Yöntemi, ortamı, sıcaklığı ve prob tepkisini eşleştirmeden kLa değerlerini karşılaştırırsanız, yanlış ölçeklendirme kararı verebilirsiniz.
Bioproses mühendisleri, hücre kültürü bilimcileri ve yetiştirilmiş et Ar&Ge ekipleri için, kısa cevap basit: statik gaz çıkışı, kap benchmarking için en iyisidir, dinamik ve gaz çıkışı oksijen dengesi yöntemleri ise canlı et suyu koşullarında süreç odaklı veri istediğinizde daha kullanışlıdır. Su bazlı kLa sayıları yanıltıcı olabilir, prob gecikmesi hızlı transfer oranlarını bozabilir ve Pluronic F-68 gibi ortam katkı maddeleri bazı düzeneklerde kLa'yı %50 veya daha fazla azaltabilir.
İşte makale tek geçişte:
- kLa tek başına bir hedef değildir. Ben bunu P/V, kesme limitleri, gaz akışı ve karıştırma süresi ile birlikte kullanırdım.
- Statik gaz çıkarma, temiz bir donanım karşılaştırması sağlar, ancak BİZİM göz ardı eder ve aktif kültürü yansıtmaz.
- Dinamik yöntemler, kültür sırasında oksijen transferini izler ve ölçekli çalışmalara daha yakındır, ancak havalandırmada bir duraklama hücreleri strese sokabilir.
- Oksijen-dengesi yöntemleri, giriş ve çıkış gazı verilerini kullanır ve daha büyük kaplara uygundur, ancak sıkı gaz analizi gerektirir.
- Sülfit oksidasyonu ve basınç-adım yöntemleri , esas olarak ekipman karakterizasyonu içindir, canlı kültive edilmiş et suyu için değil.
- Prob yanıt süresi önemlidir: optik DO probları genellikle 3-10 s, yanıt verirken, polarografik problar genellikle 8-30 s.
- Sıcaklık ve ortam önemlidir: su içinde 20°C ölçülen bir kLa, 37°C. kültür ortamına temiz bir şekilde uymaz.
- Makaledeki tipik rapor edilen aralıklar 50-200 h⁻¹ 2-10 L ve 80-300 h⁻¹ 50-500 L , ancak yalnızca tam test temeli eşleşirse.
H.E.L Açıklıyor | Tutarlı Oksijen Transferi Sağlama: Fermentasyon Ölçeklendirmesinde kLa'nın Etkisi
sbb-itb-ffee270
Hızlı Karşılaştırma
Bioreaktör Ölçeklendirmesi için kLa Ölçüm Yöntemleri: Yan Yana Karşılaştırma
| Yöntem | En uygun olduğu durum | Başlıca dezavantajı | Proses uyumu |
|---|---|---|---|
| Statik gaz giderme | Kapasite ve dağıtıcı karşılaştırması | Canlı hücre oksijen talebi yok | Düşük ila orta |
| Dinamik yöntem | Aktif kültür ölçeklendirme çalışması | Havalandırmanın durması hücreleri rahatsız edebilir | Yüksek |
| Oksijen dengesi | Daha büyük ölçekli izleme | Sıkı çıkış gazı verisi gerektirir | Yüksek |
| Sülfit oksidasyonu | Maksimum transfer donanım kontrolleri | Proses medyası gibi değil | Düşük |
| Basınç-adımı | Büyük kap karakterizasyonu | Basınca dayanıklı kurulum gerektirir | Orta |
Bir ölçek büyütme planı yapıyor olsaydım, özellikle pilot ölçekli sistemlere, geçerken yöntem seçimini veri kalitesi kontrolünün bir parçası olarak değerlendirirdim, sonradan düşünülmüş bir şey olarak değil.
2. Biyoreaktör çalışmalarında kullanılan ana kLa ölçüm yöntemleri
Literatür, kLa ölçümünü üç ana yöntem ailesine ayırma eğilimindedir: statik gaz giderme, dinamik ve oksijen dengesi yöntemleri, ve kimyasal veya basınca dayalı teknikler. Her biri oksijen transferine biraz farklı bir açıdan bakar. Bu önemlidir çünkü yöntemin kendisi, ölçek büyütme verilerinin nasıl okunduğunu şekillendirebilir.
