Kriopreservasi adalah proses pembekuan dan penyimpanan sel hidup pada suhu ultra-rendah untuk mempertahankan viabilitasnya dari waktu ke waktu. Metode ini sangat penting untuk produksi daging yang dibudidayakan, memastikan garis sel yang konsisten dan stabil serta melindungi dari kerugian akibat kontaminasi atau kegagalan peralatan. Langkah-langkah utama meliputi:
- Persiapan: Panen sel selama fase pertumbuhannya, periksa viabilitas (targetkan ≥90%), dan siapkan dalam media pembekuan dengan krioprotektan seperti DMSO atau gliserol.
- Pembekuan: Gunakan laju pendinginan terkontrol (-1°C hingga -3°C per menit) untuk mencegah kerusakan kristal es. Simpan sel dalam uap nitrogen cair (-135°C hingga -190°C) untuk pengawetan jangka panjang.
- Pencairan: Cepat cairkan sel dalam bak air 37°C untuk meminimalkan toksisitas krioprotektan, lalu pindahkan ke media pertumbuhan untuk pemulihan.
- Kontrol Kualitas: Labeli vial dengan akurat, pantau kondisi penyimpanan, dan uji kelangsungan hidup setelah pencairan untuk memastikan pelestarian yang berhasil.
Protokol Lengkap untuk Krio-Preservasi Garis Sel: Proses 4 Langkah dari Persiapan hingga Penyimpanan
Persiapan Sel untuk Krio-Preservasi
Pemanenan Sel dan Pemeriksaan Kelangsungan Hidup
Untuk memastikan pemulihan terbaik setelah pencairan, panen sel selama fase pertumbuhan logaritmik (log) mereka. Untuk garis sel yang melekat, ini biasanya ketika mereka mencapai 80–90% konfluensi [2][3][6].
Periksa kelangsungan hidup sel menggunakan metode eksklusi Trypan Blue. Campurkan bagian yang sama (1:1) dari 0,4% Trypan Blue dengan suspensi sel, kemudian hitung sel menggunakan hemocytometer.Sel-sel yang masih hidup akan mengecualikan pewarna dan tampak cerah di bawah mikroskop, sementara sel-sel yang tidak hidup akan berwarna biru [4]. Idealnya, usahakan untuk mencapai viabilitas setidaknya 90% untuk tingkat pemulihan terbaik, meskipun beberapa protokol dapat menerima minimum 75% [1][2][3][5].
Sebelum memanen, gunakan mikroskop untuk memeriksa kontaminasi bakteri atau jamur. Sel-sel suspensi yang sehat harus tampak cerah, bulat, dan refraktil di bawah mikroskop fase-kontras terbalik [2][3].
Setelah sel-sel memenuhi standar viabilitas yang diperlukan, lanjutkan ke langkah-langkah pra-pembekuan.
Persiapan Pra-Pembekuan
Untuk sel yang melekat, gunakan metode disosiasi yang lembut, seperti tripsin atau TrypLE Express, dan batasi waktu inkubasi untuk menghindari kerusakan membran sel [5]. Siapkan sel pada konsentrasi 1 × 10⁶ hingga 1 × 10⁷ sel/mL, tergantung pada garis sel [1][6]. Saat mengalokasikan, pastikan suspensi sel sering diaduk untuk menjaga distribusi yang merata di seluruh kriovial [5].
Jaga media pembekuan tetap dingin antara 2°C dan 8°C selama resuspensi untuk mengurangi toksisitas krioprotektan sebelum proses pembekuan dimulai [5]. Setelah sel tersuspensi dalam media pembekuan, segera lanjutkan ke protokol pembekuan [1].Selalu kriopreservasi sel pada nomor pasase serendah mungkin untuk mengurangi risiko pergeseran genetik atau perubahan morfologi [5][7].
Memilih Krioprotektan dan Media Pembekuan
Opsi Krioprotektan dan Fungsinya
Dimetil sulfoksida (DMSO) banyak digunakan sebagai krioprotektan, biasanya pada konsentrasi 10% [2]. Ini bekerja dengan menembus membran sel dan mengurangi pembentukan es selama pembekuan. Namun, DMSO dapat menjadi toksik bagi sel pada suhu ruangan, sehingga pencairan cepat sangat penting untuk meminimalkan paparan dan segera mengencerkannya [1].
