培養肉の生産において、正確なpHレベルの維持は非常に重要です。哺乳類の細胞は狭いpH範囲（7.1–7.4）で最もよく育ちますが、代謝性酸性化、CO₂の蓄積、混合の課題により、特に大規模なバイオリアクターではpH制御が複雑になります。効果的な戦略には以下が含まれます:
- ガススパージング: 浸透圧を上げたり局所的なpHスパイクを引き起こすことなく、余分なCO₂を除去します。
- 高度なセンサー: ポテンショメトリックセンサーはステンレス鋼システムに対して高い精度を提供し、光学センサーは使い捨てバイオリアクターで効果的に機能します。
- バッファーの最適化: HEPESのようなバッファーを追加することで安定性が向上しますが、過剰な乳酸生成を避けるために慎重なバランスが必要です。
- 自動化システム: フィードバックループを使用したリアルタイム調整により、一貫したpHレベルを確保します。
これらのアプローチは、乳酸の蓄積やせん断応力といった課題を克服し、細胞の健康と製品の収量を向上させます。
バイオプロセスにおけるpH測定の理解
pH管理における主要な課題
このセクションでは、以前に議論された課題に基づいて、pHの不安定性に寄与する主な要因を掘り下げます。
代謝性酸性化と乳酸の蓄積
乳酸は、培養肉のバイオプロセスにおける主要な障害です。細胞が解糖を通じてグルコースを代謝すると、乳酸と水素イオンを1:1の比率で生成します。このプロセスは、培地の酸性化の主な要因である乳酸を生み出す大きな酸負荷を引き起こします[1]。
標準的な培養培地の緩衝能力 - 通常1.1から1.6 mM/pH単位[1] - は、急速な細胞成長の期間中にはしばしば不十分です。細胞が増殖するにつれて、代謝廃棄物の排出が増加し、培地の安定したpHを維持する能力を圧倒します。この段階でのpHの急激な低下は、解糖系の乳酸生成に直接起因し、培地のpHを不安定にする乳酸の重要な役割を強調しています。 問題はそれだけではありません。CO2の蓄積が複雑さをさらに増します。 CO2の蓄積とpHの変動 細胞呼吸は培地にCO2を導入し、そこで炭酸を形成するために溶解します。重要な問題は、溶解したCO2の分圧（pCO2）であり、これがCO2が細胞から逃げることができるかどうかに影響を与えます。培地中のpCO2レベルが高すぎると、CO2が細胞内に閉じ込められ、細胞内pHが危険なほど低下し、最終的には細胞死に至ります。
"pCO2が高すぎると、CO2が細胞から出られなくなり、細胞内のpHが下がり、細胞が死んでしまいます。" - Alicat Scientific [2]
この問題は、大規模なバイオリアクターでより顕著になります。これらのシステムは表面積対体積比が低く、小型の容器と比較してCO2の脱ガス効率が低下します [3]。培地をCO2インキュベーターに移すといった日常的な操作でも、pHの変動を引き起こす可能性があります。例えば、小さな培地の量はほぼ即座にアルカリ化し始め、時定数は2〜3時間です [1]。
化学的な課題に加えて、物理的なプロセスもpHの不安定性に大きな役割を果たします。
混合とせん断応力がpH安定性に与える影響
塩基を加えてpHを調整することは、それ自体にリスクを伴います。炭酸水素ナトリウムや類似の塩基がバイオリアクターに注入されると、混合が不十分な場合、局所的に高いpHのゾーンができ、近くの細胞に害を及ぼすことがあります[2] [3]。一方で、塩基を均一に分散させるために必要な激しい攪拌は、剪断応力や泡の形成を引き起こし、どちらも壊れやすい哺乳類細胞に損傷を与えます[2] [3]。
制御された実験では、pHを安定させるための塩基の添加が、浸透圧の増加により細胞の生存率を低下させることがよくあります[3] 。これにより、混合が不十分だとpHのホットスポットが発生し、過剰な混合はホットスポットを防ぎますが、機械的ストレスを増加させるという難しいバランスが生じます。スケールアップの際には、混合時間が長くなるため、細胞の健康を損なうことなく効果的なpH制御を維持することがさらに困難になります。
pHモニタリングと制御のための技術
哺乳類細胞培養において、pHを7.1–7.4の狭い範囲内に維持することは重要であり、正確で信頼性の高いモニタリングツールが求められます [2]。ポテンショメトリックセンサーは、自由水素イオンを測定する電極として機能し、バイオリアクターでの連続pHモニタリングのゴールドスタンダードです[1]。これらのセンサーはリアルタイムデータを提供し、自動化システムが必要なpHレベルを維持するために即座に調整を行うことを可能にします。その高い精度は、大規模な運用において不可欠です。これに加えて、光学指示薬はpHを測定するためのもう一つの効果的な方法を提供します。
光学指示薬は、分光分析に依存して定量的なpH測定を提供します。フェノールレッドは視覚的指標としてよく使用されますが、より正確な読み取りは、560 nmと430 nmの2つの特定の波長での吸光度の比率分析によって達成されます[1]。この方法は、培地の体積や染料の濃度などの要因を補正し、一貫した正確な結果を保証します。
「自由なH+イオンの濃度は直感的に予測することはできませんが、幸運にも簡単に測定できます（e.g. 電極や指示薬を使用して）。」 - ジョアンナ・ミヒル他、オックスフォード大学[1]
