การตรวจสอบเซลล์ที่มีชีวิตในไบโอรีแอคเตอร์เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง การขยายขนาดต้องการเครื่องมือที่แม่นยำเพื่อติดตามสุขภาพและการเจริญเติบโตของเซลล์แบบเรียลไทม์ บทความนี้ทบทวนวิธีการสำคัญ รวมถึงเซ็นเซอร์ความจุ, สเปกโทรสโกปีรามาน, และฟลูออเรสเซนซ์ โดยเน้นถึงจุดแข็งและข้อจำกัดสำหรับการใช้งานในอุตสาหกรรม
ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญ:
- เซ็นเซอร์ความจุ: วัดความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิตอย่างต่อเนื่อง มีประสิทธิภาพสำหรับเซลล์ที่ยึดติดแต่ไวต่อการเปลี่ยนแปลงขนาดเซลล์
- สเปกโทรสโกปีรามาน: ติดตามเมตาบอไลต์เช่นกลูโคสและแลคเตท เหมาะสำหรับสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำแต่ต้องการการสอบเทียบที่ซับซ้อน
- ฟลูออเรสเซนซ์: ตรวจสอบกิจกรรมเมตาบอลิกผ่านสัญญาณ NADH/NADPH รวดเร็วแต่ได้รับผลกระทบจากสัญญาณพื้นหลังของสื่อ
ความท้าทาย:
- การทดสอบแบบดั้งเดิมเช่น Trypan Blue เป็นการทำลายและช้า
- ความหนาแน่นของเซลล์สูงและสื่อที่ซับซ้อนรบกวนวิธีการทางแสง
- การอุดตันของเซ็นเซอร์และความต้องการในการสอบเทียบจำกัดประสิทธิภาพ
การเลือกวิธีที่เหมาะสมขึ้นอยู่กับความต้องการของกระบวนการ ขนาดของไบโอรีแอคเตอร์ และความต้องการด้านความปลอดเชื้อ สำหรับการดำเนินงานขนาดใหญ่ การรวมเทคนิคหลายอย่างมักให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด
เซ็นเซอร์ที่ใช้ความจุไฟฟ้าสำหรับความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิต
วิธีการทำงานของ Dielectric Spectroscopy
เซ็นเซอร์ความจุไฟฟ้า หรือที่รู้จักกันในชื่อเซ็นเซอร์อิมพีแดนซ์ความถี่วิทยุ ปฏิบัติต่อเซลล์ที่มีชีวิตราวกับว่าเป็นตัวเก็บประจุทรงกลมขนาดเล็ก เมื่อมีการใช้สนามไฟฟ้ากับสารแขวนลอยของเซลล์ ไอออนในสื่อเพาะเลี้ยงและภายในไซโตพลาสซึมของเซลล์จะเริ่มเคลื่อนที่ พวกมันจะพบกับเยื่อหุ้มพลาสมาที่ไม่นำไฟฟ้าในที่สุด ทำให้เกิดการเกิดขั้ว - การแยกประจุข้ามเยื่อหุ้มเซลล์[5][6].
นี่คือกุญแจสำคัญ: เฉพาะเซลล์ที่มีเยื่อหุ้มที่สมบูรณ์เท่านั้นที่สามารถเกิดการมีขั้วได้ เซลล์ที่ตายแล้วซึ่งขาดเยื่อหุ้มที่สมบูรณ์ไม่สามารถดักจับไอออนได้ ดังนั้นจึงไม่ส่งผลต่อสัญญาณความจุ [5][7]. John Carvell, ผู้อำนวยการฝ่ายขายและการตลาดที่ Aber Instruments Ltd., อธิบายเรื่องนี้ได้ดี:
"ความต้านทานอิมพีแดนซ์ความถี่วิทยุ (RF)... โดยทั่วไปถือว่าเป็นวิธีที่แข็งแกร่งและเชื่อถือได้ที่สุดในการตรวจสอบความเข้มข้นของเซลล์ที่มีชีวิตในวัฒนธรรมเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม" [5]
สเปกโทรสโกปีแบบไดอิเล็กทริกสร้างขึ้นจากการวัดคุณสมบัติไดอิเล็กทริก (หรือความสามารถในการยอมรับ) ของการระงับเซลล์ในความถี่ต่างๆ กระบวนการนี้สร้างกราฟการกระจายตัวแบบ β ซึ่งแสดงให้เห็นว่าความสามารถของเซลล์ในการมีขั้วลดลงเมื่อความถี่ของสนามไฟฟ้าเพิ่มขึ้น [6].การอ่านความถี่เดียวมักสะท้อนถึง ปริมาตรชีวภาพที่มีชีวิต - ปริมาตรรวมที่ถูกครอบครองโดยเซลล์ที่มีชีวิต - มากกว่าแค่จำนวนเซลล์ เซลล์ที่ใหญ่กว่าย่อมมีส่วนร่วมในสัญญาณมากกว่าเซลล์ที่เล็กกว่า [5][6].
