Penyimpanan Cryo adalah proses membekukan dan menyimpan sel hidup pada suhu ultra-rendah untuk mempertahankan viabilitasnya seiring waktu. Metode ini sangat penting untuk produksi daging yang dibudidayakan, memastikan garis sel yang konsisten dan stabil serta melindungi dari kerugian akibat kontaminasi atau kegagalan peralatan. Langkah-langkah kunci meliputi:
- Persiapan: Panen sel selama fase pertumbuhannya, periksa viabilitas (target ≥90%), dan siapkan dalam media pembekuan dengan cryoprotectants seperti DMSO atau gliserol.
- Pembekuan: Gunakan laju pendinginan yang terkontrol (-1°C hingga -3°C per menit) untuk mencegah kerusakan kristal es. Simpan sel dalam uap nitrogen cair (-135°C hingga -190°C) untuk pelestarian jangka panjang.
- Pencairan: Cepat mencairkan sel dalam bak air 37°C untuk meminimalkan toksisitas cryoprotectant, kemudian pindahkan ke media pertumbuhan untuk pemulihan.
- Kontrol Kualitas: Label vial dengan akurat, pantau kondisi penyimpanan, dan uji viabilitas setelah pencairan untuk memastikan keberhasilan preservasi.
Protokol Kriopreservasi Lengkap untuk Garis Sel: Proses 4 Langkah dari Persiapan hingga Penyimpanan
Mempersiapkan Sel untuk Kriopreservasi
Pemanenan Sel dan Pemeriksaan Viabilitas
Untuk memastikan pemulihan terbaik setelah pencairan, panen sel selama fase pertumbuhan logaritmik (log) mereka. Untuk garis sel yang melekat, ini biasanya terjadi ketika mereka mencapai 80–90% konfluensi [2][3][6].
Periksa viabilitas sel menggunakan metode eksklusi Trypan Blue. Campurkan bagian yang sama (1:1) dari 0,4% Trypan Blue dengan suspensi sel, kemudian hitung sel menggunakan hemocytometer.Sel yang viabel akan mengecualikan pewarna dan muncul cerah di bawah mikroskop, sementara sel yang tidak viabel akan berwarna biru [4]. Idealnya, targetkan viabilitas setidaknya 90% untuk tingkat pemulihan terbaik, meskipun beberapa protokol mungkin menerima minimum 75% [1][2][3][5].
Sebelum panen, gunakan mikroskop untuk memeriksa kontaminasi bakteri atau jamur. Sel suspensi yang sehat harus muncul cerah, bulat, dan refraktil di bawah mikroskop kontras fase terbalik [2][3].
Setelah sel memenuhi standar viabilitas yang diperlukan, lanjutkan ke langkah pra-pembekuan.
Persiapan Pra-Pembekuan
Untuk sel yang melekat, gunakan metode disosiasi yang lembut, seperti tripsin atau TrypLE Express, dan batasi waktu inkubasi untuk menghindari kerusakan pada membran sel [5]. Siapkan sel pada konsentrasi 1 × 10⁶ hingga 1 × 10⁷ sel/mL, tergantung pada garis sel [1][6]. Saat membagi, pastikan suspensi sel sering dicampur untuk menjaga distribusi yang merata di seluruh cryovial [5].
Jaga media pembekuan tetap dingin antara 2°C dan 8°C selama resuspensi untuk mengurangi toksisitas cryoprotectant sebelum proses pembekuan dimulai [5]. Setelah sel terlarut dalam media pembekuan, segera lanjutkan ke protokol pembekuan [1].Selalu cryopreserve sel pada nomor passage terendah yang mungkin untuk mengurangi risiko drift genetik atau perubahan morfologi [5][7].
Pemilihan Cryoprotectants dan Media Pembekuan
Opsi Cryoprotectant dan Fungsinya
Dimetil sulfoxida (DMSO) banyak digunakan sebagai cryoprotectant, biasanya pada konsentrasi 10% [2]. Ini bekerja dengan menembus membran sel dan mengurangi pembentukan es selama pembekuan. Namun, DMSO dapat beracun bagi sel pada suhu kamar, sehingga pencairan yang cepat sangat penting untuk meminimalkan paparan dan dengan cepat mengencerkan [1].
