यदि एक नॉकआउट एक परिभाषित प्रक्रिया विशेषता में सुधार नहीं करता है, तो यह केवल एक संपादन है, न कि एक उपयोगी सेल लाइन।
बायोप्रोसेस इंजीनियरों, सेल कल्चर वैज्ञानिकों, और संवर्धित मांस आर&डी टीमों के लिए, लेख का मुख्य बिंदु सरल है: मैं बाधा से शुरू करता हूँ, संपादन से पहले पास/फेल थ्रेशोल्ड सेट करता हूँ, फिर मापने योग्य उत्पादन रीडआउट जैसे कि कम डबलिंग समय, सस्पेंशन ग्रोथ, या सतह एंटीजन को हटाने के चारों ओर वर्कफ़्लो बनाता हूँ। लेख यह भी स्पष्ट करता है कि पूल-स्तरीय संपादन डेटा गाइड रैंकिंग के लिए उपयोगी हैं, लेकिन एक रिलीज-ग्रेड नॉकआउट को क्लोन-स्तरीय जीनोटाइप, प्रोटीन-हानि डेटा, वंशावली जांच, और बहु-पैसेज प्रक्रिया परीक्षण की आवश्यकता होती है (अक्सर प्राथमिक बनाम अमरित सेल लाइनों को शामिल करते हुए)।
जुलाई 2024 का एक मामला आइवी फार्म से जुड़ा हुआ है जिसमें NF2 नॉकआउट पोर्सिन और बोवाइन मायोब्लास्ट्स और एडिपोज-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं में कम डबलिंग समय, सस्पेंशन कल्चर के लिए समर्थन, और वंशावली मार्करों की प्रतिधारण के साथ जुड़ा हुआ है।लेकिन लेख इसे सार्वभौमिक के रूप में नहीं मानता है। मुझे किसी भी संपादित क्लोन को आगे बढ़ाने से पहले प्रजाति-, वंश-, और लक्ष्य-विशिष्ट सत्यापन की आवश्यकता है।
लेख में करने के लिए क्या कहा गया है:
- संपादन लक्ष्य को प्रक्रिया शर्तों में परिभाषित करें, लागत शर्तों में नहीं
- विकास, निलंबन फिटनेस, मार्कर प्रतिधारण, और मार्ग स्थिरता के लिए पहले से थ्रेशोल्ड सेट करें
- पाथवे भूमिका, वंश प्रभाव, और सुरक्षा-संबंधित जोखिमों की जांच के बाद ही लक्ष्य जीन चुनें
- संविधानात्मक कोडिंग एक्सॉन्स के खिलाफ गाइड डिज़ाइन करें और पहले पीसीआर और सैंगर द्वारा पैतृक स्थान की जांच करें
- संपादक एक्सपोजर समय को सीमित करने के लिए जहां संभव हो आरएनपी डिलीवरी के साथ डोनर-फ्री वर्कफ़्लो का उपयोग करें
- बल्क पूल को प्रारंभिक स्क्रीन के रूप में मानें, न कि नॉकआउट के प्रमाण के रूप में
- द्विअल्लीलीय हानि, की पुष्टि करें फिर प्रोटीन अनुपस्थिति की जांच करें
- मिलान पैतृक या केस9-केवल, बिना-sgRNA नियंत्रणों के खिलाफ क्लोन को मान्य करें
- केवल उन लाइनों को जारी करें जो चार परतों को पास करती हैं: संपादन पहचान, आणविक परिणाम, सेल फ़ंक्शन, और उत्पादन फिटनेस
कुछ तकनीकी बिंदु विशेष रूप से ध्यान देने योग्य हैं।लेख में उल्लेख किया गया है कि वाइल्ड-टाइप SpCas9 3 से 5 बेमेल, सहन कर सकता है, यही कारण है कि ऑफ-टारगेट समीक्षा को बाद में नहीं छोड़ा जा सकता। यह यह भी बताता है कि 17 से 18 बीपी ट्रंकेटेड गाइड्स ऑफ-टारगेट गतिविधि को 500 गुना तक कम कर सकते हैं, जबकि ऑन-टारगेट प्रदर्शन में बहुत कम गिरावट होती है। और क्योंकि डोनर-फ्री मरम्मत अक्सर मिश्रित इंडेल्स देती है, मैं यह नहीं मान सकता कि "संपादित" का अर्थ "शून्य" है - इन-फ्रेम एलील्स.