หลักการเหล่านี้เป็นแกนหลักของเทคโนโลยีเซ็นเซอร์ความจุ ทำให้เป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าในระบบเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ
การใช้เซ็นเซอร์ความจุในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
เซ็นเซอร์ความจุสามารถใช้งานได้ทั้งในระบบเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพที่ใช้ครั้งเดียวและใช้หลายครั้ง สำหรับการตั้งค่าที่ใช้ครั้งเดียว แผ่นเซ็นเซอร์ที่ใช้แล้วทิ้งสามารถเชื่อมเข้ากับถุงฟิล์มยืดหยุ่นหรือใส่ผ่านพอร์ตท่อที่ติดตั้งล่วงหน้า [5][9] ในระบบสแตนเลส โพรบขนาด 12 มม. ที่ใช้ซ้ำได้จะเชื่อมต่อผ่านพอร์ตปลอดเชื้อ [9].
ตัวอย่างที่ใช้งานได้จริงมาจากมหาวิทยาลัยอาเคิน ซึ่งนักวิจัยใช้ระบบ BioPAT ViaMass ในไบโอรีแอคเตอร์แบบใช้ครั้งเดียวขนาด 20 ลิตรที่มีการเคลื่อนไหวแบบโยกเพื่อเฝ้าติดตามเซลล์ CHO DG44 พวกเขาประสบความสำเร็จในการหาความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่ง (ค่าสัมประสิทธิ์การถดถอย 0.95) ระหว่างการอ่านค่าความจุและปริมาตรเซลล์รวม [5] ในทำนองเดียวกัน Xpand Biotechnology ในประเทศเนเธอร์แลนด์ได้ใช้เซ็นเซอร์ชีวมวล Aber ในระบบขยายเซลล์ Scinus ของพวกเขาเพื่อติดตามเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์ (MSCs) ที่เติบโตบนไมโครแคร์ริเออร์ที่ความหนาแน่น 60 กรัม/ลิตร เซ็นเซอร์สามารถติดตามโปรไฟล์การเติบโตได้อย่างมีประสิทธิภาพในปริมาตรที่แตกต่างกันตั้งแต่ 150 มิลลิลิตรถึง 1 ลิตร โดยผลลัพธ์สอดคล้องกับการวัดอ้างอิงแบบออฟไลน์อย่างใกล้ชิด [5].
สำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง เซ็นเซอร์ความจุมีความโดดเด่นเมื่อทำงานกับ เซลล์ที่ยึดติดบนไมโครแคร์ริเออร์.ไม่เหมือนกับวิธีการทางแสงที่อาจมีปัญหากับตัวพาหะที่เป็นของแข็ง เซ็นเซอร์ความจุสามารถเจาะโครงสร้างเหล่านี้ได้ ความสามารถนี้ทำให้พวกมันมีประโยชน์อย่างยิ่งในการตรวจสอบเซลล์ที่ต้องพึ่งพาการยึดเกาะ ซึ่งเป็นรากฐานของการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง [8].
จุดแข็งและจุดอ่อนของเซ็นเซอร์ความจุ
เซ็นเซอร์ความจุให้ข้อมูลแบบต่อเนื่องและเรียลไทม์โดยไม่มีความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนหรือความล่าช้าที่เกี่ยวข้องกับการสุ่มตัวอย่างด้วยตนเอง ปัจจุบันพวกมันเป็นเครื่องมือออนไลน์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์เพียงอย่างเดียวสำหรับการประเมินความมีชีวิตของเซลล์ในกระบวนการชีวภาพอุตสาหกรรม [7] ในขณะที่วิธีการออฟไลน์แบบดั้งเดิมเช่นการทดสอบ trypan blue มีข้อผิดพลาดสัมพัทธ์ประมาณ 10% การสแกนความถี่ความจุสามารถลดข้อผิดพลาดนี้ลงเหลือระหว่าง 5.5% ถึง 11% [6].
อย่างไรก็ตาม เซ็นเซอร์เหล่านี้ก็มีข้อจำกัดของพวกมันเองการวัดความถี่เดียวไม่สามารถแยกแยะระหว่างการเพิ่มจำนวนเซลล์และการเพิ่มขนาดเซลล์ได้ ตัวอย่างเช่น หากเซลล์มีการเติบโตอย่างมากในเส้นผ่านศูนย์กลางระหว่างการทำงาน - ไม่ว่าจะเกิดจากความเครียดหรือช่วงการตาย - สัญญาณอาจแสดงจำนวนเซลล์ที่ไม่ถูกต้องเว้นแต่จะใช้การสแกนหลายความถี่ [6] นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงในตัวกลางแขวนลอย เช่น การเติมอาหารหรือการเจือจาง สามารถทำให้เกิด "การลดลง" ชั่วคราวในข้อมูลที่ไม่สะท้อนการเปลี่ยนแปลงของชีวมวลจริง [5] ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบเคลื่อนไหวโยก เซ็นเซอร์อาจพบกับพื้นที่ว่างที่เป็นแก๊สชั่วคราว ซึ่งต้องการอัลกอริธึมการกรองขั้นสูงเพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนสัญญาณ [5].