Gliserol berfungsi sebagai alternatif yang berguna untuk garis sel yang sensitif terhadap DMSO, umumnya digunakan dalam konsentrasi berkisar antara 5% hingga 15% [8].Ini sangat efektif untuk jenis sel di mana DMSO mungkin menyebabkan diferensiasi yang tidak diinginkan [3], dan cenderung memiliki toksisitas yang lebih rendah dibandingkan dengan DMSO.
Dalam aplikasi daging yang dibudidayakan, protokol pembekuan tradisional sering menggunakan campuran 90% Fetal Bovine Serum (FBS) dan 10% DMSO [1]. Namun, ketergantungan pada komponen yang berasal dari hewan membatasi metode ini dalam hal skalabilitas dan persetujuan regulasi [9]. Untuk mengatasi masalah ini, media yang didefinisikan secara kimia - seperti Synth-a-Freeze atau Recovery Cell Culture Medium - menyediakan alternatif bebas komponen hewan. Media ini mempertahankan viabilitas sel pasca-pencairan yang tinggi sambil mengatasi tantangan yang terkait dengan komponen asal hewan [9].
Perbandingan Media Pembekuan
Berikut adalah rincian kelebihan dan keterbatasan dari berbagai media pembekuan yang digunakan dalam produksi daging budidaya:
| Media | Kelebihan | Kekurangan | Kesesuaian Daging Budidaya |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO dalam FBS-DMEM | Protokol yang sudah mapan [1] | Mengandung komponen yang berasal dari hewan; variabilitas batch [9] | Skalabilitas terbatas |
| Synth-a-Freeze | Didefinisikan secara kimia; kualitas konsisten; bebas dari komponen hewan [9] | Biaya awal lebih tinggi [9] | Ya |
| Media Kultur Sel Pemulihan | Mudah digunakan; dirancang untuk pemulihan cepat [9] | Mungkin perlu optimasi untuk garis sel tertentu | Ya |
| 10% Gliserol dalam FBS | Alternatif untuk sel sensitif DMSO [1] | Bergantung pada serum asal hewan [9] | Skalabilitas terbatas |
Pada Februari 2023, peneliti di Tokyo Women's Medical University, yang dipimpin oleh Hironobu Takahashi, menunjukkan pentingnya memilih media pembekuan yang tepat.Menggunakan opsi komersial seperti CELLBANKER 1 dan 2, mereka berhasil mengawetkan sel myogenik sapi primer pada –80°C hingga satu tahun. Luar biasa, sel-sel ini mempertahankan kemampuan mereka untuk berkembang biak dan berdiferensiasi menjadi jaringan otot kontraktil dengan struktur sarkomer yang utuh setelah pencairan [10] .
Untuk produksi daging budidaya, media yang didefinisikan secara kimiawi dan sesuai dengan GMP semakin disukai. Seperti yang STEMCELL Technologies soroti:
Dalam bidang yang sangat diatur seperti terapi sel dan gen, disarankan untuk menggunakan media kriopreservasi yang diproduksi sesuai GMP dan sepenuhnya didefinisikan untuk memastikan bahwa produk diproduksi dan dikendalikan secara konsisten sesuai dengan standar kualitas [9].
Platform seperti
Prosedur Krio-preservasi dan Laju Pendinginan
Protokol Pembekuan Langkah-demi-Langkah
Kunci keberhasilan krio-preservasi terletak pada menjaga laju pendinginan yang stabil sebesar -1°C hingga -3°C per menit[2]. Proses bertahap ini memungkinkan air meninggalkan sel secara perlahan, mencegah pembentukan kristal es intraseluler yang merusak yang dapat merusak membran sel[1].
Mulailah dengan sentrifugasi sel pada 150 x g selama 5 menit[3]. Setelah disentrifugasi, suspensikan kembali pelet sel dalam media pembekuan dingin yang mengandung 10% DMSO pada konsentrasi 2–4×10⁶ sel/mL [3].Untuk mengurangi paparan DMSO, segera lanjutkan ke langkah berikutnya - pembekuan.
