Scherspannung kann die Produktion von kultiviertem Fleisch entscheidend beeinflussen. Warum? Weil die verwendeten Zellen keine schützenden Wände haben und daher anfällig für Schäden durch Flüssigkeitskräfte in Bioreaktoren sind. Dieser Artikel untersucht, wie sich Scherspannung auf diese Zellen auswirkt, welche Schwellenwerte sie aushalten können und wie man Systeme entwirft, die sie schützen.
Wichtige Erkenntnisse:
- Scherspannung entsteht durch Flüssigkeitsbewegung und kann empfindlichen tierischen Zellen schaden, indem sie Membranschäden, Ablösung oder Tod verursacht.
- Die meisten Säugetierzellen tolerieren 0,3–1,7 Pascal, aber selbst niedrigere Werte können Stressreaktionen auslösen.
- Designentscheidungen wie Rührertyp, Belüftungsmethoden und Bioreaktorgeometrie beeinflussen direkt die Scherkräfte.
- Strategien zur Minimierung von Schäden umfassen die Verwendung sanfterer Bioreaktordesigns (e.g. , Airlift- oder Wippsysteme), die Optimierung der Rührgeschwindigkeiten und das Hinzufügen von Schutzmitteln wie Pluronic F68.
Für kultiviertes Fleisch ist es entscheidend, dieses Gleichgewicht zu verwalten, um sicherzustellen, dass Zellen wachsen und sich differenzieren, ohne Schaden zu nehmen, insbesondere wenn die Produktion hochskaliert wird. Lassen Sie uns die Wissenschaft hinter diesen Schwellenwerten und praktische Lösungen für das Design von Bioreaktoren erkunden.
110: Spinning Like Earth: Designing Low-Shear Bioreactors for Better Cell Culture with Olivier De...
Was beeinflusst die Scherbelastung in Bioreaktoren
Das Verständnis der Faktoren, die die Scherbelastung in Bioreaktoren beeinflussen, ist entscheidend für die Optimierung der Bedingungen, insbesondere wenn empfindliche Zellen beteiligt sind. Lassen Sie uns in die Hauptelemente eintauchen, die ihre Intensität und Verteilung formen.
Bioreaktordesign und Betriebsbedingungen
Das Design eines Bioreaktors spielt eine wichtige Rolle dabei, wo und wie Scherbelastung auftritt. Ein Schlüsselfaktor ist der Typ des Rührers, der verwendet wird.Zum Beispiel können Rushton-Turbinen Energiedissipationsraten erzeugen, die bis zu 280 Mal höher sind als der Durchschnitt des Gefäßes, während hocheffiziente Axialströmungsrührer wie der HE3 Raten erzeugen, die näher bei 180 Mal der mittleren Dissipation liegen [4]. Andere Designelemente, wie der Durchmesser des Rührers, die Geschwindigkeit und die Positionierung, beeinflussen ebenfalls die Energieverteilung.
Interessanterweise führt Belüftung zu viel stärkeren Kräften als Rühren. Wenn kleine Blasen (1–2 mm) platzen, setzen sie Energieniveaus zwischen 10⁷–10⁹ W/m³ frei, die über 1.000 Zellen in einem einzigen Ereignis töten können [4]. Dies macht das Blasenverhalten zu einem kritischen Faktor, insbesondere in der Produktion von kultiviertem Fleisch.
Prallbleche sind ein weiteres wichtiges Designelement. Sie verhindern die Bildung eines Wirbels in der Kultur, der sonst Blasen in die Flüssigkeit ziehen und die Anzahl der Platzenereignisse an der Oberfläche erhöhen würde [4]. Zusätzlich beeinflussen das Verhältnis von Impeller- zu Behälterdurchmesser und die Höhe des Impellers vom Boden, wie sich die Energie im Bioreaktor verteilt.
Ungleichmäßige Verteilung der Scherspannung
Die Scherspannung ist im Bioreaktor nicht gleichmäßig verteilt. Untersuchungen zeigen, dass die Energiedissipation dazu neigt, sich auf bestimmte Zonen zu konzentrieren, wie den Impellerauslassbereich, nachlaufende Wirbel und die Flüssigkeitsoberfläche, an der Blasen platzen. Diese Hotspots können bei der Hochskalierung Herausforderungen darstellen.