अभी भी कार्य को बनाए रख सकते हैं। जहां मुझे यह लेख सबसे उपयोगी लगा, वह है इसका अनुशासन: केवल जीनोटाइप पर्याप्त नहीं है, केवल तेज़ वृद्धि पर्याप्त नहीं है, और एक पासेज से निलंबन डेटा पर्याप्त नहीं है। एक नॉकआउट लाइन केवल तभी मायने रखती है जब यह वंशावली पहचान बनाए रखे, कम से कम चार पासेज में त्रिक, में स्थिर रहे और उत्पादन में सामना करने वाले समान संस्कृति प्रारूप और घनत्व के तहत प्रदर्शन करे।
यह लेख के बाकी हिस्से के लिए ढांचा है: बाधा से आगे बढ़ें, डिज़ाइन संपादित करें, स्क्रीन क्लोन करें, निर्णय जारी करें बिना इन चरणों को मिलाए।
संवर्धित मांस कोशिका लाइनों के लिए जीन नॉकआउट कार्यप्रवाह
लक्ष्य जीन का चयन करें और सही संपादन रणनीति चुनें
लक्षण को एक लक्षित पथ या नियामक नोड पर मैप करें
एक बार संपादन लक्ष्य स्पष्ट हो जाने के बाद, अगला कदम उत्पादन बाधा को एक विशिष्ट नियामक नोड तक वापस ट्रेस करना है। धीमी डबलिंग समय या कमजोर निलंबन वृद्धि अक्सर एक परिभाषित पथ नोड पर मैप होती है, जो संवर्धित मांस को स्केल करने में महत्वपूर्ण चुनौतियाँ प्रस्तुत करती है, जैसे कि हिप्पो, RAS, WNT/β-कैटेनीन या NOTCH [1].
यह कागज पर सरल लगता है। व्यवहार में, यह शायद ही कभी होता है। एक जीन जो एक सेटिंग में वृद्धि का समर्थन करता है, वह दूसरे में जीवित रहने या विभेदन के लिए आवश्यक हो सकता है। लक्षित करने से पहले, उस प्रजाति और कोशिका प्रकार में साक्ष्य की जाँच करें जिसकी आपको परवाह है। देखें कि जीन का कार्य अनावश्यक है या आवश्यक, और पुष्टि करें कि कार्य की हानि से मयोजनिक या एडिपोजेनिक क्षमता, जीनोमिक स्थिरता, या अंतिम उत्पाद की किसी भी सुरक्षा-संबंधित विशेषता को नुकसान नहीं होगा [1].
किसी भी जीन को सार्वभौमिक रूप से उपयुक्त मानने के बिना उम्मीदवार लक्ष्यों का आकलन करें
NF2 - जो मर्लिन प्रोटीन को एन्कोड करता है - खेती किए गए मांस अनुसंधान में एक नॉकआउट लक्ष्य का एक अच्छा उदाहरण है। Ivy Farm Technologies ने दिखाया कि NF2 नॉकआउट ने डबलिंग समय को कम किया और सूअर और गोवंशीय लाइनों में निलंबन अनुकूलन का समर्थन किया जबकि वंश मार्करों को संरक्षित किया [1]. क्योंकि NF2 हिप्पो, RAS, WNT/β-कैटेनीन और NOTCH सिग्नलिंग के बीच स्थित है, एक नॉकआउट कई वृद्धि मार्गों को एक साथ स्थानांतरित कर सकता है बिना मल्टीप्लेक्स संपादन के [1].
MSTN (मायोस्टेटिन) एक और लक्ष्य है जो अक्सर सामने आता है, विशेष रूप से जब उद्देश्य मांसपेशी कोशिका उपज को सुधारना होता है। सेल-साइकिल नियामक जैसे RB1 और TP53 भी बहुस्तरीय रणनीतियों में दिखाई देते हैं जो प्रसार क्षमता को बढ़ाने के लिए बनाई गई हैं। लेकिन एक सार्वभौमिक लक्ष्य जैसी कोई चीज नहीं होती। एक जीन जो एक प्रजाति या कोशिका प्रकार में काम करता है, उसे दूसरे में अलग से सत्यापन की आवश्यकता होती है। वही संपादन एक अलग फेनोटाइप दे सकता है, या इसके साथ अस्थिरता ला सकता है। यदि आपके सामने वंशावली में डेटा नहीं है, तो यह न मानें कि परिणाम स्थानांतरित हो जाएगा [1].
