在生物反应器中监测活细胞对于培养肉生产至关重要。 扩大规模需要精确的工具来实时跟踪细胞健康和生长。本文回顾了关键方法，包括电容传感器、拉曼光谱和荧光，强调了它们在工业应用中的优缺点。
关键见解：
- 电容传感器：持续测量活细胞密度。对贴壁细胞有效，但对细胞大小变化敏感。
- 拉曼光谱：跟踪葡萄糖和乳酸等代谢物。理想用于水环境，但需要复杂的校准。
- 荧光：通过NADH/NADPH信号监测代谢活动。速度快，但受培养基背景信号影响。
挑战：
- 传统测试如台盼蓝是破坏性且缓慢的。
- 高细胞密度和复杂培养基会干扰光学方法。
- 传感器污染和校准需求限制了效率。
选择合适的方法取决于工艺要求、生物反应器规模和无菌需求。对于大规模操作，结合多种技术通常能获得最佳结果。
基于电容的活细胞密度传感器
介电光谱的工作原理
电容传感器，也称为射频阻抗传感器，将活细胞视为微小的球形电容器。当电场施加到细胞悬浮液时，培养基中的离子和细胞质内的离子开始移动。它们最终遇到不导电的质膜，导致极化 - 膜上的电荷分离[5][6]。
html关键在于：只有膜完整的细胞才能极化。死亡细胞由于缺乏完整的膜，无法捕获离子，因此不对电容信号做出贡献[5][7]。Aber Instruments Ltd.的销售和市场总监John Carvell对此解释得很好：
"射频（RF）阻抗……通常被认为是监测哺乳动物细胞培养中活细胞浓度的最稳健和可靠的方法。" [5]
介电光谱通过测量细胞悬浮液在不同频率下的介电特性（或介电常数）来进行扩展。此过程生成一个β-色散曲线，显示随着电场频率的升高，细胞极化能力的下降[6]。 单频读数通常反映可行的生物体积——即活细胞所占据的总体积——而不仅仅是细胞的数量。较大的细胞自然比较小的细胞对信号的贡献更大[5][6]。
这些原理构成了电容传感器技术的基础，使其成为生物反应器系统中的一种有价值的工具。
在培养肉生物反应器中使用电容传感器
电容传感器兼容一次性和多次使用的生物反应器系统。对于一次性设置，传感器一次性圆盘可以焊接到柔性薄膜袋中或通过预装配的管口插入[5][9]。在不锈钢系统中，可重复使用的12毫米探头通过无菌端口连接[9]。
一个实际的例子来自亚琛大学，研究人员在一个20升摇摆式一次性生物反应器中使用BioPAT ViaMass系统监测CHO DG44细胞。他们在电容读数与总细胞体积之间实现了强相关性（回归系数为0.95）[5]。同样，荷兰的Xpand Biotechnology在他们的Scinus细胞扩增系统中使用Aber生物量传感器来跟踪在微载体上以60 g/L密度生长的间充质干细胞（MSCs）。传感器有效地追踪了从150 mL到1升的体积范围内的生长曲线，结果与离线参考测量值高度一致[5]。
对于培养肉生产，电容传感器在处理微载体上的贴壁细胞时表现出色。与光学方法不同，电容传感器可以穿透这些结构，而光学方法在处理固体载体时可能会遇到困难。这一能力使其在监测依赖锚定的细胞方面特别有用，这是培养肉类制造的基石[8]。
电容传感器的优缺点
电容传感器提供连续的实时数据，没有与手动采样相关的污染风险或延迟。目前，它们是唯一可商用的在线工具，用于评估工业生物工艺中的细胞活力[7]。虽然传统的离线方法如台盼蓝染色法的相对误差约为10%，但电容频率扫描可以将此误差降低到5.5%到11%之间[6]。