現代のpH制御システムは、これらの測定を自動フィードバックループに統合し、pHレベルを動的に調整することで、監視を超えた機能を提供します。
自動フィードバックシステムはセンサーデータを活用してリアルタイムで調整を行い、手動介入の必要性を排除します。これらのシステムは、塩基を追加したり、ガススパージング技術を使用してpHを調整することができます[2]。大規模なバイオリアクターでは、ガススパージングが特に効果的です。質量流量制御器を使用することで、CO2レベルを迅速かつ均一に調整でき、均一なpH調整を確保します[2]。対照的に、ベースポンピングは小規模なシステムには効果的ですが、局所的なpHの不均衡を生じさせ、浸透圧を増加させる可能性があるため、大型容器には実用的ではありません[2]。しかし、ガススパージングは、細胞に害を及ぼす可能性のある剪断応力を避けるために、スパージャーの設計に細心の注意を払う必要があります[2]。培養肉の生産に携わる方々にとって、高度なガス制御システムへの投資は、細胞の健康と収量の向上につながり、価値のある支出となります。
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大規模なpH管理のための戦略
培養肉バイオリアクターにおけるポテンショメトリックセンサーと光学センサー
ポテンショメトリックセンサーと光学センサーの比較
培養肉の生産が拡大するにつれて、適切なセンサー技術の選択がますます重要になります。ポテンショメトリックセンサーは、その精度と迅速な応答性からステンレス鋼のバイオリアクターに最適な選択肢です。しかし、定期的な校正の必要性や長時間のプロセス中のドリフトに対する感受性などの課題があります。Jacob Crowe、& テクニカルサポートマネージャー、
"時間が経つにつれて、pH測定値がドリフトし、プロセスの安定性とパフォーマンスに影響を与える可能性があります。
pHドリフトを監視し、緩和することは、代謝および全体的なプロセスに対する有害な影響を防ぐために重要です
[8].
一方、光学センサーは、特にシングルユースバイオリアクターシステムにおいて実用的な選択肢として浮上しています。これらのセンサーは使い捨てバッグに事前に取り付けることができ、汚染リスクを削減し、サイクル間の滅菌の必要性を排除します[7]。マイクロ流体システムでは、光学センサーが優れた結果を示し、262,500 cells/mLの密度で95.45%の細胞生存率を達成しました [9] 。
| 特徴 | ポテンショメトリックセンサー | 光学センサー |
|---|---|---|
| 精度 | 高いが、ドリフトしやすい | 高い; リアルタイムモニタリングに最適 |
| メンテナンス | 頻繁なキャリブレーションが必要 | 最小限; 多くは使い捨て |
| スケーラビリティ | ステンレス鋼のセットアップに標準 | 使い捨ておよびマイクロフルイディクスに最適 |
| 応答時間 | 速いが、電極の安定性に制限される | 瞬時のリアルタイムフィードバック |
| コストの影響 | 労働およびメンテナンスコストが高い | 労働コストが低い; 使い捨てに統合 |
センサーの選択は主にリアクターの種類に依存します。ステンレス鋼のバイオリアクターは、ドリフトを管理するための対策を備えたポテンショメトリックセンサーから利益を得る可能性があり、シングルユースプラットフォームは統合された光学センサーの容易さを活用できます。これらの決定は、培地の最適化中にpHの安定性がどのように維持されるかに直接影響します。 培地の最適化とバッファーの改善 適切なセンサーが設置されたら、スケールアップ中のpH制御を維持するために培養培地のバッファリングシステムを安定化させることが重要です。哺乳類細胞はCO₂/HCO₃⁻バッファーシステム（37°CでpKa 6.15）に依存していますが、そのバッファリング能力はしばしば不十分です。例えば、標準的なDMEMに10% FBSを加えた場合、通常1.1から1.6 mMのバッファリングしか提供しません。 これに対処するために、HEPESのような非揮発性バッファー（NVB）を追加します。3 at 37°C) can significantly strengthen buffering without causing problematic osmolality shifts [1]. 推奨される方法は、まず培地を目標pHに滴定し、その後インキュベーターのpCO₂に合わせた濃度でNaHCO₃を添加することです。このアプローチは、新しい培地がCO₂にさらされたときの初期pHドリフトを減少させ、NVBsではこのプロセスに最大2時間かかることがあります[1].
しかし、より強力な緩衝システムは、解糖の増加を引き起こし、乳酸の生成を増加させる可能性があります。いくつかの細胞株では、グルコースの最大90%が直接乳酸に変換され[1]、改善された緩衝は時にこの効果を増幅し、より多くの乳酸の蓄積をもたらすことがあります[10].
スパージングと攪拌技術
ガススパージングは、大規模な培養肉生産におけるpH管理の実用的な方法を提供します。Alicat Scientificのメモ:
「スパージャーからのガスバブルは、ベースよりも均一に混合され、分散され、はるかに少ない攪拌で済みます」[2].