नॉकआउट की तुलना नॉकडाउन, मल्टीप्लेक्स एडिटिंग और गेन-ऑफ-फंक्शन दृष्टिकोणों से करें
| संपादन रणनीति | कब उपयोग करें | मुख्य सीमा | आवश्यक साक्ष्य |
|---|---|---|---|
| एकल-जीन नॉकआउट | नकारात्मक नियामक को स्थायी रूप से हटाने के लिए (e.g. , NF2, MSTN) जो सीधे वृद्धि या निलंबन अनुकूलन को प्रतिबंधित करता है [1] | आवश्यक द्वितीयक कार्यों के अपरिवर्तनीय नुकसान की संभावना | लक्ष्य वंश में जीवन और विभेदन के लिए गैर-आवश्यकता की पुष्टि[1] |
| मल्टीप्लेक्स नॉकआउट | जब समानांतर मार्गों को एक साथ दबाना आवश्यक हो (e.g. , RB1, TP53, और RAS संयोजन) [1] | जीनोमिक अस्थिरता और संचयी ऑफ-टारगेट प्रभावों का बढ़ा हुआ जोखिम [1] | सभी संपादित लोकी में तालमेल प्रभाव डेटा और कठोर ऑफ-टारगेट स्क्रीनिंग [1] |
| नॉकडाउन (RNAi/siRNA/CRISPRi) | जब एक जीन आवश्यक होता है या आंशिक कमी लक्षण तक पहुंचने के लिए पर्याप्त होती है [1] | अक्सर अस्थायी; निरंतर वितरण या स्थिर shRNA एकीकरण की आवश्यकता होती है | खुराक-प्रतिक्रिया डेटा दिखा रहा है कि आंशिक कमी लक्ष्य फेनोटाइप प्राप्त करती है [1] |
| गेन-ऑफ-फंक्शन (CRISPRa या नॉक-इन) | एक वृद्धि-प्रचारक मार्ग को सक्रिय करने या एक नई क्षमता जोड़ने के लिए [1] | जटिल सम्मिलन वर्कफ़्लो; ऑन्कोजेनिक परिवर्तन या चयापचय भार का जोखिम [1] | सत्यापन कि बढ़ी हुई अभिव्यक्ति विभेदन क्षमता को बाधित नहीं करती है [1] |
इस तुलना का उपयोग गाइड डिज़ाइन शुरू होने से पहले संपादन रणनीति को तय करने के लिए करें।यदि जीन आवश्यक है, या यदि आपके लिए परिवर्तन की आवश्यकता पूर्ण हटाने के बजाय डिग्री का मामला है, तो नॉकडाउन या CRISPRi अधिक सटीक नियंत्रण प्रदान करता है। मल्टीप्लेक्स एडिटिंग का तभी अर्थ है जब एकल-जीन डेटा दिखाता है कि अतिरिक्त जटिलता इसके लायक है [1][2].
एक बार जब एडिट क्लास तय हो जाए, तो पूर्ण कार्यक्षमता की हानि के लिए गाइड RNA डिज़ाइन करें।
sbb-itb-ffee270
जीन गतिविधि की वास्तविक हानि के लिए गाइड RNA डिज़ाइन करें
संदर्भ अनुक्रम, ट्रांसक्रिप्ट संरचना और वेरिएंट प्रोफ़ाइल की पुष्टि करें
गाइड अनुक्रम नहीं, जीन मॉडल से शुरू करें। गाइड डिज़ाइन तभी शुरू होना चाहिए जब आपने लक्ष्य चयन पूरा कर लिया हो और पैतृक-लाइन अनुक्रम की पुष्टि कर ली हो।
सही प्रजाति-विशिष्ट संदर्भ जीनोम का उपयोग करें। फिर पूर्ण ट्रांसक्रिप्ट संरचना को मैप करें: एक्सॉन सीमाएं, कोडिंग अनुक्रम की शुरुआत और अंत, और सभी एनोटेटेड आइसोफॉर्म्स। उसके बाद, पैतृक लाइन की स्वयं पुष्टि करें।यदि एक गाइड एक संरचनात्मक एक्सॉन को छोड़ देता है, तो एक कार्यात्मक आइसोफॉर्म फिर भी जीवित रह सकता है।
मूल स्थान को पीसीआर-अम्प्लीफाई करें, एम्प्लिकॉन का सैंगर-सीक्वेंस करें, और प्रारंभिक अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए अनुक्रम कॉल्स की तुलना करें। ICE का उपयोग पहले से मौजूद वेरिएंट्स या पॉलीमॉर्फिज़्म को चिह्नित करने के लिए करें। एक बार प्रारंभिक स्थान को लॉक कर दिया जाए, तो गाइड्स को फ्रेमशिफ्ट संभावना और ऑफ-टारगेट प्रोफाइल.
