chiến lược chỉnh sửa trước khi bắt đầu thiết kế hướng dẫn.Nếu gen là cần thiết, hoặc nếu thay đổi bạn cần là vấn đề về mức độ hơn là loại bỏ hoàn toàn, knockdown hoặc CRISPRi cung cấp sự kiểm soát chặt chẽ hơn. Chỉnh sửa đa điểm chỉ có ý nghĩa khi dữ liệu đơn gen cho thấy rằng sự phức tạp thêm vào là đáng giá [1][2].
Một khi lớp chỉnh sửa được cố định, thiết kế RNA hướng dẫn cho sự mất chức năng hoàn toàn.
sbb-itb-ffee270
Thiết kế RNA hướng dẫn cho sự mất hoạt động gen thực sự
Xác nhận trình tự tham chiếu, cấu trúc phiên mã và hồ sơ biến thể
Bắt đầu với mô hình gen, không phải trình tự hướng dẫn. Thiết kế hướng dẫn chỉ nên bắt đầu sau khi bạn đã hoàn thành việc chọn mục tiêu và xác nhận trình tự dòng cha mẹ.
Sử dụng bộ gen tham chiếu đúng theo loài. Sau đó lập bản đồ cấu trúc phiên mã đầy đủ: ranh giới exon, điểm bắt đầu và kết thúc của trình tự mã hóa, và tất cả các isoform đã được chú thích. Sau đó, xác minh chính dòng cha mẹ.Nếu một hướng dẫn bỏ qua một exon cấu thành, một isoform chức năng có thể vẫn tồn tại.
Khuếch đại PCR locus gốc, giải trình tự Sanger amplicon, và so sánh các cuộc gọi trình tự qua các lần truyền để xác nhận trình tự ban đầu. Sử dụng ICE để đánh dấu các biến thể hoặc đa hình tồn tại trước. Khi locus ban đầu đã được xác định, xếp hạng các hướng dẫn theo khả năng dịch khung và hồ sơ ngoài mục tiêu.
Xếp hạng các vị trí hướng dẫn theo khả năng dịch khung và rủi ro ngoài mục tiêu thấp
Sau khi xác nhận mô hình gen, tập trung lựa chọn hướng dẫn vào exon mã hóa cấu thành. Đây là các exon có mặt trong mọi isoform được chú thích, vì vậy các chỉnh sửa ở đó có khả năng làm gián đoạn tất cả các bản sao liên quan.
Rủi ro ngoài mục tiêu cũng quan trọng không kém. SpCas9 loại hoang dã có thể chịu được ba đến năm sai lệch, đặc biệt ở các vị trí xa PAM.Vì vậy, một hướng dẫn với điểm dự đoán trên mục tiêu mạnh vẫn có thể tạo ra các vết cắt không mong muốn, đặc biệt sau khi mở rộng dòng vô tính.
Một cách đơn giản để giảm rủi ro đó là cắt ngắn hướng dẫn xuống 17–18 bp. Điều này có thể giảm các sự kiện chỉnh sửa ngoài mục tiêu lên đến 500 lần mà không mất nhiều độ chính xác trên mục tiêu [2]. Trong thực tế, một hướng dẫn với 70% hiệu quả trên mục tiêu và hồ sơ ngoài mục tiêu sạch thường là điểm khởi đầu tốt hơn so với một hướng dẫn có 90% hiệu quả và một số vị trí dự đoán có rủi ro cao.
Xếp hạng đó nên được đưa thẳng vào lựa chọn nuclease dưới đây.