Weiwei Hu von Biogen Idec hebt dieses Skalierungsproblem hervor:
Die Wahrnehmung der 'Schersensitivität' hat historisch gesehen eine willkürliche Obergrenze für Rühren und Belüften im Bioreaktorbetrieb gesetzt; jedoch können mit zunehmender Zelldichte und Produktivität die Anforderungen an den Stofftransport die durch diese willkürlich niedrigen Grenzen auferlegten übersteigen [4].
Zum Beispiel verglichen Junxuan Zhang und Xueliang Li von der Jiangnan University in einer Studie aus dem Jahr 2021 einen 250 mL Spinnerkolben mit einem 20 m³ Rührkesselreaktor unter Verwendung von numerischer Strömungsmechanik. Sie beobachteten, dass selbst bei den niedrigsten Rührgeschwindigkeiten die Scherkräfte im größeren Reaktor stark genug waren, um Zellen von Mikrokügelchen zu lösen, wobei das Begasen noch mehr Stress als die Agitation einführte [3].
Kulturformat und Scherempfindlichkeit
Das Kulturformat bestimmt auch, wie Zellen Scherstress erfahren. Auf Mikrokügelchen gewachsene Zellen sind besonders anfällig. Wenn intensives Mischen oder Kollisionen zwischen den Trägern dazu führen, dass Zellen sich lösen, gehen diese Zellen effektiv verloren [4]. Auf der anderen Seite haben Suspensionskulturen von Hybridomazellen Resilienz gezeigt, indem sie bei Rührgeschwindigkeiten von bis zu 1.500 U/min in gerührten Bioreaktoren ohne Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche die Lebensfähigkeit aufrechterhalten haben [4].
Verschiedene Kultursysteme gehen unterschiedlich mit Scherkräften um. Festbett-Bioreaktoren minimieren Scherkräfte, indem sie Zellen auf stationären Oberflächen immobilisieren, während Wirbelschichtreaktoren durch die Bewegung von Mikrokörpern und den aufwärts gerichteten Flüssigkeitsstrom moderate bis hohe Scherkräfte einführen [2]. Einige Mikrokörper, insbesondere poröse, bieten innere Oberflächen, die Zellen vor extremen Kräften schützen können und somit einen besseren Schutz im Vergleich zu festen Mikrokörpern bieten [2]. Diese Unterschiede unterstreichen die Notwendigkeit, bei der Gestaltung von Bioreaktoren die Nährstoffzufuhr sorgfältig mit dem Risiko von Zellschäden abzuwägen.
Schubspannungsschwellen für verschiedene Zelltypen
Schubspannungstoleranzschwellen für Zelltypen von kultiviertem Fleisch
Das Management der Schubspannung ist entscheidend für die Produktion von kultiviertem Fleisch, da ungleichmäßige Spannungen Zellen schädigen können, die keine starken Zellwände haben. Das Verständnis der spezifischen Spannungsniveaus, die jeder Zelltyp tolerieren kann, hilft, die Zellgesundheit zu erhalten, mechanosensitive Reaktionen auszulösen oder die Differenzierung zu fördern.
Schwellenwerte für gängige Zelltypen
Die Schubspannungstoleranz variiert erheblich zwischen den Zelltypen, und das Wissen um diese Schwellenwerte ist entscheidend für die Feinabstimmung der Bioreaktoreinstellungen.
Zum Beispiel gedeihen Myoblasten von kultiviertem Fleisch wie die C2C12-Linie unter niedriger Schubspannung. Zyklische Spannungen von etwa 1,68 mPa verbessern die Myotubenbildung und Fusion [8] . Mausmuskel-abgeleitete Stammzellen (MDSCs) zeigen eine bessere myogene Differenzierung und eine umfangreichere Myotubenbildung, wenn sie 16 mPa ausgesetzt sind [8] . Wenn sich Myoblasten zu Myotuben entwickeln, können sie höhere Stressniveaus bewältigen; gepulster Stress zwischen 400 mPa und 1.400 mPa aktiviert Wege, die die Größe der Muskelfasern regulieren, was potenziell zu Hypertrophie führen kann [8] .