2.1 Statik gaz giderme
Statik gaz giderme, sıvıyı deoksijenize ederek başlar, çoğunlukla azot ile. Daha sonra havalandırma tekrar açılır ve çözünmüş oksijen (DO) geri kazanımı zamanla izlenir. kLa, bu DO artış hızından hesaplanır.
Canlı hücrelere veya tehlikeli reaktiflere ihtiyaç duymadığı için, bu yöntem bir biyoreaktörü kıyaslamak için basit bir yoldur. Ancak, hücre solunumunu veya kültür büyümesi sırasında et suyu özelliklerinin nasıl değiştiğini yansıtmaz. Sonuçlar ayrıca ortam, çark tasarımı, sparger tasarımı, gaz akışı, sıcaklık ve antifoam kullanımına bağlıdır. Örneğin, 400 L karıştırmalı tankta, Pluronic F-68'in 0.02 g/L eklenmesi, katkı maddesi olmadan referansa kıyasla kLa'yı en az %50 azaltabilir [2].
Pratik bir sorun, prob dinamikleridir. Sensör yanıtı çok yavaşsa, ölçülen kLa çarpıtılır ve düzeltme gerektirir [1].
2.2 İşlem koşulları altında dinamik ve oksijen-dengesi yöntemleri
Amaç temiz su referansı yerine işlemle ilgiliyse, dinamik yöntemler genellikle size daha fazla bilgi verir. En yaygın versiyonunda, havalandırma kısa bir süre durdurulur, böylece hücre solunumu DO'yu düşürür. Ardından havalandırma yeniden başlatılır ve iyileşme geçici analizi yapılır. Bu, ölçümü gerçek bir çalıştırma sırasında et suyu ile daha yakın hale getirir.
Oksijen-dengesi yöntemi farklı bir yol izler.Havalandırmayı kesmek yerine, genellikle kütle spektrometresi gibi gaz analizi ile OTR eksi OUR'dan kLa tahmin eder [2]. Bu yöntem invaziv değildir ve özellikle daha büyük kaplarda kullanışlıdır. Ancak bir bedeli vardır: biyoproses kontrol yazılımı ve gaz analitik donanımı ile güvenilir OUR verilerine ihtiyacınız vardır.
Yetiştirilen et çalışmaları için, bu yöntemler oksijen transferini ölçek büyütme sırasında görülen aynı et suyu ve hücre koşulları altında yansıttıkları için kullanışlıdır. Taviz oldukça açıktır. Dinamik yöntemde, havalandırma duraklaması sırasında DO düşer ve bu kesinti çok uzun sürerse kültürü strese sokabilir.
Kimyasal ve basınç-adım yöntemleri, canlı süreç okumasından ziyade ekipman karakterizasyonu için daha fazla kullanılır.
2.3 Sülfit oksidasyonu ve basınç-adım yöntemleri
Biyolojik olmayan karşılaştırmalar için, iki diğer yöntem sıkça görülür.Donanımı karakterize etmek için iyidirler, ancak doğrudan yaşayan kültive edilmiş et suyu temsil etmezler.
Sülfit oksidasyonu, çözünmüş oksijeni tüketmek için bir katalizör varlığında oksitlenen sodyum sülfit kullanır ve buradan kLa hesaplanabilir. Sorun basittir: sıvı biyolojik ortamı temsil etmez, bu nedenle sonuç doğrudan kültive edilmiş et suyuna çevrilmez [2].
Basınç-adım yöntemi, Henry yasası altında oksijen doygunluk konsantrasyonunu (C*) değiştirmek için kap basıncını adım adım değiştirir. Bu, karıştırma hızını veya gaz akış hızını değiştirmeden bir kütle transferi itici gücü yaratır [2]. Basıncı kontrol etmek karıştırma veya havalandırmadan daha kolay olduğunda kullanışlıdır. Yine de, basınca dayanıklı kaplar ve sıkı kontrol edilen basınç değişiklikleri gerektirir, bu da günlük kullanımı sınırlar. Yine de, ekipman karakterizasyonu için faydalı bir araştırma yöntemi olmaya devam eder.
