หากคุณทดสอบเอนโดทอกซินในตัวอย่างเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง วิธีที่เหมาะสมขึ้นอยู่กับเมทริกซ์ของตัวอย่างมากกว่าฉลากชุดทดสอบ
ฉันจะสรุปได้ดังนี้: LAL ให้คุณมีขั้นตอนการทำงานที่คุ้นเคย, ในขณะที่ rFC สามารถลดผลบวกปลอมในสื่อที่มีเบต้า-กลูแคนสูงและสนับสนุนการจัดหาที่ปราศจากสัตว์. แต่ไม่ควรเลือกวิธีใดวิธีหนึ่งเพียงเพราะหลักการเท่านั้นสำหรับตัวอย่างสื่อ, น้ำซุปในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ, และการเก็บเกี่ยว คำถามหลักคือ: การทดสอบใดที่ให้ข้อมูล EU/mL ที่สะอาดและสามารถกู้คืนได้ในเมทริกซ์จริงที่คุณใช้งาน?
นี่คือสิ่งที่สำคัญที่สุดสำหรับคุณ:
- LAL ใช้ไลเซตจากปูเกือกม้าและอาจได้รับผลกระทบจาก การเกิดปฏิกิริยาข้ามของ Factor G
- rFC ใช้ Factor C ที่สร้างขึ้นใหม่และมักจะเหมาะสมกว่าเมื่อ เบต้า-กลูแคน มีอยู่
- ทั้งสองวิธีอาจล้มเหลวในตัวอย่างที่ซับซ้อน ที่มี ปัจจัยการเจริญเติบโต, สารลดแรงตึงผิว, สารคีเลต, เศษเซลล์, หรือชีวมวลสูง
- การเจือจางแบบอนุกรม, การตั้งค่า MVD, และการกู้คืนการเติม เป็นการตรวจสอบหลักสำหรับความเหมาะสมของเมทริกซ์
- การตรวจสอบความถูกต้องต้องทำในเมทริกซ์กระบวนการจริง, ไม่ใช่แค่ในบัฟเฟอร์
- หาก LAL และ rFC ไม่ตรงกัน, ฉันจะตรวจสอบ การเจือจาง, การยับยั้ง, ชุดรีเอเจนต์, และผลกระทบจากเมทริกซ์ ก่อนที่จะเชื่อถือหมายเลขนั้น
เอนโดท็อกซินจากแบคทีเรียแกรมลบสามารถส่งผลต่อสุขภาพของเซลล์, ความสม่ำเสมอของกระบวนการ, และความแปรปรวนของชุดการผลิต. นั่นคือเหตุผลที่การเลือกนี้มีความสำคัญในด้านการวิจัยและพัฒนาของเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงและการควบคุมคุณภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในที่ที่มีการใช้มาตรฐาน USP และ Ph. Eur.
การเปรียบเทียบระหว่าง LAL แบบดั้งเดิมกับสารรีเอเจนต์ที่ได้จากการสังเคราะห์ Associates of Cape Cod, Inc. APR Webinar
การทดสอบเอนโดทอกซินที่มีประสิทธิภาพเป็นส่วนสำคัญของโปรโตคอลการตรวจสอบเซลล์เพื่อให้มั่นใจในความปลอดภัยและความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
sbb-itb-ffee270
การเปรียบเทียบอย่างรวดเร็ว
| เกณฑ์ | LAL | rFC |
|---|---|---|
| แหล่งที่มาของรีเอเจนต์ | ไลเซตจากปูเกือกม้า | รีเอเจนต์เอนไซม์เดี่ยวที่ผลิตจากการสังเคราะห์ |
| การอ่านค่าหลัก | เจล-คลอท, โครโมเจนิก, เทอร์บิดิเมตริก | ฟลูออเรสเซนซ์หรือโครโมเจนิก |
| ความเสี่ยงจากเบต้า-กลูแคน | ใช่; ผลบวกเท็จสามารถเกิดขึ้นได้ผ่าน Factor G | ไม่มี Factor G; ความเสี่ยงต่ำจากเบต้า-กลูแคน |
| ความเหมาะสมที่ปราศจากสัตว์ | ไม่ใช่ | ใช่ |
| ความเสี่ยงจากเมทริกซ์ | อาจได้รับผลกระทบจากการยับยั้งและการตอบสนองที่ไม่ใช่เอนโดท็อกซิน | ยังคงอาจได้รับผลกระทบจากการยับยั้งและความไม่ตรงกันของเมทริกซ์ |