ปัจจัยเหล่านี้มีความสำคัญเมื่อปรับแต่งการตรวจสอบเซลล์มีชีวิตสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
วิธีการสเปกโทรสโกปีสำหรับการวิเคราะห์เซลล์มีชีวิต
สเปกโทรสโกปีแบบรามานและ NIR
สเปกโทรสโกปีแบบรามานใช้การกระเจิงแสงที่ไม่ยืดหยุ่นจากเลเซอร์ 785 นาโนเมตรเพื่อสร้างลายนิ้วมือโมเลกุล ทำให้สามารถวัดเมตาบอไลต์เช่น กลูโคส แลคเตท กลูตามีน และแอมโมเนียมได้พร้อมกัน ในทางกลับกัน สเปกโทรสโกปีแบบ NIR (800–2,500 นาโนเมตร) ตรวจจับการดูดซับแสงจากโอเวอร์โทนและแถบรวม [10][12][13][14]. ความไวต่อการกระจายแสงของน้ำที่น้อยของรามานทำให้เหมาะสำหรับสภาพแวดล้อมที่มีน้ำเช่นการเพาะเลี้ยงเซลล์ ในขณะที่ความไวต่อการกระจายแสงของน้ำที่สูงของ NIR - เนื่องจากสัญญาณการยืด O–H ที่แข็งแกร่ง - สามารถบดบังข้อมูลทางชีวเคมีที่สำคัญได้ [10][12][14].
ในเดือนมีนาคม 2017 Lonza Biologics ได้เปรียบเทียบ NIR, Raman และ 2D-fluorescence ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาดเล็ก 15 มล. (ระบบ ambr™) พวกเขาพบว่า Raman เป็นวิธีที่เชื่อถือได้มากที่สุดในการวัดแลคเตทและกลูโคส ในขณะที่ NIR ทำงานได้ดีกว่าในการทำนายระดับกลูตามีนและไอออนแอมโมเนียม [10][11].
ในเดือนเมษายน 2022 นักวิจัยที่ Sartorius Stedim Biotech ได้รวมเซลล์ไหล Raman แบบอินไลน์เข้ากับกระแสการเก็บเกี่ยวที่ปราศจากเซลล์ของกระบวนการเพอร์ฟิวชั่นเซลล์ CHO โดยใช้ HyperFluxPRO สเปกโตรมิเตอร์ Raman ที่มีเลเซอร์ 785 นาโนเมตร พวกเขาประสบความสำเร็จในการควบคุมการป้อนกลับกลูโคสอัตโนมัติ โดยรักษาความเข้มข้นไว้ที่ 4 กรัม/ลิตร และ 1.5 กรัม/ลิตร โดยมีความแปรปรวน ±0.4 กรัม/ลิตร ตลอดหลายวัน [13]. J.Lemke จาก Sartorius Stedim Biotech กล่าวไว้ว่า:
"ผลลัพธ์แสดงให้เห็นถึงศักยภาพสูงของสเปกโทรสโกปีแบบรามานสำหรับการตรวจสอบและควบคุมกระบวนการขั้นสูงของกระบวนการเพอร์ฟิวชั่นด้วยไบโอรีแอคเตอร์และวิธีการวัดที่ไม่ขึ้นกับขนาด" [13]
ในเดือนพฤษภาคม 2011, Bristol-Myers Squibb ใช้โพรบรามานแบบอินไลน์ในไบโอรีแอคเตอร์ขนาด 500 ลิตรเพื่อตรวจสอบพารามิเตอร์หลายอย่าง รวมถึงกลูตามีน, กลูตาเมต, กลูโคส, แลคเตท, แอมโมเนียม, ความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิต (VCD), และความหนาแน่นของเซลล์ทั้งหมด (TCD) สเปกตรัมถูกเก็บทุกสองชั่วโมงด้วยเครื่องมือ Kaiser Optical Systems RamanRXN3 ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสามารถของรามานในการติดตามการเพิ่มขึ้นของสารอาหารและการลดลงของเมตาบอไลต์ระหว่างการเติมอาหารในกระบวนการผลิตขนาดใหญ่ [14].
ในขณะที่การสเปกโทรสโกปีแบบรามานและ NIR ให้ข้อมูลเชิงลึกทางเคมีอย่างละเอียด การใช้วิธีการฟลูออเรสเซนส์และ UV-Vis จะให้มุมมองที่เสริมเกี่ยวกับเมแทบอลิซึมของเซลล์และชีวมวล
ฟลูออเรสเซนส์และสเปกโทรสโกปี UV-Vis
สเปกโทรสโกปี UV-Vis วัดการดูดซับหรือการกระเจิงของแสงเพื่อประมาณชีวมวลรวม [16] อย่างไรก็ตาม วิธีการที่ตรงไปตรงมาและใช้กันอย่างแพร่หลายนี้มีปัญหาในการแยกแยะระหว่างเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้ว และความแม่นยำจะลดลงเมื่อความหนาแน่นของเซลล์สูงขึ้น [16].