Chọn hệ thống chỉnh sửa phù hợp với mục tiêu knockout
Hệ thống chỉnh sửa định hình thiết kế hướng dẫn cũng như gen mục tiêu. Đối với công việc knockout không cần nhà tài trợ trong các dòng tế bào thịt nuôi cấy, các tùy chọn chính được liệt kê dưới đây.
| Hệ thống chỉnh sửa | Yêu cầu DSB | Cơ chế Knockout điển hình | Hệ quả thiết kế hướng dẫn | Sử dụng tốt nhất |
|---|---|---|---|---|
| SpCas9 Nuclease | Có | Indels dịch khung qua NHEJ | Hướng dẫn 20 bp + NGG PAM; nguy cơ ngoài mục tiêu cao | Knockout tiêu chuẩn trong các dòng chính hoặc bất tử mạnh mẽ |
| Hi-Fi Cas9 Variants | Có | Indels dịch khung qua NHEJ | Hướng dẫn 20 bp + NGG PAM; nguy cơ ngoài mục tiêu hẹp hơn | Khi nguy cơ ngoài mục tiêu tăng cao |
| Cas12a (Cpf1) | Có | Indels dịch khung qua NHEJ | PAM giàu T như TTTN; tạo ra các vết cắt so le | Vị trí giàu AT hoặc knockout đa mục tiêu của nhiều mục tiêu |
Đối với nhiều công việc knockout không cần donor trong các dòng tế bào thịt nuôi cấy, SpCas9 nuclease với hướng dẫn rút ngắn 17–18 bp là một điểm khởi đầu vững chắc.Các biến thể độ chính xác cao có ý nghĩa khi cảnh quan ngoài mục tiêu bị đông đúc. Cas12a là một lựa chọn tốt khi locus giàu AT hoặc khi một lần chuyển nạp cần phá vỡ nhiều gen cùng lúc.
Điểm chính rất đơn giản: khớp hệ thống với mục tiêu thay vì mặc định sử dụng nền tảng bạn thường dùng nhất. Lựa chọn đó thiết lập các quy tắc hướng dẫn và định hình quy trình knockout không cần donor và sàng lọc clone tiếp theo.
Thực hiện quy trình knockout không cần donor và sàng lọc clone một cách chính xác
Thực hiện quy trình không cần donor với khả năng truy xuất chỉnh sửa
Một khi hướng dẫn và nuclease đã được khóa, bước tiếp theo là cung cấp không cần donor và sàng lọc clone theo giai đoạn.
Trước khi giới thiệu bất kỳ nuclease nào, xác thực dòng cha mẹ. Ghi lại loài, nguồn mô, số lần chuyển và kiểu nhân hoặc hồ sơ STR. Hồ sơ khởi đầu đó cung cấp cho bạn một điểm tham chiếu rõ ràng cho mọi thứ tiếp theo.
Đối với việc giao hàng, các phức hợp RNP (ribonucleoprotein) - protein Cas9 và sgRNA được lắp ráp sẵn - được ưu tiên hơn so với các định dạng plasmid hoặc virus [2]. Nói một cách đơn giản, việc giao hàng RNP giữ trình chỉnh sửa bên trong tế bào trong thời gian ngắn hơn, điều này làm giảm khả năng cắt ngoài mục tiêu với tần suất thấp [2]. Sau khi chuyển gen, hãy cho tế bào đủ thời gian để phục hồi trước bất kỳ bước làm giàu nào. Làm giàu có thể tăng tỷ lệ tế bào đã chỉnh sửa trong nhóm, nhưng nó là tùy chọn và nên được ghi lại dù sao đi nữa [1].
Trong quy trình knockout không có nhà tài trợ, tất cả việc sửa chữa đều đến từ việc nối đầu. Điều đó quan trọng vì không phải mọi indel đều cho bạn một alen null. Đột biến trong khung đọc - indel là bội số chính xác của ba cặp base - có thể giữ nguyên khung đọc và có thể bảo tồn chức năng protein [1]. Vì vậy, sàng lọc kiểu gen cần phải cho thấy một alen null và, khi cần thiết, mất biallelic, không chỉ đơn giản là "một chỉnh sửa đã xảy ra".