| กรณีการใช้งานที่ดีที่สุด | ทีมที่ต้องการกระบวนการทำงานที่คุ้นเคยตามมาตรฐาน | ทีมที่จัดการกับ ส่วนผสมที่มาจากพืช หรือเป้าหมายการจัดหาที่ปราศจากสัตว์ |
ฉันจะพิจารณาการเลือกวิธีการเป็น ปัญหาการตรวจสอบเมทริกซ์ก่อน และการตัดสินใจจัดหาภายหลัง. วิธีการนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อเผชิญกับ ความท้าทายในการขยายการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
LAL และ rFC: วิธีการทำงานของแต่ละการทดสอบและสิ่งที่มันให้ในเชิงวิเคราะห์
การทดสอบเอนโดทอกซิน LAL กับ rFC: การเปรียบเทียบวิธีการสำหรับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
วิธีที่ LAL ตรวจจับเอนโดทอกซิน
LAL ตรวจจับเอนโดทอกซินโดยการกระตุ้นกระบวนการแข็งตัวของเลือดของปูเกือกม้า ปฏิกิริยานั้นจะผลิต เจล-คลอท, โครโมจีนิก, หรือ เทอร์บิดิเมตริก สัญญาณ
บนกระดาษ ฟังดูง่าย ในทางปฏิบัติ คำถามสำคัญคือว่าสัญญาณจะคงที่ในเมทริกซ์ที่ใช้สำหรับ การผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง.
วิธีที่ rFC ตรวจจับเอนโดทอกซิน
rFC ตรวจจับเอนโดทอกซินผ่าน แฟคเตอร์ซีที่รีคอมบิแนนท์ , ผลิต ฟลูออเรสเซนซ์ หรือ โครโมจีนิก การอ่านค่า
จุดนั้นมีความสำคัญเมื่อส่วนประกอบของสื่อและชีวมวลเริ่มบิดเบือนการอ่านค่า ในสภาวะเหล่านั้น สัญญาณเองอาจกลายเป็นปัญหา
ตารางเปรียบเทียบ: หลักการทดสอบ, รูปแบบและความไว
| พารามิเตอร์ | LAL | rFC |
|---|---|---|
| แหล่งชีวภาพ | สารสกัดจากปูเกือกม้า | สารเอนไซม์เดี่ยวที่ผลิตขึ้นใหม่ |
| รูปแบบการอ่านค่า | เจล-คลอท, โครโมจีนิก หรือ เทอร์บิดิเมตริก | ฟลูออเรสเซนซ์ หรือ โครโมจีนิก |
| ตัวขับเคลื่อนความไว | การขยายสัญญาณแบบลูกโซ่; อาจถูกยับยั้งหรือเพิ่มขึ้นโดยเมทริกซ์ | สัญญาณเอนไซม์โดยตรง; ความไวขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสารและความเข้ากันได้ของเมทริกซ์ |
| ส่วนประกอบที่มาจากสัตว์ | ใช่ | ไม่ใช่ |
ปัญหาถัดไปคือการรบกวนของเมทริกซ์ในสื่อ ตัวอย่างการเก็บเกี่ยว และตัวอย่างที่มีความเข้มข้นของชีวมวลสูง.
การรบกวนของเมทริกซ์และความเหมาะสมของตัวอย่างในกระบวนการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
เมื่อเคมีของการทดสอบถูกกำหนดแล้ว การรบกวนของเมทริกซ์ มักจะเป็นตัวตัดสินว่าวิธีการตรวจเอนโดทอกซินจะทำงานในกระบวนการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงหรือไม่.
ตัวอย่างสื่อ: โปรตีน สารลดแรงตึงผิว และส่วนประกอบที่มาจากพืช
สื่อเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงสามารถมีความเข้มข้นของโปรตีนสูง โดยเฉพาะเมื่ออัลบูมินและทรานส์เฟอร์รินเป็นส่วนหนึ่งของสูตร ในความเข้มข้นสูง โปรตีนทั้งสองชนิดสามารถกดหรือบิดเบือนสัญญาณใน LAL และ rFC การทดสอบ.