Distribusikan suspensi sel ke dalam vial kriogenik yang telah diberi label sebelumnya. Setiap vial harus dengan jelas menunjukkan detail penting seperti nama garis sel, nomor pasase, nomor lot, konsentrasi sel, dan tanggal pembekuan[3]. Dengan vial yang sudah disiapkan, saatnya memilih dan menggunakan peralatan pendingin yang sesuai.
Peralatan dan Teknik Pendinginan
Tempatkan vial segera ke dalam perangkat pendingin dengan laju terkontrol. Wadah pembekuan pasif, seperti Nalgene "Mr Frosty" (yang menggunakan isopropanol) atau Corning "CoolCell", adalah pilihan yang populer. Alat-alat ini dapat mencapai laju pendinginan sekitar 1°C per menit ketika ditempatkan dalam freezer -80°C[2] .
Untuk operasi skala besar di mana konsistensi sangat penting, freezer yang dapat diprogram dengan pengendalian laju adalah pilihan terbaik. Seperti yang dinyatakan oleh Sigma-Aldrich:
ECACC secara rutin menggunakan freezer yang dapat diprogram dengan pengendalian laju. Ini adalah cara paling andal dan dapat direproduksi untuk membekukan sel[3].
Setelah sekitar 24 jam pada -80°C, pindahkan vial ke fase uap nitrogen cair, di mana suhu berkisar antara -135°C dan -190°C, untuk penyimpanan jangka panjang [4]. Hindari menyimpan sel pada -80°C lebih dari seminggu, karena ini dapat mengurangi viabilitasnya. Suhu di bawah -135°C sangat penting untuk pelestarian tanpa batas waktu[2]. Menggunakan fase uap daripada fase cair mengurangi risiko kontaminasi silang sambil mempertahankan suhu yang cukup rendah.
Protokol Pencairan dan Pemulihan
Proses Pencairan
Mencairkan sel dengan cepat sangat penting untuk membatasi paparan krioprotektan yang beracun dan mencegah kristal es menyebabkan kerusakan. Pastikan untuk memakai pelindung wajah penuh dan sarung tangan berinsulasi untuk keselamatan. Mulailah dengan mengeluarkan kriovial dari nitrogen cair dan sedikit melonggarkan tutupnya untuk melepaskan tekanan yang terbangun. Kemudian, kencangkan kembali tutupnya.
Tempatkan vial dalam penangas air 37°C, pastikan tutupnya tetap di atas garis air. Biarkan mencair selama 1–2 menit, atau sampai hanya beberapa kristal es yang tersisa. Setelah mencair, lap bagian luar vial dengan alkohol 70% untuk menjaga kesterilan.
Transfer isi vial ke dalam tabung yang berisi 5–10 mL media pertumbuhan yang telah dipanaskan sebelumnya. Tambahkan media secara perlahan untuk membantu mengurangi kejutan osmotik. Jika Anda bekerja dengan garis sel suspensi, sentrifugasi suspensi sel segera pada 300 × g selama 5 menit pada 4°C.Langkah ini membantu mengendapkan sel dan menghilangkan krioprotektan. Setelah sentrifugasi, suspensikan kembali sel dalam medium segar. Untuk sel yang melekat, sentrifugasi biasanya tidak diperlukan. Sebaliknya, langsung tanam sel ke dalam wadah kultur yang sesuai dan hilangkan sisa DMSO selama pergantian media pertama, biasanya setelah 24 jam.
Penilaian Pasca-Pencairan
Segera setelah pencairan, periksa viabilitas sel untuk memastikan pemulihan berhasil. Gunakan metode eksklusi Trypan Blue untuk penilaian ini. Idealnya, viabilitas sel harus melebihi 90% [11], tetapi minimum 75% dapat diterima. Setelah 24 jam, periksa sel di bawah mikroskop fase-kontras untuk mengonfirmasi keterlekatan, mengevaluasi kepadatan sel, dan memeriksa tanda-tanda kontaminasi.