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) reagieren ebenfalls einzigartig. Zum Beispiel regulieren canine MSCs, die einer Scherbelastung zwischen 100 mPa und 1.500 mPa ausgesetzt sind, endotheliale Marker wie PECAM-1 und VE-Cadherin hoch, während sie glatte Muskelmarker herunterregulieren [10] .
Vergleichstabelle der Schubspannungsschwellen
Hier ist ein schneller Vergleich der Schubspannungsschwellen für verschiedene Zelltypen von kultiviertem Fleisch:
| Zelltyp | Schubspannungsschwelle (mPa) | Beobachtete Effekte | Quelle |
|---|---|---|---|
| Säugetierzellen (Allgemein) | 300–1.700 | Basisbereich; Werte darüber können zu Zellschäden oder Apoptose führen | [1] |
| C2C12 Myoblasten (Adhärent) | ~1.68 | Verbesserte Lebensfähigkeit und erhöhte Myotubenbildung | [8] |
| Maus MDSCs (Adhärent) | ~16 | Verbesserte Differenzierung und umfangreiche Myotubenbildung | [8] |
| C2C12 Myotuben (Adhärent) | 400–1.400 | Aktivierung von Wegen, die die Muskelfasergröße regulieren (potenzieller Hypertrophie) | [8] |
| Canine MSCs | 100–1.500 | Hochregulation von endothelialen Markern, reduzierte glatte Muskelmarker | [10] |
| Zelloberflächensensoren (Integrine) | 100–1.000 | Aktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen und Rezeptoren | [1] |
Zum Kontext: Das Rühren einer Kultur bei 100–200 U/min in einem Standardkolben erzeugt Scherstressniveaus von 300–660 mPa, während Orbitalschüttler, die mit 20–60 U/min laufen, höhere Kräfte erzeugen, die von 600 mPa bis 1.600 mPa reichen [1]. Sanftere Systeme wie schaukelnde Bioreaktoren (±5° bei 1 Hz) erzeugen eine Belastung von etwa 90 mPa [9], und Klinostat-Bioreaktoren arbeiten bei etwa 10 mPa, und bleiben deutlich unter der Aktivierungsschwelle für mechanosensitive Zelloberflächensensoren [1].
Diese Schwellenwerte dienen als Leitfaden zur Anpassung der Bioreaktorbedingungen und helfen, optimale Umgebungen während der Hochskalierung und Zellwachstumsphasen aufrechtzuerhalten.
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Wie man Scherstressschäden reduziert
Die Minimierung von Scherstressschäden in der Produktion von kultiviertem Fleisch dreht sich um das Erreichen eines empfindlichen Gleichgewichts. Ziel ist es, eine effiziente Durchmischung und Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten und gleichzeitig empfindliche Zellen vor mechanischen Schäden zu schützen. Dies erfordert eine Kombination aus intelligentem Bioreaktordesign und durchdachten Betriebsstrategien.
Bioreaktor-Design-Modifikationen
Die Verwendung von CFD (Computational Fluid Dynamics) Modellierung ist ein entscheidender Schritt zur Optimierung der Bioreaktorleistung. Moderne CFD-Techniken beinhalten jetzt Mehrphasenströmungssimulationen, die die Wechselwirkungen zwischen Zellen und Mikrokörpern berücksichtigen. Dies führt zu genaueren Bewertungen der Scherbelastung und ihres potenziellen Schadens [5].
Der Typ des Bioreaktors spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Scherbelastungsniveaus. Während Rührkesselreaktoren immer noch weit verbreitet sind, können alternative Designs sanftere Bedingungen bieten:
- Airlift-Bioreaktoren: Diese eliminieren mechanische Rührer und verwenden stattdessen gasinduzierte Zirkulation, um mechanische Scherung zu reduzieren [5].
- Wellen- oder Schaukel-Bioreaktoren: Indem sie sich auf Oberflächenbewegung anstelle von Rührern verlassen, sind diese ideal für Kulturen mit niedriger bis mittlerer Dichte, die eine sanfte Durchmischung erfordern [5].