Bảng dưới đây hiển thị các bản ghi đáng giữ lại ở mỗi bước để lịch sử chỉnh sửa có thể được theo dõi.
| Bước | Hồ sơ yêu cầu |
|---|---|
| Xác thực phụ huynh | Loài, nguồn mô, số lần truyền, kiểu nhân/karyotype/STR profile |
| Thiết kế hướng dẫn | ID gRNA, trình tự và độ dài |
| Giao hàng | Loại nuclease, định dạng giao hàng (RNP/plasmid), thông số chuyển nạp |
| Sàng lọc nhóm số lượng lớn | Điểm ICE/TIDE, tỷ lệ indels dịch khung hình |
| Cô lập dòng clonal | Phương pháp cô lập (FACS hoặc pha loãng giới hạn), ID dòng, bản đồ đĩa |
| Xác nhận kiểu gen | Giải trình tự đặc hiệu allele, xác nhận mất biallelic |
| Phù hợp chức năng | Dữ liệu thời gian nhân đôi, biểu hiện dấu hiệu bề mặt, khả năng thích nghi trong huyền phù |
Quyết định khi nào nhóm số lượng lớn hữu ích và khi nào cần dòng clonal
Các nhóm đã chỉnh sửa số lượng lớn hữu ích khi bạn cần kết quả nhanh chóng.Chúng hoạt động tốt cho việc xếp hạng hiệu quả của RNA hướng dẫn, thực hiện so sánh tăng trưởng sớm giữa các mục tiêu ứng viên và thực hiện xác nhận mục tiêu thông lượng cao mà không cần dành hàng tuần cho việc cô lập dòng. Vào năm 2023, các nhà nghiên cứu tại Ivy Farm Technologies đã sử dụng các nhóm tế bào cơ heo được chuyển nạp với Cas9 và sgRNA nhắm mục tiêu vào gen NF2 để đánh giá hiệu quả knockout ở mức độ nhóm với giải trình tự Sanger và phân tích ICE trước khi chuyển sang cô lập dòng [1].
Nhưng có một vấn đề. Kết nối đầu cuối cho bạn một quần thể hỗn hợp: tế bào kiểu hoang dã, chỉnh sửa dị hợp tử, dịch khung và alen trong khung đều có trong cùng một nhóm. Bất kỳ kiểu hình nào bạn đo lường đều là trung bình trên hỗn hợp đó, không phải là kết quả knockout rõ ràng. Đó là lý do tại sao một nhóm số lượng lớn không thể hỗ trợ một tuyên bố knockout đáng tin cậy [1].
| Tính năng | Nhóm Chỉnh Sửa Số Lượng Lớn | Dòng Tế Bào Đơn Lẻ |
|---|---|---|
| Tốc độ | Cao (ngày) | Thấp (tuần đến tháng) |
| Độ phân giải Genotype | Thấp (trung bình dân số) | Cao (xác nhận các alen xác định) |
| Biến thể Clonal | Bị che bởi trung bình dân số | Hiển thị; cho phép lựa chọn dòng hiệu suất tốt nhất |
| Gánh nặng Sàng lọc | Thấp | Cao |
| Tính phù hợp | Khám phá mục tiêu, xếp hạng hướng dẫn, nghiên cứu tăng trưởng sớm | Phát triển quy trình, xác nhận mất protein, phát hành quy định |
Chuyển sang nhân bản tế bào đơn khi phát triển quy trình cần một genotype xác định.Trong quá trình phát triển dòng vô tính, mở rộng dưới các điều kiện bảo tồn dòng dõi và tiếp tục theo dõi các dấu hiệu của cha mẹ [1].
Kiểm tra kiểu gen, mất protein và kiểu hình chức năng theo các giai đoạn
Quy trình sàng lọc hoạt động tốt nhất khi được thực hiện theo từng giai đoạn thay vì một lần duy nhất.
- Giai đoạn 1 là kiểm tra vị trí nhóm lớn. Khuếch đại PCR vùng mục tiêu và phân tích bằng giải trình tự Sanger với phân tích ICE. Điều này cung cấp cho bạn điểm hiệu quả chỉnh sửa tổng thể và phân bố indel, thường đủ để quyết định liệu việc cô lập dòng vô tính có đáng thực hiện hay không.
- Giai đoạn 2 giải quyết các alen cấp độ dòng vô tính. Khi các dòng vô tính được cô lập, giải trình tự amplicon (NGS) hoặc Sanger đặc hiệu alen có thể cho thấy liệu mỗi dòng vô tính có mang mất biallelic hay liệu một alen có thoát khỏi như một biến thể trong khung hay không.