Gliserol berfungsi sebagai alternatif yang berguna untuk garis sel yang sensitif terhadap DMSO, umumnya digunakan dalam konsentrasi berkisar antara 5% hingga 15% [8]. Ini sangat efektif untuk jenis sel di mana DMSO mungkin menyebabkan diferensiasi yang tidak diinginkan [3], dan cenderung memiliki toksisitas yang lebih rendah dibandingkan DMSO.
Dalam aplikasi daging yang dibudidayakan, protokol pembekuan tradisional sering menggunakan campuran 90% Serum Janin Sapi (FBS) dan 10% DMSO [1]. Namun, ketergantungan pada komponen yang berasal dari hewan membatasi metode ini dalam hal skala dan persetujuan regulasi [9]. Untuk mengatasi masalah ini, media yang didefinisikan secara kimia - seperti Synth-a-Freeze atau Recovery Cell Culture Medium - menyediakan alternatif bebas komponen hewan. Media ini mempertahankan viabilitas sel pasca-thaw yang tinggi sambil mengatasi tantangan yang terkait dengan komponen asal hewan [9].
Perbandingan Media Pembekuan
Berikut adalah rincian keuntungan dan keterbatasan berbagai media pembekuan yang digunakan dalam produksi daging yang dibudidayakan:
| Media | Kelebihan | Kekurangan | Kesesuaian Daging Budidaya |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO dalam FBS-DMEM | Protokol yang telah ditetapkan [1] | Mengandung komponen yang berasal dari hewan; variabilitas batch [9] | Skalabilitas terbatas |
| Synth-a-Freeze | Didefinisikan secara kimia; kualitas konsisten; bebas dari komponen hewan [9] | Biaya awal yang lebih tinggi [9] | Ya |
| Media Kultur Sel Pemulihan | Mudah digunakan; dirancang untuk pemulihan cepat [9] | Mungkin perlu optimasi untuk garis sel tertentu | Ya |
| 10% Gliserol dalam FBS | Alternatif untuk sel yang sensitif terhadap DMSO [1] | Bergantung pada serum asal hewan [9] | Skalabilitas terbatas |
Pada Februari 2023, peneliti di Universitas Kedokteran Wanita Tokyo, yang dipimpin oleh Hironobu Takahashi, menunjukkan pentingnya memilih media pembekuan yang tepat.Menggunakan opsi komersial seperti CELLBANKER 1 dan 2, mereka berhasil melakukan kriopreservasi sel myogenik bovine primer pada –80°C selama hingga satu tahun. Yang luar biasa, sel-sel ini mempertahankan kemampuannya untuk berkembang biak dan berdiferensiasi menjadi jaringan otot kontraktil dengan struktur sarkomer yang utuh setelah dicairkan [10].
Untuk produksi daging yang dibudidayakan, media yang didefinisikan secara kimia dan sesuai GMP semakin disukai. Seperti yang disoroti oleh STEMCELL Technologies:
Dalam bidang yang sangat diatur seperti terapi sel dan gen, disarankan untuk menggunakan media kriopreservasi yang diproduksi GMP dan sepenuhnya terdefinisi untuk memastikan bahwa produk diproduksi dan dikendalikan secara konsisten sesuai dengan standar kualitas [9].
Platform seperti
Prosedur Krio-preservasi dan Laju Pendinginan
Protokol Pembekuan Langkah-demi-Langkah
Kunci keberhasilan krio-preservasi terletak pada pemeliharaan laju pendinginan yang stabil sebesar -1°C hingga -3°C per menit[2]. Proses bertahap ini memungkinkan air meninggalkan sel secara perlahan, mencegah pembentukan kristal es intraseluler yang merusak yang dapat merobek membran sel[1].
Mulailah dengan memutar sel pada 150 x g selama 5 menit[3]. Setelah diputar, suspensikan kembali pelet sel dalam media pembekuan dingin yang mengandung 10% DMSO pada konsentrasi 2–4×10⁶ sel/mL[3].Untuk mengurangi paparan DMSO, bergeraklah cepat ke langkah berikutnya - pembekuan.