ทรานส์เฟอร์รินเป็นไกลโคโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงและสามารถมีคุณภาพที่แตกต่างกันจากการผลิตแต่ละชุด [3]. ส่วนประกอบที่มาจากพืชเพิ่มความเสี่ยงอีกชั้นหนึ่ง.พวกมันอาจมีเบต้า-กลูแคนและโพลีแซคคาไรด์อื่น ๆ ซึ่งสามารถทำให้เกิดผลบวกปลอมใน LAL ผ่าน Factor G. rFC ไม่มี Factor G ดังนั้นจึงมักจะเหมาะสมกว่าสำหรับสูตรสื่อที่มีเบต้า-กลูแคนสูง [5]. สารลดแรงตึงผิวและสารจับโลหะก็สามารถยับยั้งการทดสอบทั้งสองได้ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องตรวจสอบในระหว่างการเจือจางและการทดสอบการรบกวน.
ตัวอย่างการเก็บเกี่ยวจะยากขึ้นอีกครั้ง.
การเก็บเกี่ยวเซลล์และตัวอย่างที่มีชีวมวลสูง
การเก็บเกี่ยวเซลล์เป็นเมทริกซ์ที่ซับซ้อนมากขึ้น ความหนาแน่นของเซลล์สูง, การรวมตัว, เศษซากภายในเซลล์, และโมเลกุลชีวภาพที่ละลายจากสื่อที่ใช้แล้วสามารถทำให้เกิดการยับยั้งหรือการเพิ่มขึ้นในการทดสอบทั้งสอง [4].
วิธีการปฏิบัติในการจัดการกับสิ่งนี้คือ การเจือจางแบบต่อเนื่อง. ใช้เพื่อค้นหา MVD: การเจือจางสูงสุดที่กำจัดการรบกวนโดยไม่ทำให้เอนโดทอกซินต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับของการทดสอบ.หากใช้การกรองเพื่อทำให้ตัวอย่างการเก็บเกี่ยวใสขึ้น ให้ระวังการอุดตันของเมมเบรน การสูญเสียการไหลและการเพิ่มขึ้นของความดันข้ามเมมเบรนสามารถดักจับเอนโดท็อกซินและลดการกู้คืน [1].
ตารางเปรียบเทียบ: ความเหมาะสมของวิธีการตามประเภทตัวอย่าง
| ประเภทตัวอย่าง | ความเสี่ยงจากการรบกวนทั่วไป | จุดแข็งของ LAL | ข้อจำกัดของ LAL | จุดแข็งของ rFC | ข้อจำกัดของ rFC |
|---|---|---|---|---|---|
| สื่อการเจริญเติบโต | โปรตีนสูง (อัลบูมิน, ทรานส์เฟอร์ริน), สารลดแรงตึงผิว, สารจับโลหะ | ความไวสูงในหลากหลายเมทริกซ์ | ผลบวกเท็จในสื่อที่มีเบต้า-กลูแคนสูงผ่าน Factor G | ความจำเพาะสูงกว่าในสื่อที่มีเบต้า-กลูแคนสูง; ไม่มีการเกิดปฏิกิริยาข้ามกับ Factor G | ต้องการเครื่องอ่านฟลูออเรสเซนต์หรือโครโมเจนิกเพลท |
| น้ำซุปไบโอรีแอคเตอร์ | เศษเซลล์, โมเลกุลชีวภาพที่ละลายได้, การเปลี่ยนแปลง pH จากผลพลอยได้จากการเผาผลาญ | ทนทานในเมทริกซ์ที่ง่ายกว่าและมีความซับซ้อนต่ำกว่า | มีแนวโน้มที่จะถูกยับยั้งจากความหนาแน่นของเซลล์สูงและของเสียจากการเผาผลาญ | สัญญาณที่สม่ำเสมอในสภาพแวดล้อมทางชีวเคมีที่ซับซ้อน | คุณภาพของสัญญาณขึ้นอยู่กับการเจือจางที่เพียงพอและความเข้ากันได้ของเมทริกซ์ |
| การเก็บเกี่ยวเซลล์ | ความหนาแน่นของชีวมวลสูง, การรวมตัว, เศษซากภายในเซลล์ | มีประสิทธิภาพเมื่อสามารถเจือจางได้เพียงพอ | ความเสี่ยงของการยับยั้งที่สำคัญที่ความเข้มข้นของโปรตีนสูง | สัญญาณที่สะอาดขึ้นในที่ที่มีโพลีแซ็กคาไรด์ที่ไม่ใช่เอนโดทอกซิน | ความไวลดลงหากการเจือจางไม่เพียงพอ |
ขั้นตอนต่อไปคือการตรวจสอบวิธีการที่เลือกกับตัวอย่างกระบวนการจริงและจากนั้นทำงานผ่านความแตกต่างระหว่างวิธีการต่างๆ