话虽如此，这些传感器确实有其局限性。单频测量无法区分细胞数量的增加和细胞大小的增加。例如，如果细胞在运行过程中直径显著增长——无论是由于压力还是死亡阶段——信号可能会误导实际的细胞计数，除非使用多频扫描[6]。此外，悬浮介质的变化，如饲料添加或稀释，可能会导致数据中出现暂时的“下降”，这并不反映真实的生物量变化[5]。在摇动式生物反应器中，传感器可能会暂时遇到气体空间，需要高级滤波算法来避免信号干扰[5]。
这些因素在微调培养肉生产的活细胞监测时至关重要。
活细胞分析的光谱方法
拉曼和近红外光谱
拉曼光谱利用785 nm激光的非弹性光散射生成分子指纹，允许同时测量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵等代谢物。另一方面，近红外光谱（800–2,500 nm）通过泛音和组合带检测光学吸收[10][12][13][14]。拉曼对水的敏感性极低，使其非常适合于细胞培养等水性环境，而近红外由于强烈的O–H伸缩信号对水的高敏感性可能会掩盖关键的生化数据[10][12][14]。
2017年3月，Lonza Biologics在15 mL微型生物反应器（ambr™系统）中比较了NIR、拉曼和2D荧光。他们发现拉曼在测量乳酸和葡萄糖方面最可靠，而NIR在预测谷氨酰胺和铵离子水平方面表现更好[10][11]。
2022年4月，Sartorius Stedim Biotech的研究人员将在线拉曼流动池集成到CHO细胞灌流过程的无细胞收获流中。使用HyperFluxPRO拉曼光谱仪和785 nm激光，他们实现了自动葡萄糖反馈控制，将浓度维持在4 g/L和1.5 g/L，变动范围为±0.4 g/L，持续数天[13]。J.Lemke 来自 Sartorius Stedim Biotech 指出：
“结果表明拉曼光谱在高级工艺监测和控制生物反应器灌流过程中的巨大潜力，以及其规模无关的测量方法。”[13]
2011年5月，Bristol-Myers Squibb 在500升生物反应器中使用在线拉曼探针监测多种参数，包括谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、乳酸、铵、活细胞密度（VCD）和总细胞密度（TCD）。每两小时使用 Kaiser Optical Systems 的 RamanRXN3 仪器收集光谱，展示了拉曼在大规模生产中跟踪营养物增加和代谢物减少的能力[14]。
虽然拉曼和近红外光谱提供详细的化学见解，荧光和紫外-可见光方法则提供了关于细胞代谢和生物质的互补视角。
荧光和紫外-可见光光谱
紫外-可见光光谱通过测量光吸收或散射来估算总生物质 [16]。然而，这种简单且广泛使用的方法难以区分活细胞和死细胞，并且在较高细胞密度下准确性降低 [16]。
荧光测定法比紫外-可见光更敏感，专注于特定的细胞内标记物，如NADH和NADPH，这些是代谢活动的指标。原位荧光测定法使用366 nm的紫外光激发NADH/NADPH，然后在约460 nm处发出荧光 [16]。Veer Pramod Perwez 解释道：
“迄今为止开发的唯一能够提供细胞群体生化或代谢状态信息的连续监测策略是原位荧光法。”[16]
在培养肉生产中，实时数据至关重要，荧光法能够快速反馈代谢变化，而紫外-可见光谱法则提供了一种经济的估算生物量的方法。荧光法可以通过监测NADH水平实时跟踪代谢变化并检测底物耗尽。例如，在一项研究中，二维荧光法测量氨浓度的RMSECV为0.031 g/L，在微型生物反应器设置中优于拉曼和近红外光谱法[11]。此外，自动化微流控平台可以结合明场显微镜（用于测量总细胞浓度）和使用碘化丙啶的荧光检测，在短短10分钟内确定细胞活力。3 minutes [15].