फ्रेमशिफ्ट संभावना और कम ऑफ-टारगेट जोखिम के लिए गाइड साइट्स को रैंक करें
जीन मॉडल की पुष्टि करने के बाद, गाइड चयन को संरचनात्मक कोडिंग एक्सॉन्स. पर केंद्रित करें। ये वे एक्सॉन्स हैं जो हर एनोटेटेड आइसोफॉर्म में मौजूद होते हैं, इसलिए वहां संपादन सभी संबंधित ट्रांसक्रिप्ट्स को बाधित करने की अधिक संभावना रखते हैं।
ऑफ-टारगेट जोखिम उतना ही महत्वपूर्ण है। वाइल्ड-टाइप SpCas9 तीन से पांच म्यूटेशन्स को सहन कर सकता है, विशेष रूप से PAM-दूरस्थ स्थानों पर।इसलिए एक गाइड जिसमें एक मजबूत पूर्वानुमानित ऑन-टारगेट स्कोर है, फिर भी अनपेक्षित कटौती कर सकता है, विशेष रूप से क्लोनल विस्तार के बाद।
उस जोखिम को कम करने का एक सरल तरीका है गाइड को 17–18 bp तक ट्रिम करना। यह ऑफ-टारगेट संपादन घटनाओं को 500 गुना तक कम कर सकता है, जबकि ऑन-टारगेट सटीकता में थोड़ा नुकसान होता है [2]. व्यवहार में, 70% ऑन-टारगेट दक्षता और एक साफ ऑफ-टारगेट प्रोफाइल वाला गाइड आमतौर पर एक बेहतर प्रारंभिक बिंदु होता है, बजाय 90% दक्षता और कई उच्च-जोखिम पूर्वानुमानित साइटों के।
उस रैंकिंग को सीधे नीचे दिए गए न्यूक्लिएस विकल्प में फीड करना चाहिए।
उस संपादन प्रणाली का चयन करें जो नॉकआउट उद्देश्य के अनुरूप हो
संपादन प्रणाली गाइड डिज़ाइन को उतना ही आकार देती है जितना कि लक्ष्य जीन करता है। खेती किए गए मांस सेल लाइनों में डोनर-मुक्त नॉकआउट कार्य के लिए मुख्य विकल्प नीचे दिए गए हैं।
| संपादन प्रणाली | DSB आवश्यक | विशिष्ट नॉकआउट तंत्र | गाइड डिज़ाइन निहितार्थ | सर्वोत्तम उपयोग |
|---|---|---|---|---|
| SpCas9 न्यूक्लिएस | हाँ | फ्रेमशिफ्ट इंडेल्स NHEJ के माध्यम से | 20 बीपी गाइड + NGG PAM; उच्च ऑफ-टारगेट जोखिम | मजबूत प्राथमिक या अमर लाइनों में मानक नॉकआउट |
| हाई-फाई Cas9 वेरिएंट | हाँ | फ्रेमशिफ्ट इंडेल्स NHEJ के माध्यम से | 20 बीपी गाइड + NGG PAM; संकीर्ण ऑफ-टारगेट जोखिम | जब ऑफ-टारगेट जोखिम बढ़ा हुआ हो |
| Cas12a (Cpf1) | हाँ | फ्रेमशिफ्ट इंडेल्स NHEJ के माध्यम से | T-समृद्ध PAM जैसे TTTN; सीढ़ीनुमा कट बनाता है | AT-समृद्ध लोकी या कई लक्ष्यों के मल्टीप्लेक्स्ड नॉकआउट |
कई डोनर-मुक्त नॉकआउट कार्यों के लिए, SpCas9 न्यूक्लिएस के साथ 17–18 बीपी ट्रंकेटेड गाइड एक ठोस प्रारंभिक बिंदु है।उच्च-निष्ठा वेरिएंट्स तब समझ में आते हैं जब ऑफ-टारगेट परिदृश्य भीड़भाड़ वाला होता है। Cas12a एक अच्छा विकल्प है जब लोकेस AT-समृद्ध होता है या जब एक ट्रांसफेक्शन को एक साथ कई जीनों को बाधित करने की आवश्यकता होती है।
मुख्य बिंदु सरल है: उस प्रणाली को उद्देश्य के अनुसार मिलाएं बजाय इसके कि आप सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्लेटफॉर्म पर निर्भर रहें। वह विकल्प गाइड नियमों को सेट करता है और उसके बाद के डोनर-मुक्त नॉकआउट वर्कफ़्लो और क्लोन स्क्रीन को आकार देता है।
डोनर-मुक्त नॉकआउट वर्कफ़्लो चलाएं और क्लोन को सही ढंग से स्क्रीन करें
संपादन ट्रेसबिलिटी के साथ डोनर-मुक्त वर्कफ़्लो चलाएं
एक बार गाइड और न्यूक्लिएस लॉक हो जाने के बाद, अगला कदम डोनर-मुक्त डिलीवरी और चरणबद्ध क्लोन स्क्रीनिंग है।
किसी भी न्यूक्लिएस को पेश करने से पहले, पैतृक लाइन को प्रमाणित करें। प्रजातियों, ऊतक स्रोत, पासेज संख्या, और कैरियोटाइप या STR प्रोफाइल को रिकॉर्ड करें। वह प्रारंभिक रिकॉर्ड आपको आगे के लिए एक साफ संदर्भ बिंदु देता है।
डिलीवरी के लिए, RNP (राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन) कॉम्प्लेक्स - पहले से असेंबल किया गया Cas9 प्रोटीन और sgRNA - प्लास्मिड या वायरल प्रारूपों की तुलना में अधिक पसंद किए जाते हैं [2]. साधारण शब्दों में, RNP डिलीवरी संपादक को कोशिका के अंदर कम समय के लिए रखती है, जिससे कम-आवृत्ति वाले ऑफ-टारगेट कटिंग की संभावना कम हो जाती है [2]. ट्रांसफेक्शन के बाद, किसी भी संवर्धन चरण से पहले कोशिकाओं को पर्याप्त समय दें। संवर्धन पूल में संपादित कोशिकाओं के अंश को बढ़ा सकता है, लेकिन यह वैकल्पिक है और इसे किसी भी तरह से लॉग किया जाना चाहिए [1].