การตรวจสอบความถูกต้อง, ความเหมาะสมตามกฎระเบียบ และการตีความข้อมูล
เมื่อการทดสอบทำงานในเมทริกซ์ การตรวจสอบความถูกต้องจะบอกคุณว่ามันสามารถจัดการการทดสอบตามปกติได้หรือไม่
จุดสำคัญในการตรวจสอบความถูกต้องสำหรับ LAL และ rFC
ตรวจสอบความถูกต้องของ LAL และ rFC ในแต่ละ เมทริกซ์กระบวนการจริง, ไม่เพียงแต่เทียบกับมาตรฐานอ้างอิงในบัฟเฟอร์เท่านั้น
สำหรับทั้งสองวิธี การตรวจสอบความถูกต้องควรครอบคลุมการทดสอบการยับยั้งและการเพิ่มประสิทธิภาพ, การฟื้นตัวของสไปค์, และการตรวจสอบพฤติกรรมของการทดสอบในสื่อจริงหรือเมทริกซ์การเก็บเกี่ยว การฟื้นตัวของสไปค์ เป็นหนึ่งในวิธีที่ชัดเจนที่สุดในการแสดงว่าตัวอย่างกำลังยับยั้งหรือเพิ่มสัญญาณหรือไม่ หากสูตรสื่อเปลี่ยนแปลง หรือ สายเซลล์ที่แตกต่างกัน เปลี่ยนเมทริกซ์ตัวอย่าง จำเป็นต้องมีการตรวจสอบความถูกต้องใหม่
การตีความผลลัพธ์ EU/mL และการแก้ไขความแตกต่างระหว่างวิธีการ
หาก LAL และ rFC ไม่ตรงกัน ให้เริ่มต้นด้วยการเจือจางและเมทริกซ์ ไม่ใช่ตัวเลขที่รายงาน
เมื่อวิธีการทั้งสองให้ผลลัพธ์ EU/mL ที่แตกต่างกันจากตัวอย่างเดียวกัน ให้เปรียบเทียบข้อมูลข้ามการรันและล็อตของรีเอเจนต์ หาก LAL อ่านค่าสูงกว่า rFC, ให้ตรวจสอบการเพิ่มขึ้นเฉพาะของ LAL . หาก rFC อ่านค่าต่ำ การยับยั้งเป็นข้อสงสัยแรกที่สมเหตุสมผล การฟื้นตัวของสไปค์ที่ไม่ดีในวิธีการใด ๆ เป็นสัญญาณเตือนสำหรับการรบกวน ดังนั้นให้ตรวจสอบการฟื้นตัวที่ การเจือจางเดียวกันที่ใช้สำหรับผลลัพธ์ของตัวอย่าง ก่อนที่จะตัดสินใจว่าเมทริกซ์นั้นสะอาด
ในเมทริกซ์ที่ซับซ้อน งานหลักคือการพิจารณาว่าปัญหาคือ:
- การเพิ่มประสิทธิภาพ
- การยับยั้ง
- การเจือจางที่ไม่เหมาะสม
ความคาดหวังด้านกฎระเบียบแตกต่างกันไปตามตลาด แต่ทั้ง สิงคโปร์ และ สหรัฐอเมริกา คาดหวังข้อมูลเอนโดทอกซินที่ได้รับการตรวจสอบในเมทริกซ์ตัวอย่าง ไม่ใช่ผลลัพธ์จากชุดทดสอบที่ใช้เฉพาะบัฟเฟอร์
วิธีที่ Cellbase สนับสนุนการดำเนินการทดสอบเอนโดทอกซิน
เมื่อวิธีการได้รับการตรวจสอบแล้ว ทีมงานจำเป็นต้องมีฮาร์ดแวร์และวัสดุสิ้นเปลืองที่เหมาะสมเพื่อดำเนินการในลักษณะเดียวกันทุกครั้ง
บทสรุป: การเลือกวิธีทดสอบเอนโดทอกซินที่เหมาะสมสำหรับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
เคมีของการทดสอบ, ความเข้ากันได้ของเมทริกซ์, และข้อมูลการตรวจสอบควรเป็นตัวกำหนดการตัดสินใจขั้นสุดท้าย ไม่มีวิธีใดที่ดีกว่าในทุกกรณี ใช้ LAL เมื่อคุณต้องการกระบวนการทำงานที่เป็นที่รู้จักดี ใช้ rFC เมื่อการรบกวนจากเบต้า-กลูแคนเป็นปัญหาหลักหรือการจัดหาที่ปราศจากสัตว์มีความสำคัญมากกว่า
เมทริกซ์ของตัวอย่างควรเป็นตัวนำในการเลือก สื่อเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง, ตัวอย่างการเก็บเกี่ยว, และสารเติมแต่งสามารถส่งผลต่อประสิทธิภาพของการทดสอบได้มากกว่าข้อมูลจากชุดทดสอบที่ใช้บัฟเฟอร์ นั่นคือเหตุผลที่ การตรวจสอบเมทริกซ์มีความสำคัญมากกว่าข้อกำหนดของชุดทดสอบเพียงอย่างเดียว.