ฟลูออโรเมตรี ซึ่งมีความไวมากกว่า UV-Vis มุ่งเน้นไปที่ตัวบ่งชี้ภายในเซลล์เฉพาะ เช่น NADH และ NADPH ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ของกิจกรรมเมแทบอลิซึม ฟลูออโรเมตรีในสถานที่ใช้แสงอัลตราไวโอเลต 366 นาโนเมตรเพื่อกระตุ้น NADH/NADPH ซึ่งจะเรืองแสงที่ประมาณ 460 นาโนเมตร [16].Veer Pramod Perwez อธิบายว่า:
"กลยุทธ์การตรวจสอบอย่างต่อเนื่องที่พัฒนาขึ้นจนถึงปัจจุบันที่ให้ข้อมูลเกี่ยวกับสภาวะทางชีวเคมีหรือเมตาบอลิซึมของประชากรเซลล์คือ in situ fluorometry" [16]
ในการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง ซึ่งข้อมูลแบบเรียลไทม์เป็นสิ่งสำคัญ ฟลูออเรสเซนซ์ให้ข้อมูลย้อนกลับอย่างรวดเร็วเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึม ในขณะที่ UV-Vis เสนอวิธีการที่ประหยัดในการประมาณมวลชีวภาพ ฟลูออเรสเซนซ์สามารถติดตามการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมและตรวจจับการลดลงของซับสเตรตแบบเรียลไทม์โดยการตรวจสอบระดับ NADH ตัวอย่างเช่น ในการศึกษาแห่งหนึ่ง ฟลูออเรสเซนซ์ 2D วัดความเข้มข้นของแอมโมเนียมด้วย RMSECV ที่ 0.031 g/L ซึ่งมีประสิทธิภาพดีกว่า Raman และ NIR ในการตั้งค่าชีวปฏิกรณ์ขนาดเล็ก [11] นอกจากนี้ แพลตฟอร์มไมโครฟลูอิดิกอัตโนมัติสามารถรวมกล้องจุลทรรศน์ brightfield (เพื่อวัดความเข้มข้นของเซลล์ทั้งหมด) กับการตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้ propidium iodide เพื่อกำหนดความมีชีวิตของเซลล์ในเวลาเพียง 10 นาที3 นาที [15].
การเปรียบเทียบวิธีการสเปกโทรสโกปีที่แตกต่างกัน
เมื่อเปรียบเทียบเทคนิคเหล่านี้ แต่ละวิธีมีจุดแข็งที่แตกต่างกันสำหรับการตรวจสอบไบโอรีแอคเตอร์ รามานโดดเด่นในด้านความสามารถในการทำนายกลูโคส แลคเตท และไตเตอร์แอนติบอดี เนื่องจากการระบุลายนิ้วมือโมเลกุลและการรบกวนจากน้ำที่ต่ำ [10][11]. NIR แม้ว่าจะมีความไวต่อน้ำ แต่มีประสิทธิภาพมากกว่าในการตรวจสอบกลูตามีนและแอมโมเนียม [10][12]. ฟลูออเรสเซนซ์ให้ข้อมูลเชิงลึกที่ละเอียดเกี่ยวกับกิจกรรมเมตาบอลิซึมและความมีชีวิต ในขณะที่ UV-Vis ยังคงเป็นตัวเลือกที่เรียบง่ายและคุ้มค่าสำหรับการประมาณมวลชีวภาพรวม [16].
การวิเคราะห์หลายตัวแปรช่วยเพิ่มการตีความของสเปกตรัมที่ซับซ้อน ทำให้สามารถตรวจสอบสารวิเคราะห์หลายตัวได้พร้อมกัน [10][13][14]. สำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง การเลือกวิธีสเปกโตรสโกปีที่เหมาะสมขึ้นอยู่กับเมตาบอไลต์ที่ต้องการตรวจสอบ ขนาดของไบโอรีแอคเตอร์ และการใช้ระบบแบบใช้ครั้งเดียวหรือหลายครั้ง เทคนิคเหล่านี้รวมกันช่วยให้สามารถตรวจสอบเซลล์ได้อย่างแม่นยำ โดยที่ความเข้ากันได้ของรามานกับสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำและความสามารถในการวิเคราะห์หลายตัวทำให้มันน่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับการดำเนินงานขนาดใหญ่ [13][14].