3. Yöntemler Arasında Güçlü Yönler, Sınırlamalar ve Karşılaştırılabilirlik
Yayınlanmış kLa değerleri, yalnızca test kurulumu ve temel varsayımlar aynı olduğunda karşılaştırılabilir. Hatta sıcaklık bile sonucu anlamlı bir miktarda değiştirebilir. Ve eğer bir makale çözünmüş oksijen probu yanıt süresini düzeltirken diğeri düzeltmiyorsa, bu değerler eşdeğer olarak değerlendirilmemelidir, diğer kurulum aynı görünse bile.
Bu boşluk, sayının ne için olduğunu belirlerken en çok önem taşır için. Bu bir donanım karşılaştırması mı? Yoksa kültürde olanları yansıtan bir süreç odaklı metrik mi?
3.1 Statik gaz çıkışının referans yöntem olarak kaldığı yer
Statik gaz çıkışı, donanım karşılaştırması için hala tercih edilen yöntemdir. Amaç, kontrollü koşullar altında dağıtıcı tasarımlarını, karıştırıcı geometrilerini veya kap konfigürasyonlarını karşılaştırmaksa, bu işi iyi yapar.Basit, tekrarlanabilir ve canlı hücrelere ihtiyaç duymaz.
Dezavantajı ise aynı derecede açıktır: kLa su içinde ölçüldüğünde, kültive edilmiş et medyasındaki oksijen transferinin zayıf bir göstergesidir. Deiyonize sudan elde edilen bir değer, kap hakkında faydalı bir şey söyler, ancak gerçek bir ortam devreye girdiğinde performans hakkında çok daha az bilgi verir.
İşte bu noktada dinamik yöntemler daha önemli hale gelir. Çalışma, kap karakterizasyonundan canlı kültüre kaydığında, süreçle ilgili önem, temiz sistem kontrolünü aşmaya başlar.
3.2 Dinamik ve çözünmüş oksijen profil yöntemlerinin süreçle ilgili önem kattığı yer
Dinamik yöntemler, aktif kültür sırasında oksijen transferini ölçtükleri için gerçek süreç koşullarına daha yakındır. Bu, hem oksijen talebini hem de et suyunun gerçek özelliklerini yakaladıkları anlamına gelir. Ölçek büyütme çalışmaları, için bu, sonucu temiz su tahmininden çok daha kullanışlı hale getirir.
Oksijen-denge yaklaşımı, işletim koşulları altında sürekli, invaziv olmayan bir okuma ekler, ancak doğru gaz analizi ve istikrarlı işletime bağlıdır [2].
Yöntemler yan yana konulduğunda farklar daha kolay görülür.
3.3 Karşılaştırma tablosu: Yetiştirilmiş et ölçeklendirmesi için uygun yöntem
| Yöntem | Prensip | Gerekli veriler | Ana varsayımlar | Güçlü yönler | Sınırlamalar | En iyi kullanım |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Statik gaz çıkarma | Hücre içermeyen sıvıda N₂ sıyırma sonrası DO artışı | DO zaman akışı, prob yanıt süresi | İyi karışmış sıvı; OUR yok | Basit; tekrarlanabilir; hücre gerekmez | OUR'yi göz ardı eder; medya bileşimine ve prob gecikmesine duyarlıdır | Başlangıç kap karakterizasyonu; donanım karşılaştırması |
| Dinamik yöntem | Kısa süreli havalandırma durmasından sonra aktif kültürde DO toparlanması | DO zaman akışı, OUR tahmini | Yarı-durağan kültür; sensör düzeltmesi uygulanmış | Gerçek et suyu ve hücre koşullarını yansıtır | Havalandırma duraklaması kültürü strese sokabilir; sensör gecikmesine duyarlıdır | Aktif büyüme sırasında süreç optimizasyonu ve ölçek büyütme |
| Oksijen dengesi (gaz fazı analizi) | Giriş ve çıkış gazı arasındaki O₂ kütle dengesi | Doğru gaz akış hızları ve O₂ konsantrasyonları | Kararlı operasyon | Girişimci olmayan; sürekli; kültür bozulması yok | Son derece doğru gaz analizi gerektirir | Büyük ölçekli üretim izleme |
| Sülfit oksidasyonu | Sodyum sülfitin kimyasal oksidasyonu O₂ tüketir | Sülfit tüketim hızı | Kütle transferi ile sınırlı reaksiyon hızı | Maksimum OTR kapasitesi için faydalıdır | Biyolojik ortamı temsil etmez; kLa'yı fazla tahmin edebilir | Ekipman karşılaştırması sadece; canlı kültür çalışması için değil |
| Dinamik basınç yöntemi (DPM) | Oksijen çözünürlüğünü değiştirmek için basınç adım değişikliği | Basınç ve DO zaman akışı | Basınç, gaz bileşiminden daha hızlı dengelenir | Gaz fazı gecikmesini önler; büyük kaplar için uygundur | Basınca dayanıklı kap ve hassas basınç kontrolü gerektirir | Büyük ölçekli karakterizasyon |
Bu yöntem seçimleri, kLa verilerinin ölçek büyütme hedeflerine ve ekipman seçimine nasıl dönüştürülmesi gerektiğini etkiler.