डोनर-फ्री नॉकआउट वर्कफ़्लो में, सभी मरम्मत एंड-जॉइनिंग से होती है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि हर इंडेल आपको एक नल एलील नहीं देता। इन-फ्रेम म्यूटेशन - तीन बेस पेयर्स के सटीक गुणकों में इंडेल्स - पढ़ने के फ्रेम को बरकरार रख सकते हैं और प्रोटीन के कार्य को संरक्षित कर सकते हैं [1]. इसलिए जीनोटाइप स्क्रीनिंग को एक शून्य एलील और, जहाँ आवश्यक हो, द्विआलीलिक हानि दिखानी चाहिए, न कि केवल "एक संपादन हुआ"।
नीचे दी गई तालिका प्रत्येक चरण में रखने योग्य रिकॉर्ड दिखाती है ताकि संपादन इतिहास का पता लगाया जा सके।
| चरण | आवश्यक रिकॉर्ड्स |
|---|---|
| माता-पिता प्रमाणीकरण | प्रजाति, ऊतक स्रोत, पासेज संख्या, कैरियोटाइप/एसटीआर प्रोफाइल |
| गाइड डिज़ाइन | gRNA आईडी, अनुक्रम और लंबाई |
| वितरण | न्यूक्लिएस प्रकार, वितरण प्रारूप (RNP/प्लास्मिड), ट्रांसफेक्शन पैरामीटर्स |
| बल्क पूल स्क्रीनिंग | ICE/TIDE स्कोर, फ्रेमशिफ्ट इंडेल्स का प्रतिशत |
| क्लोनल आइसोलेशन | आइसोलेशन विधि (FACS या सीमित डाइल्यूशन), क्लोन आईडी, प्लेट मैप |
| जीनोटाइप सत्यापन | एलील-विशिष्ट अनुक्रमण, द्विअल्लीलीक हानि की पुष्टि |
| कार्यात्मक फिट | डबलिंग समय डेटा, सतह मार्कर अभिव्यक्ति, निलंबन फिटनेस |
निर्णय लें कि कब बल्क पूल उपयोगी हैं और कब क्लोनल लाइन्स की आवश्यकता है
जब आपको तेज़ रीडआउट्स की आवश्यकता होती है, तो बल्क संपादित पूल उपयोगी होते हैं।वे गाइड आरएनए दक्षता को रैंक करने, उम्मीदवार लक्ष्यों के बीच प्रारंभिक वृद्धि तुलना चलाने, और क्लोनल आइसोलेशन पर हफ्तों खर्च किए बिना उच्च-थ्रूपुट लक्ष्य सत्यापन करने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं। 2023 में, Ivy Farm Technologies के शोधकर्ताओं ने पोर्सिन मायोब्लास्ट पूल का उपयोग किया, जिन्हें Cas9 और sgRNA के साथ ट्रांसफेक्ट किया गया था, जो NF2 जीन को लक्षित करते थे, पूल स्तर पर नॉकआउट दक्षताओं का आकलन करने के लिए Sanger अनुक्रमण और ICE विश्लेषण के साथ क्लोनल आइसोलेशन पर जाने से पहले [1].
लेकिन इसमें एक पेंच है। एंड-जॉइनिंग आपको एक मिश्रित जनसंख्या देती है: वाइल्ड-टाइप कोशिकाएं, हेटेरोजाइगस एडिट्स, फ्रेमशिफ्ट्स, और इन-फ्रेम एलील्स सभी एक ही पूल में। कोई भी फेनोटाइप जो आप मापते हैं वह उस मिश्रण के औसत के रूप में होता है, न कि एक साफ नॉकआउट रीडआउट। यही कारण है कि एक बल्क पूल एक विश्वसनीय नॉकआउट दावा का समर्थन नहीं कर सकता [1].
| विशेषता | बल्क संपादित पूल | एकल-कोशिका-व्युत्पन्न क्लोन |
|---|---|---|
| गति | उच्च (दिनों) | निम्न (सप्ताह से महीने) |
| जीनोटाइप रिज़ॉल्यूशन | निम्न (जनसंख्या औसत) | उच्च (परिभाषित एलील्स की पुष्टि) |
| क्लोनल विविधता | जनसंख्या औसत द्वारा छुपा | दृश्यमान; सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन करने वाली लाइन का चयन करने की अनुमति देता है |
| स्क्रीनिंग बोझ | निम्न | उच्च |
| उपयुक्तता | लक्ष्य खोज, गाइड रैंकिंग, प्रारंभिक वृद्धि अध्ययन | प्रक्रिया विकास, प्रोटीन-हानि सत्यापन, नियामक रिलीज |
जब प्रक्रिया विकास को एक परिभाषित जीनोटाइप की आवश्यकता हो, तो एकल-कोशिका क्लोनिंग की ओर बढ़ें।क्लोन वृद्धि के दौरान, वंशानुगत-संरक्षण स्थितियों के तहत विस्तार करें और पैतृक मार्करों का ट्रैक रखें [1].