การเพาะเลี้ยงเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม - การใช้รามานเป็นวิธีการตรวจสอบ &และควบคุมกระบวนการชีวภาพต้นน้ำ
sbb-itb-ffee270
วิธีการขั้นสูงสำหรับสรีรวิทยาและความมีชีวิตของเซลล์
นอกเหนือจากสเปกโทรสโกปีแล้ว เทคนิคที่ล้ำสมัยยังให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับสรีรวิทยาและความมีชีวิตของเซลล์ได้ลึกซึ้งยิ่งขึ้น
FTIR สำหรับการตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์และการเกิดอะพอพโทซิส
สเปกโทรสโกปี FTIR ใช้การสั่นสะเทือนของโมเลกุลในโปรตีน ไขมัน และคาร์โบไฮเดรตเพื่อตรวจจับ ความเครียดจากสารอาหาร และ การเกิดอะพอพโทซิสในระยะแรก ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ที่สำคัญของสุขภาพเซลล์ที่ลดลงในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
วิธีการหนึ่งคือ ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection) วิเคราะห์ความแปรปรวนของสเปกตรัมในบริเวณความถี่สูงเพื่อแยกแยะระหว่างเซลล์ที่มีสุขภาพดีและเซลล์ที่ขาดสารอาหาร ในเดือนพฤษภาคม 2024 นักวิจัยที่ Dxcover Ltd.ใช้แพลตฟอร์ม ATR-FTIR ที่ติดตั้งด้วยองค์ประกอบการสะท้อนภายในแบบใช้แล้วทิ้ง (IREs) เพื่อตรวจสอบสุขภาพของเซลล์ CHO โดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) พวกเขาสามารถแยกแยะเซลล์ที่มีสุขภาพดีออกจากเซลล์ที่ขาดสารอาหารในพื้นที่ PC ได้สำเร็จ แพลตฟอร์มนี้ประสบความสำเร็จในการบรรลุค่า R² หลายผลลัพธ์ที่น่าประทับใจใกล้เคียงกับ 0.98 สำหรับกลูโคสและกรดแลคติก ให้ข้อมูลเชิงลึกแบบเรียลไทม์เกี่ยวกับความมีชีวิตของเซลล์ [17] เนื่องจากการสะสมของกรดแลคติกสามารถนำไปสู่การตายของเซลล์ การตรวจสอบแบบเรียลไทม์นี้จึงช่วยให้สามารถแทรกแซงได้ทันเวลาเพื่อรักษาสุขภาพของเซลล์
ระบบ FTIR สมัยใหม่ได้รับการออกแบบด้วย IREs แบบใช้แล้วทิ้งหรือโพรบที่จุ่มลงไปเพื่อการบูรณาการโดยตรงในสภาพแวดล้อมของเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ การตั้งค่านี้ไม่เพียงแต่ให้ข้อมูลแบบเรียลไทม์ แต่ยังลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน [17]ตามที่เน้นใน Frontiers in Bioengineering and Biotechnology:
"เทคโนโลยีที่ใช้สเปกโทรสโกปีเหมาะสมอย่างยิ่งในฐานะวิธีการ PAT เนื่องจากไม่ทำลายและต้องการการเตรียมตัวอย่างน้อยที่สุด" [17]
การขยายความสามารถเหล่านี้ การสแกนความจุหลายความถี่ช่วยแก้ไขข้อจำกัดของวิธีการความถี่เดียว
การสแกนความจุหลายความถี่
ในขณะที่เซ็นเซอร์ความจุความถี่เดียวมีประโยชน์ในการวัดปริมาตรเซลล์ที่มีชีวิต (VCV) แต่พวกเขาพบปัญหาในการแยกแยะระหว่างการเปลี่ยนแปลงขนาดเซลล์และจำนวนเซลล์ ข้อจำกัดนี้กลายเป็นปัญหาโดยเฉพาะในระหว่างการตายของเซลล์ (apoptosis) เมื่อเส้นผ่านศูนย์กลางของเซลล์มักจะเพิ่มขึ้น [18].การสแกนความจุหลายความถี่ แก้ไขปัญหานี้โดยการวัดค่าความจุไฟฟ้าผ่านช่วงความถี่ 50–20,000 kHz จับภาพเส้นโค้งการกระจายตัว β เพื่อประเมินความเข้มข้นของเซลล์ที่มีชีวิตได้อย่างแม่นยำโดยไม่คำนึงถึงความแปรปรวนของขนาด [18].
ในเดือนตุลาคม 2019 นักวิจัยที่ Sartorius Stedim Biotech ใช้ FUTURA pico probe ของ Aber Instruments เพื่อติดตามเซลล์ DG44 CHO ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาด 250 มล. โดยการใช้การสร้างแบบจำลอง Orthogonal Partial Least Squares (OPLS) กับความถี่ 25 ช่วงที่แยกกัน พวกเขาลดข้อผิดพลาดในการทำนาย VCC เหลือเพียง 5.5% ถึง 11% ซึ่งเป็นการปรับปรุงที่สำคัญจากอัตราข้อผิดพลาด 16% ถึง 23% ที่เห็นได้จากการวัดความถี่เดียว [18]. แบบจำลองสามารถติดตามความเข้มข้นของเซลล์ที่เกิน 10 ล้านเซลล์/มล. ได้อย่างมีประสิทธิภาพและระบุการเบี่ยงเบนที่เกิดจากการเจือจางและการเปลี่ยนแปลงการให้อาหารได้อย่างรวดเร็ว โดยมีขอบเขตข้อผิดพลาด 6.7% ถึง 13.2% [18].