4. kLa verilerini ölçek büyütme ve ekipman seçimi için kullanma
4.1 Laboratuvardan pilot ölçeğe ölçek büyütme hedeflerini belirleme
kLa'yı ölçtükten sonra, bu sayıyı karıştırma, gaz akışı ve karıştırma için işletim sınırlarına dönüştürmek bir sonraki iştir. kLa, bir kısıtlama , olarak ele alınmalı, kararın tamamı değil. Oksijen talebini karşılayacak kadar yüksek olmalı, ancak hücrelerinizin tolere edemeyeceği bir kesme rejimine kayacak kadar yüksek olmamalıdır.
Bu denge, kültive edilmiş et üretiminde önemlidir. Daha büyük ölçekte kLa'yı sabit tutmak, sizi daha yüksek çark uç hızlarına ve bununla birlikte daha yüksek kesme kuvvetlerine yönlendirebilir [4]. Memeli hücre kültüründe, oksijen transferini kesme gerilimine karşı dengelemek için genellikle 0.1-0.5 m/s çark uç hızları kullanılır [5]. Bu uygulamada, kLa, birim hacim başına güç girişi (P/V), yüzeysel gaz hızı ve karıştırma süresi [4][5] .
gibi unsurları da içeren daha geniş bir çalışma penceresi içinde yer alır.Burada faydalı bir kıyaslama yardımcı olur. 2-10 L laboratuvar ölçekli karıştırmalı tank reaktöründe, kLa genellikle 50-200 h⁻¹ aralığında olur. 50-500 L pilot ölçekli bir kapta, tipik bir aralık 80-300 h⁻¹ [4]. Tüm kapların ulaşabileceği örtüşmeyi bulmak ana adımdır. Bu, bir ölçek büyütme hedefini kağıt üzerinde güzel bir fikir olmaktan çıkarıp çalıştırabileceğiniz bir şeye dönüştürür.
4.2 Güvenilir kLa çalışması için sensör ve donanım seçimi
İyi ölçek büyütme verileri, sonucu çarpıtmayan enstrümanlar ve gaz donanımı ile başlar.
Sensör yanıt süresi, kLa doğruluğu üzerinde doğrudan etkiye sahiptir. Yüksek-kLa sistemlerinde, hızlı tepki veren DO probları. kullanın. Yavaş polarografik problar düzeltme gerektirir ve kLa'yı düşük okuyabilir. Polarografik probların tepki süreleri genellikle 8-30 saniye, iken, optik floresans bazlı problar 3-10 saniye içinde tepki verir [4]. İyi bir kural, sensör tepki süresinin kütle transfer zaman sabitinin (1/kLa) onda birinden daha az olması gerektiğidir [1] . Bu koşulu karşılayamıyorsanız, optik problar genellikle daha güvenli bir seçenektir.
Gaz dağıtımı da aynı derecede önemlidir. Termal kütle akış kontrol cihazları gaz akışını sabit tutmaya yardımcı olur, bu da ölçümleri daha tekrarlanabilir hale getirir. Dağıtıcı seçimi de ulaşabileceğiniz kLa üzerinde doğrudan bir etkiye sahiptir [2][3]. Daha küçük kabarcıklar daha fazla gaz-sıvı arayüz alanı sağlar, ancak bir sorun var: ortam katkı maddeleri kLa'yı keskin bir şekilde azaltabilir [2] .