चरणों में जीनोटाइप, प्रोटीन हानि और कार्यात्मक फेनोटाइप की स्क्रीनिंग करें
स्क्रीनिंग एक बड़े पास के बजाय एक चरणबद्ध कार्यप्रवाह के रूप में सबसे अच्छा काम करती है।
- चरण 1 बल्क पूल लोकेस चेक है। लक्षित क्षेत्र को पीसीआर-अम्प्लीफाई करें और इसे आईसीई डीकंपोजिशन के साथ सैंगर अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण करें। यह आपको एक समग्र संपादन दक्षता स्कोर और एक इंडेल वितरण देता है, जो आमतौर पर यह तय करने के लिए पर्याप्त होता है कि क्या क्लोनल आइसोलेशन करना उचित है।
- चरण 2 क्लोन-स्तरीय एलील्स को हल करता है। एक बार क्लोन अलग हो जाने पर, एम्प्लिकॉन अनुक्रमण (एनजीएस) या एलील-विशिष्ट सैंगर यह दिखा सकता है कि क्या प्रत्येक क्लोन द्विअलीलिक हानि ले जाता है या क्या एक एलील इन-फ्रेम वेरिएंट के रूप में बच गया।
- चरण 3 प्रोटीन हानि की जांच करता है।जीनोटाइप अकेले कार्यक्षमता की हानि को साबित नहीं करता है। एक ट्रंकेटेड प्रोटीन अभी भी कुछ गतिविधि बनाए रख सकता है। वेस्टर्न ब्लॉट या फ्लो साइटोमेट्री प्रोटीन की अनुपस्थिति का प्रत्यक्ष प्रमाण देती है।
- स्टेज 4 संपादन लक्ष्य से जुड़े फेनोटाइप का परीक्षण करता है: डबलिंग समय, सस्पेंशन अनुकूलन, या विशिष्ट लक्षण जिसे नॉकआउट द्वारा बदलने का उद्देश्य था। इस रीडआउट को पूर्व-निर्धारित पैसेज विंडो के दौरान स्थिर रहना चाहिए [1] [2].
नीचे दी गई तालिका दिखाती है कि प्रत्येक स्क्रीनिंग विधि आपको क्या बता सकती है - और क्या नहीं।
| विधि | यह क्या स्थापित करता है | सीमाएँ |
|---|---|---|
| Sanger + ICE विश्लेषण | पूल-स्तरीय इंडेल आवृत्ति और फ्रेमशिफ्ट वितरण | व्यक्तिगत कोशिकाओं में विशिष्ट एलीलिक संयोजनों को हल नहीं कर सकता |
| एम्प्लिकॉन अनुक्रमण (NGS) | उच्च-रिज़ॉल्यूशन एलील पहचान; ऑफ-टारगेट साइट का पता लगाना | उच्च लागत; लंबा टर्नअराउंड |
| डिजिटल पीसीआर (ddPCR) | संपादन आवृत्ति या प्रति लक्ष्य प्रति संख्या की सटीक मात्रा | प्रत्येक लक्ष्य के लिए विशिष्ट जांच डिज़ाइन की आवश्यकता होती है |
| वेस्टर्न ब्लॉट / लक्षित प्रोटिओमिक्स | लक्ष्य का प्रोटीन-स्तरीय नुकसान | अर्ध-मात्रात्मक; मान्य एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है |
| फ्लो साइटोमेट्री | सतह या अंतःकोशिकीय प्रोटीन हानि; वंश मार्कर प्रतिधारण | उच्च-गुणवत्ता वाली प्रजातियों-मान्य एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है |
| मल्टी-पैसेज ग्रोथ परख | डबलिंग समय स्थिरता और उत्पादन फिटनेस | समय लेने वाला; सांख्यिकीय वैधता के लिए न्यूनतम चार पैसेज |
प्रयोगशाला से उत्पादन की ओर बढ़ने वाली टीमों के लिए, विभिन्न बायोरिएक्टर प्रणालियों में कोशिका रेखाओं के स्केलिंग की लागत को समझना एक महत्वपूर्ण अगला कदम है।
संपादित क्लोनल लाइनों की तुलना हमेशा एक मेल खाते पैतृक-लाइन केवल Cas9, बिना-sgRNA नियंत्रण के साथ करें. यह नियंत्रण संपादन-विशिष्ट प्रभावों को ट्रांसफेक्शन और संस्कृति तनाव से अलग करने में मदद करता है, प्रक्रिया-फिट सत्यापन से पहले।
संस्कृत मांस प्रक्रिया फिट और रिलीज के लिए नॉकआउट को सत्यापित करें
संपादन पहचान, आणविक परिणाम, कोशिका कार्य और उत्पादन फिटनेस के पार सत्यापित करें
एक बार क्लोनल जीनोटाइप और प्रोटीन स्क्रीन हो जाने के बाद, अगला कदम रिलीज़ सत्यापन है। इस चरण में, केवल उन लाइनों को सत्यापित करें जो पहले से ही रिलीज़ मानदंडों को पूरा करती हैं। रिलीज़ पैकेज में चार जांच शामिल होनी चाहिए: संपादन पहचान, आणविक परिणाम, कोशिका कार्य, और उत्पादन फिटनेस.