ความถี่ลักษณะเฉพาะ (fC) ซึ่งบ่งบอกถึงจุดที่การเกิดโพลาไรเซชันของเซลล์เสร็จสมบูรณ์ครึ่งหนึ่ง จะเปลี่ยนไปตามขนาดเซลล์และความสามารถในการเกิดโพลาไรเซชัน ซึ่งให้เครื่องหมายเพิ่มเติมสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางสรีรวิทยา โดยเฉพาะในช่วงระยะการตายของเซลล์เมื่อรูปร่างมีการเปลี่ยนแปลงอย่างเห็นได้ชัด [18]. ตามที่ Analytical and Bioanalytical Chemistry อธิบาย:
"อิทธิพลของ VCC และเส้นผ่านศูนย์กลางของเซลล์ต่อสัญญาณการยอมให้ผ่านไม่สามารถแยกแยะได้ด้วยการวัดความถี่เพียงครั้งเดียว" [18]
การเปรียบเทียบวิธีการวิเคราะห์สำหรับการตรวจสอบเซลล์มีชีวิต
การเปรียบเทียบวิธีการวิเคราะห์สำหรับการตรวจสอบเซลล์มีชีวิตในไบโอรีแอคเตอร์
ส่วนนี้จะพิจารณาอย่างละเอียดเกี่ยวกับวิธีการวิเคราะห์หลักที่ใช้สำหรับการตรวจสอบเซลล์มีชีวิตในไบโอรีแอคเตอร์เนื้อสัตว์เพาะเลี้ยง โดยอิงจากเทคนิคขั้นสูงที่ได้กล่าวถึงก่อนหน้านี้
การเลือกวิธีที่ดีที่สุดต้องคำนึงถึงความแม่นยำ ความรวดเร็ว และความเป็นไปได้ในการปฏิบัติ แต่ละเทคนิคมีจุดแข็งที่แตกต่างกัน ไม่ว่าจะเป็นการติดตามความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิต การตรวจสอบกิจกรรมเมตาบอลิก หรือการรักษาความปลอดเชื้อในระบบที่ใช้ครั้งเดียว
เซ็นเซอร์ที่ใช้ความจุไฟฟ้า เป็นตัวเลือกออนไลน์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์เพียงตัวเดียวที่ออกแบบมาเฉพาะสำหรับการตรวจสอบความมีชีวิต [7].เซ็นเซอร์เหล่านี้วัดปริมาตรเซลล์ที่มีชีวิตโดยการตรวจจับการโพลาไรเซชันของเซลล์ที่มีเยื่อหุ้มที่สมบูรณ์ในสนามไฟฟ้าสลับ ในขณะที่ระบบความถี่เดียวอาจมีปัญหากับความแม่นยำเมื่อขนาดเซลล์แตกต่างกัน การสแกนหลายความถี่ช่วยปรับปรุงความแม่นยำอย่างมาก โดยมีขอบเขตข้อผิดพลาดอยู่ที่ 5.5%–11% [18].
วิธีการทางสเปกโทรสโกปี - เช่น รามาน, NIR, และสเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ - ให้มุมมองที่ครอบคลุมมากขึ้นเกี่ยวกับกิจกรรมเมตาบอลิซึม โดยติดตามพารามิเตอร์หลายตัวควบคู่ไปกับชีวมวล วิธีการเหล่านี้ไม่รุกราน ทำให้เหมาะสำหรับไบโอรีแอคเตอร์แบบใช้ครั้งเดียวที่ความปลอดเชื้อเป็นสิ่งสำคัญ อย่างไรก็ตาม พวกเขามีความท้าทาย: ระบบสเปกโทรสโกปีต้องการการสอบเทียบอย่างกว้างขวางด้วยโมเดลเคโมเมตริก และมักจะมีค่าใช้จ่ายเริ่มต้นที่สูงกว่าหัววัดความจุไฟฟ้า
สเปกโทรสโกปี FTIR มีประสิทธิภาพเป็นพิเศษในการตรวจจับสัญญาณเริ่มต้นของการตายของเซลล์และความเครียดจากสารอาหารผ่านการวิเคราะห์การสั่นสะเทือนของโมเลกุล อย่างไรก็ตาม การดูดซับน้ำที่แรงของมันจำกัดการใช้งานสำหรับการตรวจสอบแบบอินไลน์อย่างต่อเนื่องในสภาพแวดล้อมที่เป็นน้ำ [7] แทนที่จะเป็นเช่นนั้น FTIR ทำงานได้ดีที่สุดในฐานะวิธีการที่ใช้ในสายการผลิต โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อจับคู่กับการวิเคราะห์แบบหลายตัวแปรสำหรับการติดตามเมตาบอไลต์แบบเรียลไทม์