- Vertikalrad-Bioreaktoren: Besonders effektiv für aggregatbasierte Kulturen, haben diese sich als erfolgreich erwiesen, um die Zellviabilität während der Expansion von menschlichen iPSC-Aggregaten aufrechtzuerhalten [11].
Ein weiterer wichtiger Faktor ist das nicht-newtonsche Verhalten von Zellaufschlämmungen. Zum Beispiel zeigen Aufschlämmungen, die Serum enthalten, scherverdünnende Eigenschaften, die traditionelle Modelle oft nicht erfassen können. Die Verwendung fortschrittlicher Modelle, wie des Sisko-Modells, liefert genauere Vorhersagen der Scherspannung, was hilft, mechanische Kräfte fein abzustimmen und Schwellenwerte zu vermeiden, die die genetische Expression verändern könnten [6].
Zellbesiedlung und Agitationsmethoden
Betriebsstrategien spielen ebenfalls eine große Rolle bei der Reduzierung von Scherstressschäden. Zum Beispiel kann intermittierende Agitation in den frühen Stadien der Zellanhaftung die Scherbelastung begrenzen, während dennoch sichergestellt wird, dass Nährstoffe effektiv verteilt werden. Die Anpassung der Agitation erfordert eine sorgfältige Berücksichtigung von Faktoren wie Serumgehalt, Zelldichte und dem Alter der Kultur [6].
Bei der Bestimmung der Agitationsgeschwindigkeiten kann CFD-Modellierung helfen, das ideale Gleichgewicht zu finden - ausreichender Sauerstofftransfer ohne mechanische Schäden zu verursachen. Kompartimentierte Simulationen können die Verteilung des Scherstresses weiter verfeinern und den Prozess effizienter gestalten [5].
Einfluss auf das Design und die Skalierung von Bioreaktoren
Beim Hochskalieren von Bioreaktoren für die Produktion von kultiviertem Fleisch ist das Verständnis und die Anwendung von Scherstress-Schwellenwerten entscheidend. Diese Schwellenwerte beeinflussen Entscheidungen über die Rührerdrehzahl, das Sparger-Design und andere Parameter, um die Zellviabilität bei wachsendem Produktionsvolumen sicherzustellen.
Festlegung der Betriebsparameter von Bioreaktoren
Scherstress-Schwellenwerte spielen eine Schlüsselrolle bei der Definition von Betriebsgrenzen. Zum Beispiel haben hämatopoetische Stammzellen (HSCs) einen Schwellenwert von ungefähr 0,092 Pa[12]. Unterhalb dieses Niveaus zu bleiben - wie zum Beispiel bei einem Betrieb mit 50 U/min, der etwa 0,068 Pa erzeugt - unterstützt eine gesunde Zellausdehnung und erreicht eine 27,4-fache Vergrößerung. Allerdings erhöht eine Steigerung der Agitation auf 100 U/min den Scherstress auf etwa 0,192 Pa, was zu einer 72%igen Apoptoserate führt und die Ausdehnung auf 24 begrenzt.5‐fach[12].
"Die Schwellenwert-Schubspannung für die Proliferation und Funktion von HSCs wurde mit 0,092 Pa angegeben." – Hosseinizand et al. [12]
Schädigungen durch Scherkräfte treten auf, wenn turbulente Wirbel kleiner werden als etwa zwei Drittel des Durchmessers einer Zelle oder eines Aggregats[12][13]. Bei 50 U/min messen die Wirbel etwa 280 µm, was für Zellen sicher ist. Aber bei 100 U/min schrumpfen die Wirbel auf 166 µm, was das Risiko mechanischer Schäden erhöht.
Das Einleiten von Gasblasen führt zu zusätzlichem hydrodynamischem Stress. Kleine Blasen (1 mm Durchmesser) erzeugen lokale Flüssigkeitsgeschwindigkeiten von etwa 6,4 m/s beim Platzen, während größere 6 mm Blasen sanftere Spitzen von 0,94 m/s[13]. Um dem entgegenzuwirken, werden Additive wie Pluronic F68 verwendet, um zu verhindern, dass Zellen an Blasenoberflächen haften.Jedoch hängt ihre Wirksamkeit davon ab, die richtige Konzentration im Verhältnis zur Gasoberfläche aufrechtzuerhalten [13].