संपादन पहचान को लक्ष्य स्थान के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा पुष्टि की जाती है, इसके बाद सैंगर अनुक्रमण और ICE विश्लेषण किया जाता है।यह दिखाता है कि रिलीज़ चरण में क्लोन में फ्रेमशिफ्ट या द्विअल्ली नॉकआउट है या नहीं [1].
इसके बाद, प्रोटीन हानि और वंशावली प्रतिधारण की जाँच करें CD29, CD56, और CD90 के लिए फ्लो साइटोमेट्री द्वारा। यह लक्ष्य प्रोटीन की हानि की पुष्टि करता है और दिखाता है कि संपादन वर्कफ़्लो के माध्यम से कोशिका ने अपनी वंशावली पहचान बनाए रखी है [1].
यदि वे वंशावली मार्कर अभी भी मौजूद हैं, तो भिन्नीकरण पर आगे बढ़ें। कोशिका कार्य मान्यता BODIPY धुंधला का उपयोग करती है एडिपोजेनिक लाइनों के लिए और मायोट्यूब फ्यूजन इंडेक्स मायोजेनिक लाइनों के लिए [1].
केवल उसके बाद आपको यह परीक्षण करना चाहिए कि क्या लाइन अभी भी प्रक्रिया की स्थितियों के तहत प्रदर्शन करती है। उत्पादन फिटनेस को सस्पेंशन कल्चर में आंका जाना चाहिए।त्रिप्लिकेट अर्लेनमेयर फ्लास्क वृद्धि वक्र कम से कम चार पासेज पर चलाए जाते हैं क्योंकि वे वृद्धि दोषों को प्रकट कर सकते हैं जो तुरंत नहीं बल्कि बाद में दिखाई देते हैं [1][2].
मिलान किए गए पैतृक-रेखा नियंत्रणों का उपयोग करके उन लक्षणों को मापें जो महत्वपूर्ण हैं
प्रत्येक परीक्षण को सत्यापन ढांचे में एक मिलान किए गए पैतृक-रेखा नियंत्रण के खिलाफ चलाया जाना चाहिए, या तो वाइल्ड-टाइप कोशिकाएं या केवल Cas9, बिना-sgRNA पूल। उस संदर्भ बिंदु के बिना, यह बताना कठिन हो जाता है कि देखे गए परिवर्तन नॉकआउट से ही आते हैं या संपादन-संबंधित तनाव से।
जहां प्रक्रिया इसकी मांग करती है, रिलीज पैकेज में तनाव और स्थिरता जांच जोड़ें। उच्च-शियर या अमोनिया चुनौती के बाद जीवन क्षमता प्रक्रिया-संबंधी रीडआउट के रूप में काम कर सकती है। जीनोमिक स्थिरता की जांच कैरियोटाइपिंग द्वारा या पूर्वानुमानित ऑफ-टारगेट साइट्स पर लक्षित NGS द्वारा की जा सकती है।
उद्देश्य के अनुरूप रिलीज़ निर्णय लें
एक क्लोन को तभी आगे बढ़ना चाहिए जब वह संपादन पहचान, आणविक परिणाम, कोशिका कार्य, और उत्पादन फिटनेस, के पूर्व-निर्धारित मानकों को पूरा करता हो, बिना पहचान, जीनोमिक स्थिरता, या प्रक्रिया प्रदर्शन को नुकसान पहुँचाए।
| प्रमाणीकरण स्तर | साक्ष्य प्रकार | परीक्षण / विधि | नियंत्रण | स्वीकृति मानदंड | निर्णय |
|---|---|---|---|---|---|
| पहचान संपादित करें | एलील विशेषता | PCR + सैंगर अनुक्रमण + ICE विश्लेषण | मूल जंगली प्रकार | फ्रेमशिफ्ट या द्विअल्लीलीय नॉकआउट की पुष्टि | जारी रखें / न जारी करें |
| आणविक परिणाम | प्रोटीन हानि; वंशावली प्रतिधारण | फ्लो साइटोमेट्री (CD29, CD56, CD90) | Cas9-केवल पूल | लक्ष्य प्रोटीन हानि; वंशावली मार्कर बरकरार | जारी रखें / न जारी करें |
| कोशिका कार्य | विभेदन क्षमता | BODIPY धुंधला या मायोट्यूब फ्यूजन सूचकांक | मिलान मूल रेखा | विभेदन क्षमता बरकरार या बढ़ी | जारी रखें / न जारी करें |
| उत्पादन फिटनेस | निलंबन वृद्धि स्थिरता | कई पासेज में डबलिंग समय और जीवन शक्ति | मूल नियंत्रण | स्थिर, निलंबन में डबलिंग समय कम | जारी रखें / न जारी करें |
| प्रक्रिया तनाव सहिष्णुता | तनाव के तहत जीवन शक्ति | उच्च-शियर या अमोनिया चुनौती के बाद जीवन शक्ति परीक्षण | मानक मीडिया नियंत्रण | प्रक्रिया-संबंधी तनाव के तहत उच्च जीवन शक्ति | जारी रखें / न जारी करें |
| जीनोमिक स्थिरता | ऑफ-टारगेट सुरक्षा | पूर्वानुमानित ऑफ-टारगेट साइट्स पर कैरियोटाइपिंग या लक्षित NGS | मूल जंगली प्रकार | कोई अस्वीकार्य ऑफ-टारगेट उत्परिवर्तन या ट्रांसलोकेशन नहीं | जारी रखें / न जारी करें |
CRISPR KO बनाम CRISPR KI प्रयोग CRISPR-Cas9 का उपयोग करके
निष्कर्ष: संपादन सफलता को उत्पादन प्रासंगिकता से जोड़ें
प्रमाणीकरण के बाद, अंतिम प्रश्न यह है कि क्या संपादन उत्पादन में सुधार करता है।एक संवर्धित मांस कार्यक्रम में, एक जीन नॉकआउट केवल तभी रखने लायक है जब यह मापने योग्य उत्पादन लाभ प्रदान करता है - न कि केवल एक पुष्टि की गई संपादन [1].