Distribusikan suspensi sel ke dalam vial kriogenik yang telah diberi label sebelumnya. Setiap vial harus jelas menunjukkan detail penting seperti nama garis sel, nomor passage, nomor lot, konsentrasi sel, dan tanggal pembekuan[3]. Dengan vial yang telah disiapkan, saatnya untuk memilih dan menggunakan peralatan pendingin yang sesuai.
Peralatan dan Teknik Pendinginan
Tempatkan vial segera ke dalam perangkat pendingin dengan laju terkontrol. Kontainer pembekuan pasif, seperti Nalgene "Mr Frosty" (yang menggunakan isopropanol) atau Corning "CoolCell", adalah pilihan yang populer. Alat ini dapat mencapai laju pendinginan sekitar 1°C per menit ketika ditempatkan di dalam freezer -80°C[2].
Untuk operasi skala besar di mana konsistensi sangat penting, freezer yang dapat diprogram dengan kontrol laju adalah pilihan terbaik. Seperti yang dinyatakan oleh Sigma-Aldrich:
ECACC secara rutin menggunakan freezer yang dapat diprogram dengan kontrol laju. Ini adalah cara yang paling dapat diandalkan dan dapat direproduksi untuk membekukan sel[3].
Setelah sekitar 24 jam pada -80°C, pindahkan vial ke fase uap nitrogen cair, di mana suhu berkisar antara -135°C dan -190°C, untuk penyimpanan jangka panjang[4]. Hindari menyimpan sel pada -80°C lebih dari seminggu, karena ini dapat mengompromikan viabilitas mereka. Suhu di bawah -135°C sangat penting untuk pelestarian tanpa batas[2]. Menggunakan fase uap alih-alih fase cair mengurangi risiko kontaminasi silang sambil mempertahankan suhu yang cukup rendah.
Protokol Pencairan dan Pemulihan
Proses Pencairan
Pencairan sel dengan cepat sangat penting untuk membatasi paparan cryoprotectant yang beracun dan mencegah kristal es menyebabkan kerusakan. Pastikan untuk mengenakan pelindung wajah penuh dan sarung tangan terisolasi untuk keselamatan. Mulailah dengan mengeluarkan cryovial dari nitrogen cair dan sedikit melonggarkan tutupnya untuk melepaskan tekanan yang terakumulasi. Kemudian, kencangkan kembali tutupnya.
Tempatkan vial dalam bak air 37°C, pastikan tutupnya tetap di atas garis air. Biarkan mencair selama 1–2 menit, atau sampai hanya tersisa beberapa kristal es. Setelah mencair, lap bagian luar vial dengan alkohol 70% untuk menjaga sterilitas.
Transfer isi vial ke dalam tabung yang berisi 5–10 mL media pertumbuhan yang telah dipanaskan sebelumnya. Tambahkan media secara perlahan untuk membantu mengurangi kejutan osmotik. Jika Anda bekerja dengan garis sel suspensi, sentrifugasi suspensi sel segera pada 300 × g selama 5 menit pada 4°C.Langkah ini membantu memadatkan sel dan menghilangkan cryoprotectant. Setelah sentrifugasi, resuspensikan sel dalam media segar. Untuk sel yang melekat, sentrifugasi biasanya tidak diperlukan. Sebagai gantinya, langsung tanam sel ke dalam wadah kultur yang sesuai dan hilangkan DMSO yang tersisa selama pergantian media pertama, biasanya setelah 24 jam.
Penilaian Pasca-Pencairan
Segera setelah pencairan, periksa viabilitas sel untuk memastikan pemulihan berhasil. Gunakan metode eksklusi Trypan Blue untuk penilaian ini. Idealnya, viabilitas sel harus melebihi 90% [11], tetapi minimum 75% dapat diterima. Setelah 24 jam, periksa sel di bawah mikroskop kontras fase untuk mengonfirmasi adhesi, mengevaluasi kepadatan sel, dan memeriksa tanda-tanda kontaminasi.