比较不同的光谱方法
在比较这些技术时，每种技术在生物反应器监测中都有其独特的优势。拉曼光谱因其分子指纹识别能力和水的低干扰性而在预测葡萄糖、乳酸和抗体滴度方面表现突出[10][11]。尽管NIR对水敏感，但在监测谷氨酰胺和铵方面更为有效[10][12]。荧光光谱提供了关于代谢活动和活力的详细见解，而紫外-可见光谱仍然是估算总生物量的简单且经济高效的选择[16]。
多变量分析增强了复杂光谱的解释能力，使得能够同时监测多个分析物[10][13][14]。对于培养肉生产，选择合适的光谱方法取决于要监测的代谢物、生物反应器的规模，以及是使用一次性还是多次性系统。这些技术共同实现了精确的细胞监测，其中拉曼光谱与水环境的兼容性及其多分析物能力使其对大规模操作特别有吸引力[13][14]。
哺乳动物细胞培养 - 拉曼作为监测和控制上游生物过程的方法&及控制上游生物过程
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细胞生理和活力的先进方法
除了光谱学，尖端技术提供了对细胞生理和活力的更深入见解。
FTIR用于细胞活力和凋亡监测
FTIR光谱利用蛋白质、脂类和碳水化合物中的分子振动来检测营养压力和早期凋亡，这两者都是培养肉生物反应器中细胞健康下降的关键标志。
一种方法，ATR-FTIR（衰减全反射），分析高波数区域的光谱变异性，以区分健康细胞和营养缺乏细胞。2024年5月，Dxcover Ltd.的研究人员。使用配备一次性内部反射元件（IREs）的ATR-FTIR平台来监测CHO细胞健康。通过主成分分析（PCA），他们成功地在PC空间中区分了健康细胞和营养缺乏的细胞。该平台在葡萄糖和乳酸的多输出R²值接近0.98，提供了关于细胞活力的实时见解。由于乳酸积累可能导致细胞死亡，这种实时监测允许及时干预以维持细胞健康。 现代FTIR系统设计有一次性IREs或浸没探头，以便直接集成到生物反应器环境中。此设置不仅提供实时数据，还降低了污染风险。正如在《生物工程与生物技术前沿》中所强调的：
“基于光谱的技术非常适合作为PAT方法，因为它们是非破坏性的，并且需要最少的样品准备。”[17]
在这些能力的基础上，多频电容扫描解决了单频方法的局限性。
多频电容扫描
虽然单频电容传感器对于测量活细胞体积（VCV）很有用，但它们难以区分细胞大小和细胞数量的变化。这一限制在细胞凋亡期间尤为突出，因为此时细胞直径通常会增加[18]。多频电容扫描通过测量50–20,000 kHz范围内的介电常数，捕捉β-弥散曲线，准确评估细胞浓度，无论大小变化如何，解决了这个问题[18]。
2019年10月，Sartorius Stedim Biotech的研究人员使用Aber Instruments的FUTURA pico探针监测250 mL生物反应器中的DG44 CHO细胞。通过将正交偏最小二乘法（OPLS）建模应用于25个离散频率，他们将VCC预测误差降低到仅5.5%到11%，显著改善了单频测量的16%到23%误差率[18]。该模型有效跟踪了超过1000万细胞/mL的细胞浓度，并迅速识别出由稀释和喂养变化引起的偏差，误差范围为6.7%到13%。2% [18].
特征频率 (fC) 表示细胞极化完成一半的点，其变化取决于细胞大小和极化能力。这为生理变化提供了额外的标志，特别是在细胞死亡阶段，当形态发生显著变化时 [18]。正如 Analytical and Bioanalytical Chemistry 所解释的：
"VCC 和细胞直径对介电信号的影响无法通过单一频率测量来区分。" [18]
活细胞监测分析方法比较
生物反应器中活细胞监测的分析方法比较
本节深入探讨了用于培养肉类生物反应器中活细胞监测的关键分析方法，基于之前讨论的先进技术。
选择最佳方法需要在准确性、速度和实用性之间取得平衡。每种技术都有其独特的优势，无论是跟踪活细胞密度、监测代谢活动，还是在一次性系统中保持无菌。
基于电容的传感器目前是唯一可商用的在线选项，专为活性监测而设计[7]。这些传感器通过在交变电场中检测具有完整膜的细胞的极化来测量活细胞体积。虽然单频系统在细胞大小变化时可能难以保证准确性，但多频扫描显著提高了精度，误差范围为5.5%–11% [18].