- Giai đoạn 3 kiểm tra mất protein.Kiểu gen một mình không chứng minh được sự mất chức năng. Một protein bị cắt ngắn vẫn có thể giữ một số hoạt động. Western blot hoặc flow cytometry cung cấp bằng chứng trực tiếp về sự vắng mặt của protein.
- Giai đoạn 4 kiểm tra kiểu hình liên quan đến mục tiêu chỉnh sửa: thời gian nhân đôi, thích nghi trong huyền phù, hoặc đặc điểm cụ thể mà knockout được dự định thay đổi. Kết quả này cần duy trì ổn định trong suốt cửa sổ truyền định trước [1] [2].
Bảng dưới đây cho thấy mỗi phương pháp sàng lọc có thể cho bạn biết điều gì - và điều gì không thể.
| Phương pháp | Những gì nó thiết lập | Hạn chế |
|---|---|---|
| Phân tích Sanger + ICE | Tần suất indel cấp độ pool và phân bố frameshift | Không thể giải quyết các tổ hợp alen cụ thể trong từng tế bào riêng lẻ |
| Giải trình tự Amplicon (NGS) | Nhận dạng alen độ phân giải cao; phát hiện vị trí ngoài mục tiêu | Chi phí cao hơn; thời gian xử lý lâu hơn |
| PCR kỹ thuật số (ddPCR) | Định lượng chính xác tần suất chỉnh sửa hoặc số lượng bản sao | Yêu cầu thiết kế đầu dò cụ thể cho từng mục tiêu |
| Western Blot / Proteomics mục tiêu | Mất protein cấp độ mục tiêu | Bán định lượng; yêu cầu kháng thể đã được xác nhận |
| Flow Cytometry | Mất protein bề mặt hoặc nội bào; duy trì dấu hiệu dòng dõi | Yêu cầu kháng thể đã được xác nhận chất lượng cao |
| Thử nghiệm tăng trưởng đa lần truyền | Ổn định thời gian nhân đôi và khả năng sản xuất | Tốn thời gian; tối thiểu bốn lần truyền để có giá trị thống kê |
Đối với các nhóm chuyển từ phòng thí nghiệm sang sản xuất, hiểu chi phí mở rộng dòng tế bào trong các hệ thống bioreactor khác nhau là bước quan trọng tiếp theo.
Luôn so sánh các dòng clonal đã chỉnh sửa với dòng cha mẹ phù hợp chỉ có Cas9, không có sgRNA kiểm soát. Kiểm soát đó giúp tách biệt các hiệu ứng cụ thể của chỉnh sửa khỏi căng thẳng chuyển nạp và nuôi cấy trước khi xác nhận phù hợp với quy trình.
Xác nhận knockout cho phù hợp với quy trình sản xuất thịt nuôi cấy và phát hành
Xác nhận trên danh tính chỉnh sửa, hậu quả phân tử, chức năng tế bào và khả năng sản xuất
Một khi các xét nghiệm kiểu gen clonal và protein đã hoàn thành, bước tiếp theo là xác nhận phát hành. Tại giai đoạn này, chỉ xác nhận chỉ các dòng đã đáp ứng tiêu chí phát hành. Gói phát hành nên bao gồm bốn kiểm tra: danh tính chỉnh sửa, hậu quả phân tử, chức năng tế bào và khả năng sản xuất.
Danh tính chỉnh sửa được xác nhận bằng cách khuếch đại PCR của locus mục tiêu, sau đó là giải trình tự Sanger và phân tích ICE. Điều này cho thấy liệu bản sao có mang đột biến khung đọc hay knockout biallelic ở giai đoạn phát hành [1].
Tiếp theo, kiểm tra sự mất protein và duy trì dòng dõi bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy cho CD29, CD56 và CD90. Điều này xác nhận sự mất của protein mục tiêu và cho thấy rằng tế bào đã giữ được danh tính dòng dõi của nó thông qua quy trình chỉnh sửa [1].