ตารางเปรียบเทียบวิธีการวิเคราะห์
| วิธีการ | ความสามารถแบบเรียลไทม์ | ความเข้ากันได้กับไบโอรีแอคเตอร์ | ความต้องการการสอบเทียบ | ข้อจำกัดสำคัญ |
|---|---|---|---|---|
| เซ็นเซอร์ความจุไฟฟ้า | ใช่ (ในสาย/ออนไลน์) | สูง (แบบกวน, แบบโยก, SUBs) | ต่ำถึงปานกลาง | ไวต่อฟองอากาศและการเปลี่ยนแปลงขนาด/รูปร่างของเซลล์ |
| รามานสเปกโทรสโกปี | ใช่ (ในสาย) | ปานกลาง (ต้องการพอร์ตโพรบ) | สูง (เคโมเมตริกส์) | ค่าอุปกรณ์สูง; การตีความข้อมูลที่ซับซ้อน |
| NIR สเปกโทรสโกปี | ใช่ (ในสาย/ที่สาย) | สูง | สูง (มัลติแวริเอท) | ความไวต่อการรบกวนจากน้ำและการเปลี่ยนแปลงของสื่อ |
| ฟลูออเรสเซนซ์ | ใช่ (ในสาย) | สูง | ปานกลาง | ฟลูออเรสเซนซ์พื้นหลังจากสื่อ; การซีดจางจากแสง |
| FTIR | ใช่ (ที่สาย) | ปานกลาง | สูง | การดูดซับน้ำที่แข็งแกร่งจำกัดการใช้งานในสายในสื่อที่มีน้ำ |
สำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง ซึ่งความแม่นยำและความน่าเชื่อถือเป็นสิ่งที่ไม่สามารถต่อรองได้ การจับคู่วิธีการวิเคราะห์กับข้อกำหนดของกระบวนการเฉพาะเป็นกุญแจสำคัญในการบรรลุประสิทธิภาพของเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพที่เหมาะสมแพลตฟอร์มเช่น
บทสรุปและคำแนะนำ
การเลือกวิธีการวิเคราะห์ที่เหมาะสมเกี่ยวข้องกับการปรับสมดุลความต้องการของกระบวนการกับปัจจัยต่างๆ เช่น ขนาด, ต้นทุน, และข้อกำหนดด้านกฎระเบียบ การเลือกของคุณจะขึ้นอยู่กับข้อพิจารณาที่สำคัญ เช่น เซลล์ของคุณเป็นแบบยึดติดหรือปรับให้เหมาะกับการแขวนลอย, ความถี่ในการตรวจสอบที่จำเป็น, และความสามารถในการทนต่อการบุกรุกในขณะที่ยังคงรักษาความปลอดเชื้อ [1] ด้วยความต้องการเซลล์ที่มากในกระบวนการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง [1] ความแม่นยำในการตรวจสอบเป็นสิ่งที่ไม่สามารถต่อรองได้
ปัจจัยสำคัญในการเลือกวิธีการวิเคราะห์
การตรวจสอบแบบเรียลไทม์ ควรเป็นสิ่งที่ให้ความสำคัญสูงสุดระบบออนไลน์ช่วยให้สามารถเก็บข้อมูลในสถานที่ได้โดยไม่ต้องนำตัวอย่างออกมา ทำให้มีประสิทธิภาพมากขึ้นและมีโอกาสเกิดข้อผิดพลาดน้อยกว่าวิธีออฟไลน์ ซึ่งต้องใช้แรงงานมากและเสี่ยงต่อการปนเปื้อน [3][1]. สำหรับเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพขนาดใหญ่ - สูงสุดถึง 2,000 ลิตรหรือมากกว่า - เทคนิคที่ไม่รุกรานเช่น Raman หรือ NIR spectroscopy มีประโยชน์อย่างยิ่ง วิธีการเหล่านี้ไม่ต้องใช้สารเคมีและสามารถติดตามพารามิเตอร์หลายอย่าง เช่น กลูโคส แลคเตท และกรดอะมิโน ได้พร้อมกัน [1][3]. ความสามารถในการวิเคราะห์หลายตัวแปรนี้ไม่เพียงแต่ลดต้นทุนการตรวจสอบ แต่ยังรักษาสภาพแวดล้อมที่ปลอดเชื้อและเกรดอาหารที่จำเป็นสำหรับการปฏิบัติตามกฎระเบียบ [19].