NF2 मामला दिखाता है कि जीनोटाइप को प्रोटीन अभिव्यक्ति, वंश पहचान और वृद्धि डेटा के साथ जांचना क्यों आवश्यक है, इससे पहले कि किसी लाइन को उपयुक्त माना जाए। यही अंतर है एक विशेषीकृत क्लोन और एक लाइन जिसमें केवल जीनोटाइप संपादन है।
तब भी, प्रक्रिया संदर्भ परिणाम को बदल सकता है। क्लोन का परीक्षण उसी माध्यम, संस्कृति प्रारूप और सेल घनत्व में करें जिसका वह उत्पादन में सामना करेगा, न कि केवल खोज संस्कृति में। इसका मतलब है कि किसी भी रिलीज निर्णय से पहले माध्यम संरचना, सस्पेंशन प्रारूप और मार्ग स्थिरता के प्रदर्शन की जांच करना।
केवल वे क्लोन जो सभी चार रिलीज स्तरों को पार करते हैं, रिलीज के लिए तैयार हैं।
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
केवल जीनोटाइप क्यों पर्याप्त नहीं है?
केवल जीनोटाइप पर्याप्त नहीं है। संवर्धित मांस उत्पादन में, प्रदर्शन आनुवंशिक क्षमता, प्रक्रिया की स्थिति, और कोशिका-स्थिति स्मृति.
के बीच के अंतःक्रिया पर निर्भर करता है।जीन संपादन कुछ कठिन सीमाओं को ठीक कर सकता है, लेकिन यह सटीक प्रक्रिया नियंत्रण की जगह नहीं लेता। मीडिया बाहरी संकेत प्रदान कर सकता है, लेकिन वे संकेत कोशिका-स्थिति स्मृति को स्थायी रूप से सेट नहीं करते। और एक बार जब संकेत हटा दिए जाते हैं, तो वे प्रतिलेखन शोर को वापस आने से नहीं रोक सकते।
यही कारण है कि सफल उत्पादन तीनों टुकड़ों के एक साथ काम करने पर निर्भर करता है: जीन डिज़ाइन, मीडिया अनुकूलन, और बायोरिएक्टर फिट.
मुझे क्लोन के बजाय पूल का उपयोग कब करना चाहिए?
जीन नॉकआउट डिज़ाइन और प्रक्रिया विकास के प्रारंभिक चरणों में पूल का उपयोग करें।वे आपको मिश्रित जनसंख्या में संपादन के समग्र प्रभाव का तेजी से मूल्यांकन करने देते हैं, जो उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और प्रारंभिक सत्यापन में मदद करता है।
पूल्स पूर्वाग्रह या फेनोटाइपिक बहाव के जोखिम को भी कम करते हैं जो तब दिखाई दे सकते हैं जब आप एकल क्लोन पर बहुत जल्दी निर्भर करते हैं।
मैं कैसे जानूं कि एक नॉकआउट उत्पादन के लिए तैयार है?
एक नॉकआउट उत्पादन के लिए तैयार होता है जब संपादित संवर्धित मांस कोशिका रेखा विस्तारित पासिंग के दौरान आनुवंशिक और फेनोटाइपिक रूप से स्थिर रहती है, जबकि लगातार उच्च जीवन शक्ति और मयोजनिक कार्य या प्रसार बनाए रखती है।
इसे आपकी प्रक्रिया आवश्यकताओं के अनुरूप भी होना चाहिए। इसमें निलंबन अनुकूलन या सीरम-मुक्त परिस्थितियों में कम डबलिंग समय शामिल हो सकता है। जीन संपादन, मीडिया सूत्रीकरण, और बायोरिएक्टर संगतता को एक प्रणाली के रूप में परीक्षण करने की आवश्यकता है, न कि अलग-अलग भागों के रूप में।