Diese Parameter sind entscheidend beim Übergang zu größeren Bioreaktorsystemen.
Bedingungen während des Scale-Ups aufrechterhalten
Der Übergang von einem 250 mL Spinnerkolben zu einem 20 m³ Rührkesselreaktor bringt einzigartige Herausforderungen mit sich. Hydrodynamische Bedingungen in Kleinsystemen lassen sich nicht direkt auf industrielle Volumina übertragen. Selbst der Betrieb großer Reaktoren bei minimalen Rührgeschwindigkeiten kann zu Scherkräften führen, die stark genug sind, um Zellen von Mikrokörpern zu lösen[3].
"Selbst bei einer Rührgeschwindigkeit nahe der Njs könnte die allein durch die Rührer ausgeübte Scherung zu einer Ablösung der Zellen von Mikrokörpern führen, während durch das Begasen noch mehr hydrodynamischer Stress eingeführt wird." – Zhang et al.[3]
Um während des Scale-ups konsistente Scherbedingungen aufrechtzuerhalten, besteht ein Ansatz darin, die Geschwindigkeit der Impellerspitze konstant zu halten. Dies kann jedoch zu längeren Mischzeiten und zur Bildung von Nährstoff- und Sauerstoffgradienten führen, die das Zellwachstum und die Leistung negativ beeinflussen können[3]. Die Modellierung der Computational Fluid Dynamics (CFD) wird unerlässlich, um Spannungszonen zu identifizieren und das Reaktordesign während des Scale-ups zu optimieren[5].
Für Zelllinien, die sehr empfindlich auf Scherung reagieren, sind alternative Reaktordesigns oft besser geeignet. Airlift-Reaktoren, die mechanische Rührer eliminieren, wurden erfolgreich für Volumina von bis zu 300.000 L modelliert und erreichten theoretische Zelldichten von 2 × 10⁸ Zellen/mL[7]. Ähnlich verwenden schaukelnde Bioreaktoren sanfte Wellenbewegungen, um Scherkräfte zu minimieren, was sie effektiv für Saatzüge bis zu 500 L macht[14][15]. Plattformen wie
Zusammenfassung und Empfehlungen
Das effektive Management von Scherstress ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Zellviabilität und Produktivität in der Produktion von kultiviertem Fleisch. Forschungen zeigen, dass das Platzen von Blasen während der Belüftung schädlichere Kräfte erzeugt als mechanisches Rühren. Zum Beispiel erzeugen kleine Blasen (1 mm) bei ihrem Platzen Flüssigkeitsgeschwindigkeiten von 6,4 m/s, während größere Blasen (6 mm) sanftere Spitzen von 0,94 m/s erzeugen [13]. Um diese Kräfte zu minimieren, sollten Beschaffungsteams sich auf Bioreaktoren mit gesinterten Mikrospargern (15-μm Porengröße) konzentrieren, die eine gepulste Belüftung ermöglichen und die Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche reduzieren. Diese Überlegungen sind entscheidend für die Skalierung von Bioreaktorsystemen.
Ein weiterer wichtiger Faktor ist das Verhältnis von Wirbelskala zu Zelldurchmesser (η/d_c), das helfen kann, Schäden durch Rühren zu reduzieren. Eine im August 2017 vom Institut für Bioverfahrenstechnik und Pharmazeutische Technologie durchgeführte Studie hebt dies hervor. Mit einem 3-L Applikon Glasbioreaktor mit Sf21 Insektenzellen zeigten sie, dass ein Sechsblatt-Rushton-Rührer bei 205 U/min, kombiniert mit 199 μm Blasen, eine GFP-Proteinausbeute von 12,75 μg/mL erzeugte. Im Gegensatz dazu ergab ein Schrägblatt-Rührer bei 171 U/min, der eine höhere spezifische Gasoberfläche von 18,0 m²/m³ erzeugte, nur 4,0 μg/mL [13]. Dies zeigt, dass die gesamte Gasoberfläche einflussreicher ist als die Rührgeschwindigkeit.