光谱方法 - 如拉曼、近红外和荧光光谱 - 提供了更全面的代谢活动视图，跟踪生物量的多个参数。这些方法是非侵入性的，非常适合需要保持无菌的单次使用生物反应器。然而，它们也面临挑战：光谱系统需要使用化学计量模型进行广泛的校准，并且与电容探头相比，通常涉及更高的初始成本。
傅里叶变换红外光谱（FTIR） 特别有效于通过分子振动分析检测早期凋亡和营养胁迫的迹象。然而，其强烈的水吸收限制了其在水环境中进行连续在线监测的实用性 [7]。相反，FTIR 最适合作为离线方法，特别是与多变量分析结合使用以实现实时代谢物跟踪。
分析方法比较表
| 方法 | 实时能力 | 生物反应器兼容性 | 校准需求 | 主要限制 |
|---|---|---|---|---|
| 电容传感器 | 是（在线/在位） | 高（搅拌、摇摆、一次性使用生物反应器） | 低到中等 | 对气泡和细胞大小/形态变化敏感 |
| 拉曼光谱 | 是（在线） | 中等（需要探头接口） | 高（化学计量学） | 设备成本高；数据解释复杂 |
| 近红外光谱 | 是（在线/在位） | 高 | 高（多变量） | 对水干扰和介质变化的敏感性 |
| 荧光 | 是（在线） | 高 | 中等 | 介质的背景荧光；光漂白 |
| FTIR | 是（在线） | 中等 | 高 | 强水吸收限制了在水性介质中的在线使用 |
对于培养肉生产，精确性和可靠性是不可妥协的，将分析方法与特定工艺要求相匹配是实现最佳生物反应器性能的关键。像
结论和建议
选择合适的分析方法需要在工艺要求与规模、成本和监管要求等因素之间取得平衡。您的选择将取决于关键考虑因素，例如您的细胞是贴壁还是悬浮适应的，监测的频率，以及在确保无菌性保持不变的同时可以容忍多少侵入性 [1]。由于培养肉生产对细胞的需求量很大 [1]，监测的精确性是不可妥协的。
选择分析方法的关键因素
实时监测 应该是首要任务。在线系统允许就地数据收集，无需移除样本，使其比离线方法更高效且更不易出错，后者劳动强度大且有污染风险[3][1]。对于高达2000升或更大的大型生物反应器，拉曼或近红外光谱等非侵入性技术尤其有用。这些方法无需试剂，可以同时跟踪多种参数，如葡萄糖、乳酸和氨基酸[1][3]。这种多变量能力不仅降低了监测成本，还保持了符合监管要求的无菌食品级环境[19]。
在分析复杂生物介质时，灵敏度和动态范围同样重要。基于发光的检测方法通常比荧光或吸光度方法提供更高的灵敏度[2]。同时，先进的光谱技术生成复杂的数据集，通常需要机器学习或化学计量工具进行适当分析[3][1]。对于更简单的解决方案，基于电容的传感器在监测细胞活力方面是有效的。
可扩展性和法规合规性对于商业生产至关重要。在这些环境中，传感器必须能够承受高温灭菌，最小化浸出，并在不需要重新校准的情况下长时间运行。自动化的基于图像的跟踪系统还可以提供带时间戳的、可供审核的文档，这对于向FDA和EMA等机构提交法规文件至关重要[4]。这些要求强调了从专业供应商处采购合适设备的重要性。
简化设备采购与Cellbase
鉴于技术和法规的复杂性，找到合适的分析设备至关重要。一般实验室平台往往缺乏针对培养肉行业的专业知识。
常见问题
在培养肉生产的生物反应器中使用电容传感器的好处是什么？
电容传感器提供了一种实时、非侵入式的方法来测量生物反应器中的活细胞生物量。它们提供精确可靠的数据而不干扰过程，使其成为跟踪细胞生长和健康的理想选择。
这些传感器可以无缝地在各种规模的系统中工作，从小型设置到大型一次性工业生物反应器。这种灵活性改善了过程管理，减少了对离线采样的依赖，并简化了生产工作流程。通过提供对细胞活动的详细见解，电容传感器在优化生物工艺中发挥着关键作用，特别是在培养肉生产方面。
拉曼光谱在生物反应器中监测细胞代谢物有哪些优势？
拉曼光谱允许实时、非侵入性地跟踪生物反应器内的关键细胞代谢物。这种方法消除了取样的需要，显著降低了污染风险。它可以同时测量多种化合物，如葡萄糖、乳酸、铵和产品滴定度，使其成为长时间过程（如灌流运行）的高效工具。
与其他方法相比，拉曼光谱通常对葡萄糖和乳酸等关键代谢物提供更高的精度。在某些条件下，它甚至可以优于近红外（NIR）和二维荧光等技术。与传统的离线方法（如HPLC或比色分析）不同，拉曼光谱可以连续工作，减少时间和资源的使用，同时保持细胞培养的完整性。
在培养肉生产中，拉曼光谱因其与紧凑型生物反应器的兼容性以及提供可靠、无需校准的测量能力而脱颖而出。对于需要基于拉曼的监测工具的人，
在高细胞密度的生物反应器中使用光学方法有哪些挑战？
在高细胞密度的环境中，光学方法面临的挑战包括光散射增加和培养基浑浊，这可能会导致测量偏差。随着复杂性的增加，细胞碎片的积累会削弱信号并导致非线性响应，使得获得准确读数变得更加困难。
这些问题在生物反应器中尤为突出，因为条件不断变化且复杂。为了解决这些限制并保持可靠的监测，可能需要更复杂的分析技术。