Lanjutkan memantau sel melalui pasase 1–3 untuk memastikan proliferasi normal dan bahwa mereka mempertahankan karakteristik yang diharapkan.Untuk lini sel yang pulih lebih lambat, Anda dapat meningkatkan kelangsungan hidup dengan meningkatkan konsentrasi serum sapi janin awal menjadi sekitar 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Penyimpanan dan Kelangsungan Hidup Jangka Panjang
Kondisi dan Durasi Penyimpanan
Untuk menjaga kelangsungan hidup lini sel dalam jangka panjang, penting untuk menyimpannya pada suhu di bawah -135°C [7][2]. Ini memastikan mereka tetap terawetkan tanpa batas waktu.
Metode yang disukai untuk menyimpan lini sel daging yang dibudidayakan adalah nitrogen cair fase uap. Teknik ini menjaga suhu antara -135°C dan -190°C, menjadikannya ideal untuk pengawetan jangka panjang sambil menawarkan keamanan yang lebih baik dibandingkan penyimpanan fase cair.
Jika Anda perlu menyimpan sel pada -80°C, batasi ini untuk periode 24 jam hingga satu minggu. Melebihi ini, kelangsungan hidup sel dapat menurun.Untuk penyimpanan sementara pada suhu ini, pindahkan sel ke penyimpanan nitrogen cair sesegera mungkin.
Gunakan vial kriogenik steril standar (1–2 mL) dengan ulir internal dan cincin O untuk penyimpanan yang aman [4][5]. Selalu letakkan cryovial yang tertutup di fase gas daripada fase cair nitrogen untuk mengurangi risiko ledakan vial selama pencairan [5]. Selain itu, pastikan wadah nitrogen cair massal tetap terisi setidaknya setengah penuh untuk menjaga buffer keamanan.
Akhirnya, langkah-langkah kontrol kualitas yang ketat sangat penting untuk memastikan kelangsungan hidup jangka panjang sel.
Pemeriksaan Kontrol Kualitas
Untuk memastikan keandalan garis sel yang disimpan, ikuti protokol ketat untuk kontrol kualitas. Mulailah dengan memberi label secara akurat pada setiap vial dengan label tahan nitrogen cair. Sertakan detail penting seperti identitas garis sel, nomor lot, nomor pasase, dan tanggal pembekuan. Pertahankan basis data elektronik untuk mencatat lokasi tepat setiap vial, yang mengurangi waktu wadah penyimpanan perlu tetap terbuka [7][2].
Sebelum menyimpan seluruh batch untuk jangka panjang, uji kelayakan satu vial setelah penyimpanan fase gas jangka pendek. Langkah ini membantu memastikan bahwa proses pembekuan berhasil dan mengidentifikasi masalah potensial [4][7][2]. Untuk stok sel yang sangat berharga, bijaksana untuk menyimpan duplikat di lokasi sekunder untuk melindungi dari kegagalan peralatan atau bencana lokal [7][2].
Lengkapi semua wadah penyimpanan dengan sistem pemantauan suhu dan alarm untuk mendeteksi tingkat nitrogen cair yang rendah [7]. Selain itu, pasang alarm oksigen di area penyimpanan, yang diatur untuk memicu pada 18% oksigen (v/v), untuk meminimalkan risiko asfiksia bagi personel yang bekerja dengan nitrogen cair [7][2].
Protokol video kriopreservasi garis sel mamalia
Kesimpulan dan Poin Penting
Berikut adalah ringkasan cepat dari langkah-langkah penting dan rekomendasi untuk kriopreservasi yang efektif dalam produksi daging yang dibudidayakan:
- Pemanenan Sel: Kumpulkan sel selama fase pertumbuhan logaritmik mereka, memastikan viabilitas melebihi 90%. Gunakan 10% DMSO sebagai krioprotektan, meskipun gliserol dapat menjadi alternatif untuk garis sel yang lebih halus [11][1].