Nếu các dấu hiệu dòng dõi đó vẫn còn, chuyển sang phân biệt. Kiểm tra chức năng tế bào sử dụng nhuộm BODIPY cho dòng mỡ và chỉ số hợp nhất myotube cho dòng cơ [1].
Chỉ sau đó bạn mới nên kiểm tra liệu dòng có còn hoạt động dưới điều kiện quy trình hay không. Đánh giá khả năng sản xuất nên được thực hiện trong nuôi cấy treo.Các đường cong tăng trưởng bình Erlenmeyer ba lần chạy qua ít nhất bốn lần truyền là hữu ích ở đây vì chúng có thể tiết lộ các khuyết tật tăng trưởng xuất hiện muộn hơn thay vì ngay lập tức [1][2].
Đo lường các đặc điểm quan trọng bằng cách sử dụng các đối chứng dòng cha mẹ phù hợp
Mỗi thử nghiệm trong khung xác thực nên được chạy đối chiếu với một đối chứng dòng cha mẹ phù hợp, hoặc là tế bào loại hoang dã hoặc một nhóm chỉ có Cas9, không có sgRNA. Nếu không có điểm tham chiếu đó, sẽ khó để xác định liệu sự thay đổi quan sát được đến từ chính việc knockout hay từ căng thẳng liên quan đến chỉnh sửa.
Nơi quy trình yêu cầu, thêm các kiểm tra căng thẳng và ổn định vào gói phát hành. Khả năng sống sót sau thử thách cắt cao hoặc amoniac có thể phục vụ như một chỉ số đọc liên quan đến quy trình. Ổn định bộ gen có thể được kiểm tra bằng cách lập karyotype hoặc bằng NGS có mục tiêu tại các vị trí ngoài mục tiêu dự đoán.
Đưa ra quyết định phát hành phù hợp với mục đích
Một bản sao chỉ nên tiến hành nếu nó vượt qua các ngưỡng đã được xác định trước về nhận dạng chỉnh sửa, hậu quả phân tử, chức năng tế bào và khả năng sản xuất, mà không gây hại cho nhận dạng, ổn định gen hoặc hiệu suất quy trình.
| Tầng Xác thực | Loại Bằng chứng | Xét nghiệm / Phương pháp | Kiểm soát | Tiêu chí Chấp nhận | Quyết định |
|---|---|---|---|---|---|
| Chỉnh sửa Danh tính | Đặc điểm alen | PCR + Giải trình tự Sanger + Phân tích ICE | Kiểu hoang dã gốc | Khung đọc bị lệch hoặc knockout biallelic được xác nhận | Tiếp tục / Không tiếp tục |
| Hậu quả Phân tử | Mất protein; duy trì dòng dõi | Đo tế bào dòng chảy (CD29, CD56, CD90) | Nhóm chỉ có Cas9 | Mất protein mục tiêu; các dấu hiệu dòng dõi được duy trì | Tiếp tục / Không tiếp tục |
| Chức năng Tế bào | Tiềm năng phân biệt | Nhuộm BODIPY hoặc chỉ số hợp nhất myotube | Dòng gốc phù hợp | Tiềm năng phân biệt được duy trì hoặc tăng cường | Tiếp tục / Không tiếp tục |
| Khả năng Sản xuất | Ổn định tăng trưởng trong huyền phù | Thời gian nhân đôi và khả năng sống sót qua nhiều lần truyền | Kiểm soát gốc | Thời gian nhân đôi ổn định, giảm trong huyền phù | Tiếp tục / Không tiếp tục |
| Khả năng Chịu đựng Căng thẳng Quy trình | Khả năng sống sót dưới căng thẳng | Thử nghiệm khả năng sống sót sau thử thách cắt cao hoặc amoniac | Kiểm soát môi trường tiêu chuẩn | Khả năng sống sót cao dưới căng thẳng liên quan đến quy trình | Tiếp tục / Không tiếp tục |
| Ổn định Genomic | An toàn ngoài mục tiêu | Phân tích karyotype hoặc NGS mục tiêu tại các vị trí ngoài mục tiêu dự đoán | Kiểu hoang dã gốc | Không có đột biến hoặc chuyển vị ngoài mục tiêu không chấp nhận được | Tiếp tục / Không tiếp tục |
Thí nghiệm CRISPR KO so với CRISPR KI sử dụng CRISPR-Cas9
Kết luận: Kết nối Thành công Chỉnh sửa với Liên quan Sản xuất
Sau khi xác thực, câu hỏi cuối cùng là liệu chỉnh sửa có cải thiện sản xuất hay không.Trong một chương trình thịt nuôi cấy, một gene knockout chỉ đáng giữ lại nếu nó mang lại lợi ích sản xuất có thể đo lường được - không chỉ là một chỉnh sửa đã được xác nhận [1].