ตรวจสอบวิธีการบนสื่อเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงจริงและตัวอย่างการเก็บเกี่ยวด้วยการทดสอบการยับยั้ง, การเพิ่มประสิทธิภาพ, และการฟื้นตัวของสไปค์ หากสูตรสื่อมีการเปลี่ยนแปลง การตรวจสอบใหม่ไม่ใช่ทางเลือก [3].
หลังจากการตรวจสอบ ข้อกำหนดด้านเขตอำนาจศาล เป็นการตรวจสอบครั้งสุดท้าย ในสิงคโปร์และสหรัฐอเมริกา ให้ปรับวิธีการให้สอดคล้องกับความคาดหวังด้านความปลอดภัยเฉพาะผลิตภัณฑ์และกระบวนการตั้งแต่เริ่มต้นเพื่อหลีกเลี่ยงการทำงานซ้ำในขั้นตอนสุดท้าย [2]. เลือกวิธีการที่ได้รับการตรวจสอบในเมทริกซ์กระบวนการจริงและได้รับการยอมรับในตลาดเป้าหมาย
คำถามที่พบบ่อย
ฉันควรทดลองวิธีการใดก่อน?
ขึ้นอยู่กับกระบวนการทำงานของคุณ LAL ยังคงเป็นการทดสอบมาตรฐานที่ใช้ในอุตสาหกรรม ในขณะที่ rFC เสนอทางเลือกที่ปราศจากการใช้สัตว์
การเลือกที่ถูกต้องขึ้นอยู่กับสองสิ่ง: ความไวที่คุณต้องการและการรบกวนของเมทริกซ์ที่คุณคาดหวังจากสื่อการเจริญเติบโตหรือตัวอย่างการเก็บเกี่ยวเซลล์ ในทางปฏิบัติ หลายทีมทดสอบทั้งสองอย่างพร้อมกันก่อน อีกทางเลือกที่สมเหตุสมผลคือเริ่มต้นด้วยวิธีการที่สอดคล้องกับเป้าหมายการผลิตที่ปราศจากการใช้สัตว์ของคุณมากที่สุด
ฉันจะรู้ได้อย่างไรว่าตัวอย่างเมทริกซ์ของฉันมีการรบกวนหรือไม่?
ทำการ ทดสอบการฟื้นตัวของสไปค์. เพิ่มความเข้มข้นของเอนโดทอกซินที่ทราบลงในสื่อการเพาะเลี้ยงเนื้อสัตว์หรือเซลล์ที่เก็บเกี่ยว จากนั้นเปรียบเทียบการฟื้นตัวที่วัดได้กับการควบคุม.
หากการฟื้นตัวอยู่นอกช่วงที่ยอมรับได้ตามปกติที่ 50% ถึง 200% , เมทริกซ์ของตัวอย่างอาจรบกวนการทดสอบ โดยการเพิ่มหรือลดปฏิกิริยา.
เมื่อใดที่ฉันควรทำการตรวจสอบความถูกต้องของการทดสอบอีกครั้ง?
ทำการตรวจสอบความถูกต้องของการทดสอบเอนโดทอกซินอีกครั้งเมื่อใดก็ตามที่มีการเปลี่ยนแปลงครั้งใหญ่ที่อาจส่งผลต่อผลการทดสอบหรือความน่าเชื่อถือของวิธีการในกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อสัตว์ของคุณ.
ซึ่งรวมถึงการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของสื่อการเจริญเติบโต ขั้นตอนการเก็บเกี่ยวเซลล์ วัตถุดิบ อุปกรณ์ หรือสภาพแวดล้อมการทดสอบ.