Terus pantau sel melalui passage 1–3 untuk memastikan proliferasi normal dan bahwa mereka mempertahankan karakteristik yang diharapkan.Untuk garis sel yang pulih lebih lambat, Anda dapat meningkatkan kelangsungan hidup dengan meningkatkan konsentrasi serum bovine janin awal menjadi sekitar 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Penyimpanan dan Viabilitas Jangka Panjang
Kondisi dan Durasi Penyimpanan
Untuk mempertahankan viabilitas garis sel dalam jangka panjang, sangat penting untuk menyimpannya pada suhu di bawah -135°C [7][2]. Ini memastikan mereka tetap terjaga tanpa batas waktu.Metode yang disukai untuk menyimpan garis sel daging yang dibudidayakan adalah nitrogen cair fase uap. Teknik ini menjaga suhu antara -135°C dan -190°C, menjadikannya ideal untuk pelestarian jangka panjang sambil menawarkan keamanan yang lebih baik dibandingkan penyimpanan fase cair.
Jika Anda perlu menyimpan sel pada -80°C, batasi ini pada periode 24 jam hingga satu minggu. Di luar ini, viabilitas sel dapat menurun.Untuk penyimpanan sementara pada suhu ini, segera pindahkan sel ke penyimpanan nitrogen cair sesegera mungkin.
Gunakan vial kriogenik steril standar (1–2 mL) dengan ulir internal dan O-ring untuk penyimpanan yang aman [4][5]. Selalu tempatkan vial kriogenik yang tersegel di fase gas daripada fase cair nitrogen untuk mengurangi risiko ledakan vial selama pencairan [5]. Selain itu, pastikan wadah nitrogen cair dalam jumlah besar tetap setidaknya setengah penuh untuk menjaga buffer keselamatan.
Terakhir, langkah-langkah kontrol kualitas yang ketat sangat penting untuk memastikan viabilitas jangka panjang sel.
Pemeriksaan Kontrol Kualitas
Untuk memastikan keandalan garis sel yang disimpan, ikuti protokol ketat untuk kontrol kualitas. Mulailah dengan memberi label setiap vial dengan label tahan nitrogen cair secara akurat.Sertakan detail penting seperti identitas garis sel, nomor lot, nomor passage, dan tanggal pembekuan. Pertahankan basis data elektronik untuk mencatat lokasi tepat setiap vial, yang mengurangi waktu wadah penyimpanan perlu tetap terbuka [7][2].
Sebelum mengkomit seluruh batch untuk penyimpanan jangka panjang, uji viabilitas satu vial setelah penyimpanan fase gas jangka pendek. Langkah ini membantu mengonfirmasi bahwa proses pembekuan berhasil dan mengidentifikasi masalah potensial [4][7][2]. Untuk stok sel yang sangat berharga, bijaksana untuk menyimpan duplikat di lokasi sekunder untuk melindungi terhadap kegagalan peralatan atau bencana lokal [7][2].
Lengkapi semua wadah penyimpanan dengan sistem pemantauan suhu dan alarm untuk mendeteksi tingkat nitrogen cair yang rendah [7]. Selain itu, pasang alarm oksigen di area penyimpanan, yang diatur untuk berbunyi pada 18% oksigen (v/v), untuk meminimalkan risiko asfiksia bagi personel yang bekerja dengan nitrogen cair [7][2].
Protokol video kriopreservasi garis sel mamalia
Kesimpulan dan Poin Penting
Berikut adalah ringkasan cepat tentang langkah-langkah penting dan rekomendasi untuk kriopreservasi yang efektif dalam produksi daging yang dibudidayakan:
- Pemanenan Sel: Kumpulkan sel selama fase pertumbuhan logaritmik mereka, memastikan viabilitas melebihi 90%. Gunakan 10% DMSO sebagai krioprotektan, meskipun gliserol dapat menjadi alternatif untuk garis sel yang lebih halus [11][1].