- Penyejukan dan Penyimpanan: Pertahankan laju pendinginan yang terkontrol dan segera pindahkan vial ke penyimpanan nitrogen cair fase uap untuk melindungi integritas sel [11]
Sebuah studi oleh Roka Kakehi et al. menyoroti pentingnya presisi dalam kriopreservasi [10]:
"Memastikan sumber sel yang andal dan konsisten dengan menggunakan kriopreservasi akan memungkinkan kami untuk meningkatkan pasokan stabil sel yang menjanjikan untuk produksi daging budidaya." - Roka Kakehi et al., Tokyo Women's Medical University
- Proses Pencairan: Cairkan sel dalam bak air 37°C selama sekitar dua menit, berhenti ketika 80% es telah mencair. Ini mengurangi toksisitas DMSO dan meningkatkan pemulihan sel [1]. Lanjutkan dengan pemeriksaan viabilitas pasca-pencairan untuk memastikan keberhasilan dan menyempurnakan prosedur di masa depan.
Metode-metode ini bekerja sama dengan praktik kontrol kualitas yang ketat. Selalu beri label vial dengan akurat, jaga catatan tetap terorganisir, dan lakukan pemeriksaan menyeluruh sebelum penyimpanan jangka panjang [11]. Untuk kebutuhan kriopreservasi khusus, platform seperti
FAQ
Apa keuntungan menggunakan media yang didefinisikan secara kimiawi untuk mengawetkan garis sel dalam produksi daging budidaya?
Media yang didefinisikan secara kimiawi memberikan banyak manfaat ketika digunakan untuk mengawetkan garis sel dalam produksi daging budidaya. Dengan menghilangkan komponen yang tidak terdefinisi, seperti serum yang berasal dari hewan, mereka memastikan hasil yang konsisten dan dapat diprediksi - faktor penting untuk menjaga keandalan jangka panjang dari garis sel.
Keuntungan utama lainnya adalah risiko kontaminasi dan variabilitas yang berkurang. Ini tidak hanya mendukung standar kualitas dan keamanan yang lebih tinggi tetapi juga selaras dengan presisi dan skalabilitas yang diperlukan untuk memenuhi tuntutan regulasi dan harapan konsumen dalam industri daging budidaya.
Bagaimana pilihan krioprotektan mempengaruhi kelangsungan hidup sel selama pembekuan dan pencairan?
Pemilihan krioprotektan adalah faktor kunci dalam menjaga kesehatan sel selama pembekuan dan pencairan. Dua opsi yang banyak digunakan adalah dimetil sulfoksida (DMSO) dan gliserol, masing-masing dengan karakteristik yang berbeda. DMSO dikenal karena kemampuannya menembus sel dengan cepat dan memberikan perlindungan yang kuat. Namun, ada peringatan: pada konsentrasi tinggi atau dengan paparan yang lama, dapat menjadi toksik, yang berpotensi menurunkan viabilitas sel.
Gliserol, sebaliknya, kurang toksik dan dapat diterapkan secara langsung.Kelemahannya terletak pada laju penetrasi sel yang lebih lambat, yang dapat mengakibatkan perlindungan yang kurang segera dibandingkan dengan DMSO.
Mencapai keseimbangan yang tepat sangat penting. Menyesuaikan konsentrasi dan waktu paparan krioprotektan dengan benar membantu melindungi sel sambil meminimalkan risiko toksisitas. Selain itu, mematuhi praktik terbaik untuk laju pendinginan dan kondisi penyimpanan sangat penting untuk memastikan tingkat pemulihan tertinggi setelah pencairan.
Mengapa penting untuk mengontrol laju pendinginan selama kriopreservasi?
Mempertahankan laju pendinginan yang stabil, biasanya antara –1°C dan –3°C per menit, adalah kunci untuk menjaga sel tetap hidup. Pendinginan secara bertahap memungkinkan sel mengalami dehidrasi dengan kecepatan yang terkontrol, mengurangi kemungkinan terbentuknya kristal es yang berbahaya, yang dapat merobek atau merusak membran sel.
Pendekatan yang terukur ini melindungi struktur sel, meningkatkan kelangsungan hidup dan fungsionalitasnya setelah dicairkan.Mengikuti protokol pendinginan yang tepat sangat penting untuk memastikan penyimpanan jangka panjang dan pemulihan garis sel yang berhasil.