5. kLa ölçümlerini yorumlamak için önemli çıkarımlar
Birlikte ele alındığında, seçtiğiniz yöntem, yanıtlamaya çalıştığınız ölçek büyütme sorusuna uygun olmalıdır. Pratikte bu, donanım karakterizasyonu veya işlem odaklı ölçek büyütme verileri.
ihtiyacınız olup olmadığını netleştirmek anlamına gelir.20°C'de suda ölçülen bir kLa değeri, doğrudan 37°C'deki kültür ortamına taşınamaz. Sadece sıcaklık düzeltmesi yaklaşık %45 fark [4]. yaratır. Ve kLa, yalnızca teoriyle tahmin edebileceğiniz bir şey değildir. Her biyoreaktörün kendi ölçülen kLa'sına [1] . ihtiyacı vardır.
Bu, laboratuvardan pilot ölçeğe. geçerken daha da önem kazanır. Tuzla eşleşmiş bir tamponda, örneğin PBS'de statik gaz çıkarma, size temiz bir ekipman ölçütü verir. Ancak ölçek arttıkça, dinamik ölçümler gerçek kültür ortamında, sürecin pratikte ne yapacağını daha iyi anlatır çünkü ortam katkı maddeleri kLa'yı büyük ölçüde değiştirebilir [4]. Su bazlı değerlere güveniyorsanız, ölçeklendirme sırasında oksijen transfer kapasitesini aşırı belirleyebilirsiniz.
Son kontrol, kLa'nın tam işletim penceresi içinde olup olmadığıdır. kLa'yı tek başına bir hedef değil, bir süreç kısıtlaması olarak ele alın. En iyi biyoreaktör sistemini ve karıştırma stratejisini seçerken P/V ve kesme sınırları ile birlikte kullanın [4].
SSS
Ölçek büyütme için hangi kLa yöntemini kullanmalıyım?
Dinamik gaz giderme yöntemi, karıştırmalı tank biyoreaktörlerinde kLa belirlemek için en yaygın kullanılan yöntemdir ve pratikte çoğu ekip tarafından önerilir. Oldukça hızlıdır ve tehlikeli kimyasallar veya canlı organizmalar kullanma gereksinimini ortadan kaldırır.
Yetiştirilen etin ölçek büyütmesi için, hücre metabolizmasının sonucu bozmasını önlemek amacıyla hücresiz ölçüm yapmak en iyisidir. Süreç ortamına daha iyi uyum sağlamak için 37 °C'de PBS tamponu kullanın. Ve eğer çözünmüş oksijen probunun yanıt süresi yavaşsa, bir düzeltme uygulayın. Aksi takdirde, kLa değerini düşük tahmin edebilirsiniz..
Su bazlı kLa değerleri neden genellikle yanıltıcıdır?
Su bazlı kLa değerleri yanıltıcı olabilir çünkü gerçek hücre kültürü ortamlarının fizikokimyasal davranışını yansıtmazlar. Gerçek ortamlar sadece besinlerle karıştırılmış su değildir. Tuz konsantrasyonu, viskozite, yüzey gerilimi ve köpük önleyici, oksijen kütle transferini su testlerinin göstermeyeceği şekillerde değiştirir.
Bu boşluk önemlidir. Ortam etkilerini göz ardı ederseniz, oksijen teslim tahminleriniz biyoreaktörün pratikte yaptığı şeyden çok uzaklaşabilir. İyi bir örnek köpük önleyicidir: kabarcık birleşmesini artırabilir, arayüzey alanını azaltabilir ve kLa'yı %50'ye kadar düşürebilir. Kültive edilmiş et üretiminde, bu küçük bir detay değildir. Bir sürecin yeterli oksijen transferi boşluğuna sahip olup olmadığını veya sınırına daha yakın çalışıp çalışmadığını değiştirebilir.
Prob gecikmesi ve ortam katkı maddeleri kLa'yı nasıl etkiler?
Prob gecikmesi kLa ölçümlerini bozabilir. Çözünmüş oksijen sensörü, oksijen transfer hızına göre çok yavaş yanıt verirse, sonuç yanlış olabilir ve doğrusal olmayan düzeltme.
gerekebilir.Ortam katkı maddeleri de önemli şekillerde oksijen transferini değiştirebilir.Elektrolitler ve tuzlar kabarcık birleşmesini baskılayabilir. Pluronic F68 kabarcık boyutunu azaltabilir. Köpük önleyiciler genellikle kabarcık birleşmesini artırır, bu da etkili arayüzey alanını azaltır ve kLa.
düşürür.