Schutzmittel wie Pluronic F68 (0,5–3 g/L) können eine 16–40 μm dicke Schutzschicht um Blasen bilden, die verhindert, dass sich Zellen anlagern [13]. Wie Tobias Weidner und Kollegen beobachteten:
Wenn die [gesamte Gas-]Oberfläche einen bestimmten Schwellenwert überschreitet, reicht die Konzentration von Pluronic nicht mehr aus, um die Zellen zu schützen [13].
Das bedeutet, dass Ingenieure die Gasoberfläche in Bezug auf die Pluronic F68-Konzentration während des Scale-ups sorgfältig überwachen müssen, um sicherzustellen, dass die Zellen geschützt bleiben.
Für empfindliche Zelllinien können alternative Reaktordesigns Lösungen bieten. Airlift-Reaktoren beispielsweise eliminieren mechanische Rührer und schaffen eine sanftere Mischumgebung [7]. Festbett-Bioreaktoren sind eine weitere Option, die in der Lage sind, ultra-niedrige Wand-Schubspannungen im Bereich von 10⁻³ bis 10⁻² Pa aufrechtzuerhalten [17]. Für Teams, die spezialisierte Niedrig-Schub-Systeme erkunden, bieten Lieferanten wie
Darüber hinaus ist es entscheidend, bovine Myoblasten unter 25 Populationsverdopplungen zu halten, um ihre Differenzierungskapazität zu bewahren [16]. Das Überschreiten dieser Schwelle kann zu einer Verringerung des Fusionsindex um etwa 6,81% mit jedem Durchgang führen [16], was die Fähigkeit der Zellen zur Bildung von Muskelfasern reduziert. Um dies zu adressieren, sollten Prozessingenieure Computational Fluid Dynamics (CFD)-Modellierung nutzen, um Hoch-Schub-Zonen zu identifizieren, bevor sie vom Labor- auf das Industriesystem hochskalieren. Dieser Ansatz gewährleistet reibungslosere Übergänge und bessere Ergebnisse während der Hochskalierung.
FAQs
Wie messe ich die Scherspannung in meinem Bioreaktor?
Die Scherspannung in Bioreaktoren wird oft mit computational modelling techniques wie Computational Fluid Dynamics (CFD) bewertet. Diese Methoden ermöglichen die Analyse von Strömungsmustern und die Identifizierung von Scherzonen innerhalb des Bioreaktors. Zusätzlich sind small-scale shear testing tools wertvoll, um die Empfindlichkeit spezifischer Zelllinien zu charakterisieren und verschiedene Prozessbedingungen zu bewerten. Für die kontinuierliche Überwachung kann die Scherspannung durch Berechnung der Fluidgeschwindigkeit und Viskosität bestimmt werden. Dieser Ansatz ist besonders effektiv in mikrofluidischen Systemen oder durch die Nutzung von Online-Scherspannungsrechnern.
Welche Belüftungsmethode minimiert Schäden durch Blasenbruch?
Die Minimierung von Schäden durch Blasenbruch hängt stark von der Verwendung kleinerer Blasen ab. Diese Blasen verursachen weniger Zellschäden im Vergleich auf Basis von Volumen-zu-Volumen.Obwohl genaue Techniken nicht beschrieben sind, spielt das Management der Blasengröße und des Verhaltens - wie die Regulierung ihrer Größe - eine entscheidende Rolle bei der Verringerung der schädlichen Auswirkungen von Rupturen.
Was sollte ich konstant halten, wenn ich hochskaliere, um die Scherung zu reduzieren?
Beim Vergrößern der Bioreaktoren für kultiviertes Fleisch ist es entscheidend, die Scherspannung unter etwa 3 Pa zu halten, um die Zellen nicht zu schädigen. Achten Sie genau auf Faktoren wie Rühren, Strömungsmuster, und Belüftung , um sicherzustellen, dass die Scherwerte während des gesamten Betriebs konstant bleiben.