ความไวและช่วงไดนามิก มีความสำคัญเท่าเทียมกันเมื่อวิเคราะห์สื่อชีวภาพที่ซับซ้อนการทดสอบที่ใช้การเรืองแสงมักจะมีความไวสูงกว่าวิธีการใช้ฟลูออเรสเซนส์หรือการดูดกลืนแสง [2] ในขณะเดียวกัน เทคนิคสเปกโทรสโกปีขั้นสูงสร้างชุดข้อมูลที่ซับซ้อนซึ่งมักต้องการเครื่องมือการเรียนรู้ของเครื่องหรือเคโมเมตริกสำหรับการวิเคราะห์ที่เหมาะสม [3][1] สำหรับโซลูชันที่ง่ายกว่า เซ็นเซอร์ที่ใช้ความจุมีประสิทธิภาพในการตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์
ความสามารถในการขยายขนาดและการปฏิบัติตามกฎระเบียบ เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการผลิตเชิงพาณิชย์ เซ็นเซอร์ในสภาพแวดล้อมเหล่านี้ต้องทนต่อการฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิสูง ลดการชะล้าง และทำงานเป็นระยะเวลานานโดยไม่ต้องปรับเทียบใหม่ ระบบติดตามอัตโนมัติที่ใช้ภาพยังสามารถให้เอกสารที่มีการประทับเวลาและพร้อมสำหรับการตรวจสอบ ซึ่งมีความสำคัญสำหรับการส่งเอกสารตามกฎระเบียบไปยังหน่วยงานเช่น FDA และ EMA [4] ข้อกำหนดเหล่านี้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการจัดหาอุปกรณ์ที่เหมาะสมจากซัพพลายเออร์เฉพาะทาง
การปรับปรุงการจัดหาอุปกรณ์ให้มีประสิทธิภาพด้วย Cellbase
เนื่องจากความซับซ้อนทางเทคนิคและกฎระเบียบ การค้นหาอุปกรณ์วิเคราะห์ที่เหมาะสมจึงมีความสำคัญ แพลตฟอร์มห้องปฏิบัติการทั่วไปมักขาดความเชี่ยวชาญที่ปรับให้เหมาะกับอุตสาหกรรมเนื้อสัตว์เพาะเลี้ยง
คำถามที่พบบ่อย
ประโยชน์ของการใช้เซ็นเซอร์ความจุในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงคืออะไร?
เซ็นเซอร์ความจุให้ วิธีการวัดแบบเรียลไทม์ที่ไม่รบกวน เพื่อวัดมวลชีวภาพของเซลล์ที่มีชีวิตในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ พวกเขาให้ข้อมูลที่แม่นยำและเชื่อถือได้โดยไม่ขัดจังหวะกระบวนการ ทำให้เป็นตัวเลือกที่ยอดเยี่ยมสำหรับการติดตามการเจริญเติบโตและสุขภาพของเซลล์
เซ็นเซอร์เหล่านี้ทำงานได้อย่างราบรื่นในระบบทุกขนาด ตั้งแต่การตั้งค่าขนาดเล็กไปจนถึงเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพอุตสาหกรรมแบบใช้ครั้งเดียวขนาดใหญ่ ความยืดหยุ่นนี้ช่วยปรับปรุง การจัดการกระบวนการ ลดการพึ่งพาการสุ่มตัวอย่างแบบออฟไลน์ และปรับปรุงกระบวนการผลิตให้มีประสิทธิภาพมากขึ้นโดยการให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกิจกรรมของเซลล์ เซ็นเซอร์ความจุมีบทบาทสำคัญในการปรับปรุงกระบวนการชีวภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
ข้อดีของการใช้สเปกโทรสโกปีแบบรามานในการตรวจสอบเมตาบอไลต์ของเซลล์ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพคืออะไร
สเปกโทรสโกปีแบบรามานช่วยให้สามารถติดตามแบบเรียลไทม์และไม่รุกรานของเมตาบอไลต์ของเซลล์ที่สำคัญโดยตรงภายในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ วิธีการนี้ช่วยลดความจำเป็นในการถอนตัวอย่าง ซึ่งลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนอย่างมาก นอกจากนี้ยังสามารถวัดสารประกอบหลายชนิดพร้อมกัน เช่น กลูโคส แลคเตท แอมโมเนียม และปริมาณผลิตภัณฑ์ ทำให้เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับกระบวนการที่ยาวนาน เช่น การวิ่งแบบเพอร์ฟิวชั่น
เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีอื่น ๆ สเปกโทรสโกปีแบบรามานมักให้ความแม่นยำที่สูงกว่าสำหรับเมตาบอไลต์ที่สำคัญ เช่น กลูโคสและแลคเตท มันสามารถทำงานได้ดีกว่าเทคนิคเช่นใกล้อินฟราเรด (NIR) และฟลูออเรสเซนซ์ 2 มิติภายใต้เงื่อนไขบางประการไม่เหมือนกับวิธีการแบบออฟไลน์แบบดั้งเดิม เช่น HPLC หรือการทดสอบสี, การสเปกโทรสโกปีแบบรามานทำงานอย่างต่อเนื่อง ลดเวลาและการใช้ทรัพยากรในขณะที่รักษาความสมบูรณ์ของการเพาะเลี้ยงเซลล์
ในการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง, การสเปกโทรสโกปีแบบรามานโดดเด่นเนื่องจากความเข้ากันได้กับไบโอรีแอคเตอร์ขนาดกะทัดรัดและความสามารถในการให้การวัดที่เชื่อถือได้โดยไม่ต้องปรับเทียบ สำหรับผู้ที่ต้องการเครื่องมือการตรวจสอบที่ใช้รามาน,