- Pendinginan dan Penyimpanan: Pertahankan laju pendinginan yang terkontrol dan segera pindahkan vial ke penyimpanan nitrogen cair fase uap untuk menjaga integritas sel [11]
Sebuah studi oleh Roka Kakehi et al. menyoroti pentingnya presisi dalam kriopreservasi [10]:
"Memastikan sumber sel yang dapat diandalkan dan konsisten dengan menggunakan kriopreservasi akan memungkinkan kita untuk meningkatkan pasokan stabil sel-sel menjanjikan untuk produksi daging yang dibudidayakan." - Roka Kakehi et al., Universitas Kedokteran Perempuan Tokyo
- Proses Pencairan: Cairkan sel dalam bak air 37°C selama sekitar dua menit, berhenti ketika 80% es telah mencair. Ini mengurangi toksisitas DMSO dan meningkatkan pemulihan sel [1]. Lanjutkan dengan pemeriksaan viabilitas pasca-pencairan untuk memastikan keberhasilan dan menyempurnakan prosedur di masa depan.
Metode ini bekerja sama dengan praktik kontrol kualitas yang ketat. Selalu beri label vial dengan akurat, jaga catatan tetap terorganisir, dan lakukan pemeriksaan menyeluruh sebelum penyimpanan jangka panjang [11]. Untuk kebutuhan kriopreservasi khusus, platform seperti
FAQ
Apa keuntungan menggunakan media yang didefinisikan secara kimia untuk kriopreservasi garis sel dalam produksi daging yang dibudidayakan?
Media yang didefinisikan secara kimia membawa banyak manfaat dalam hal kriopreservasi garis sel untuk produksi daging yang dibudidayakan. Dengan menghilangkan komponen yang tidak terdefinisi, seperti serum yang berasal dari hewan, mereka memastikan hasil yang konsisten dan dapat diprediksi - faktor penting untuk menjaga keandalan jangka panjang garis sel.
Keuntungan utama lainnya adalah risiko kontaminasi dan variabilitas yang berkurang. Ini tidak hanya mendukung standar kualitas dan keselamatan yang lebih tinggi tetapi juga sangat sesuai dengan presisi dan skala yang diperlukan untuk memenuhi tuntutan regulasi dan harapan konsumen di industri daging yang dibudidayakan.
Bagaimana pilihan krioprotektan mempengaruhi kelangsungan hidup sel selama pembekuan dan pencairan?
Pilihan krioprotektan adalah faktor kunci dalam menjaga kesehatan sel selama pembekuan dan pencairan. Dua opsi yang banyak digunakan adalah dimetil sulfoxida (DMSO) dan gliserol, masing-masing dengan karakteristik yang berbeda. DMSO dikenal karena kemampuannya untuk menembus sel dengan cepat dan memberikan perlindungan yang kuat. Namun, ada caveat: pada konsentrasi tinggi atau dengan paparan yang berkepanjangan, dapat menjadi toksik, yang berpotensi menurunkan viabilitas sel.
Gliserol, di sisi lain, kurang toksik dan dapat diterapkan langsung.Kekurangan terletak pada laju penetrasi sel yang lebih lambat, yang dapat mengakibatkan perlindungan yang kurang segera dibandingkan dengan DMSO.
Mencapai keseimbangan yang tepat sangat penting. Menyesuaikan konsentrasi dan waktu paparan cryoprotectant dengan benar membantu melindungi sel sambil meminimalkan risiko toksisitas. Selain itu, mematuhi praktik terbaik untuk laju pendinginan dan kondisi penyimpanan sangat penting untuk memastikan tingkat pemulihan yang setinggi mungkin setelah pencairan.
Mengapa penting untuk mengontrol laju pendinginan selama kriopreservasi?
Mempertahankan laju pendinginan yang stabil, biasanya antara –1°C dan –3°C per menit, adalah kunci untuk menjaga sel tetap hidup. Pendinginan secara bertahap memungkinkan sel untuk mengering pada kecepatan yang terkontrol, mengurangi kemungkinan terbentuknya kristal es yang berbahaya, yang dapat merobek atau merusak membran sel.
Pendekatan yang terukur ini melindungi struktur sel, meningkatkan kelangsungan hidup dan fungsionalitas mereka setelah dicairkan.Mengikuti protokol pendinginan yang tepat sangat penting untuk memastikan penyimpanan jangka panjang dan pemulihan garis sel yang berhasil.