Trường hợp NF2 cho thấy lý do tại sao kiểu gen phải được kiểm tra cùng với biểu hiện protein, danh tính dòng và dữ liệu tăng trưởng trước khi một dòng được đánh giá là phù hợp. Đó là sự khác biệt giữa một bản sao được đặc trưng và một dòng chỉ có một chỉnh sửa kiểu gen.
Ngay cả khi đó, ngữ cảnh quy trình có thể thay đổi kết quả. Kiểm tra bản sao trong cùng môi trường, định dạng nuôi cấy và mật độ tế bào mà nó sẽ đối mặt trong sản xuất, không chỉ trong nuôi cấy khám phá. Điều đó có nghĩa là kiểm tra hiệu suất qua thành phần môi trường, định dạng treo và độ ổn định qua các lần chuyển trước khi đưa ra quyết định phát hành.
Chỉ những bản sao vượt qua tất cả bốn cấp độ phát hành mới sẵn sàng để phát hành.
Câu hỏi thường gặp
Tại sao chỉ riêng kiểu gen là không đủ?
Chỉ riêng kiểu gen là không đủ. Trong sản xuất thịt nuôi cấy, hiệu suất phụ thuộc vào sự tương tác giữa tiềm năng di truyền, điều kiện quy trình, và bộ nhớ trạng thái tế bào.
Chỉnh sửa gen có thể khắc phục một số giới hạn cứng, nhưng nó không thay thế được việc kiểm soát quy trình chính xác. Môi trường có thể cung cấp các tín hiệu bên ngoài, nhưng những tín hiệu đó không thiết lập vĩnh viễn bộ nhớ trạng thái tế bào. Và một khi các tín hiệu bị loại bỏ, chúng không thể ngăn chặn tiếng ồn phiên mã quay trở lại.
Đó là lý do tại sao sản xuất thành công phụ thuộc vào sự hoạt động cùng nhau của cả ba yếu tố: thiết kế gen, tối ưu hóa môi trường, và phù hợp với bioreactor.
Khi nào tôi nên sử dụng các nhóm thay vì các bản sao?
Sử dụng các nhóm trong giai đoạn đầu của thiết kế knockout gen và phát triển quy trình.Họ cho phép bạn đánh giá hiệu quả tổng thể của một chỉnh sửa nhanh hơn trên một quần thể hỗn hợp, điều này giúp với việc sàng lọc thông lượng cao và xác nhận sớm.
Các nhóm cũng giảm nguy cơ thiên lệch hoặc trôi dạt kiểu hình có thể xuất hiện khi bạn dựa vào một dòng đơn lẻ quá sớm.
Làm thế nào để tôi biết một knockout đã sẵn sàng sản xuất?
Một knockout đã sẵn sàng sản xuất khi dòng tế bào thịt nuôi cấy đã chỉnh sửa duy trì ổn định di truyền và kiểu hình qua các lần truyền kéo dài, đồng thời liên tục giữ được khả năng sống cao và chức năng cơ hoặc sự phát triển.
Nó cũng cần phù hợp với yêu cầu quy trình của bạn. Điều đó có thể bao gồm thích nghi với hệ thống treo hoặc thời gian nhân đôi ngắn hơn trong điều kiện không có huyết thanh. Các chỉnh sửa gen, công thức môi trường và khả năng tương thích của bioreactor cần được kiểm tra như một hệ thống, không phải là các phần riêng biệt.