ガスバブルを均一に分配することで、スパージングは化学的なベース添加よりも一貫したアプローチを提供します。例えば、2018年の研究では、スパージレートを一定に保ちながらヘッドスペースのエアレーションを増やすことで、30 Lから250 Lへのスケールアップ中にタイトルが安定していることが示されました [2].
直径1–4 mmのバブルを生成するマクロスパージャーは、培養から余分なCO₂を除去するのに特に効果的です。これにより、化学的なベースを使用せずに自然にpHが上昇し、浸透圧を高める可能性のある化学的ベースの必要性を回避します[2] [5]。新しい「ガスのみ」のpH制御戦略は、自動化されたエアスパージングフィードバックループを使用します。pHが低下すると、CO₂をより多く除去するために気流が増加します。この方法は、ambr®250バイオリアクターから200 L容器にスケールアップされ、フィードバッチ培養全体で正確なpHレベルを維持しています[6].
効率的なガス移動と最小限のせん断応力のバランスを取ることは、スケールアップ時の重要な課題です。ガス駆動の循環を使用するエアリフトバイオリアクターは、せん断応力を軽減した穏やかな混合オプションを提供します。計算流体力学（CFD）シミュレーションは、インペラーブレード近くの高せん断ゾーンを特定するのにも役立ち、スケールアップ前にバイオリアクターデザインを最適化することができます[4]。これらのアプローチを
pH制御機器の調達 Cellbase
なぜ Cellbase を選ぶのか?
培養肉のバイオプロセスでは、正確なpH制御が不可欠であり、適切な機器の調達が重要です。一般的なラボ供給プラットフォームは、この分野で必要とされる厳しいpH範囲に関する専門知識を欠いていることが多いです。
pH制御技術の発見 Cellbase
スケールアップのために、プラットフォームは質量流量コントローラーと特殊なスパージャーへのアクセスを提供し、効率的なガスベースのpH管理に不可欠です。Alicat Scientificが強調するように:
"pHを健康的な生物学的レベルに保つことは、上流バイオプロセシングにおいて製品収量を増加させるための最も強力なツールである可能性があります" [2].
さらに、
調達スペシャリストは、オートクレーブ可能なCO₂センサーや使い捨てpHプローブを含むCO₂ストリッピング用の機器を調達することもできます。これらのツールは、正確なpH制御を維持するためのスケーラブルな戦略をサポートし、大規模生産に高度なpH管理を統合しやすくします [11]。ターゲットを絞ったソリューションを提供することで、
結論: 培養肉のバイオプロセスにおけるpH制御のベストプラクティス
培養肉生産において、哺乳類細胞の生存にはpH範囲7.1から7.4を維持することが重要です[2]。この範囲内でpHを維持することは、上流バイオプロセス中の製品収率を向上させる上で重要な役割を果たします。
pH制御の課題に対処するために、いくつかの効果的な方法が登場しています。注目すべき方法の一つは、スケールアップ時に塩基添加の代わりにガススパージングを使用することです。ガススパージングは、最小限の攪拌で均等に分布させることにより、余分なCO₂を効果的に除去し、pHの不一致や浸透圧の変動などの問題を回避するのに役立ちます[2] 。Aryogen Pharmedによる2021年の研究では、この方法が250リットルのスケールで成功し、最終製品の収率が51%増加したことが示されました[3]。
もう一つの重要な方法は、直接pHモニタリングです。これは、pCO₂測定にのみ依存するよりも、培養の健康状態をより包括的に理解することができます。これは特に重要です。なぜなら、溶解したCO₂レベルは乳酸の蓄積を考慮しておらず、特定の細胞株ではグルコース代謝の最大90%を占めることがあるからです[1] 。代謝活動がピークに達する指数成長期には、pHを直接監視することがさらに重要になります
。 HEPESのような非揮発性バッファーの場合、バッファー平衡を考慮することが不可欠です。HEPESバッファーは安定するまでに最大2時間かかることがあり、重炭酸塩とCO₂で慎重に滴定する必要があります[1]。しかし、バッファー容量を増やすと、意図した安定化効果に反して乳酸の生成が増加する可能性があります[1]。センサーを用いた監視やガススパージング技術と組み合わせることで、これらのバッファーの考慮事項は安定した最適なプロセス条件を維持するのに役立ちます。よくある質問
培養肉の生産において、ガススパージングはどのようにpH制御をサポートしますか？
ガススパージングは、培養肉の生産中にpHレベルをバランスよく保つために重要な役割を果たします。細胞が成長する際、呼吸の副産物として二酸化炭素（CO₂）を放出します。このCO₂は培養培地のpHを低下させ、細胞の健康に害を及ぼす可能性があります。バイオリアクターに空気、酸素、または不活性ガスなどのガスを導入することで、スパージングは過剰なCO₂を除去するのに役立ちます。これにより、培地が過度に酸性になるのを防ぎ、pHを安定に保ちます。
培養培地を理想的なpH範囲である約7.1から7.4の間に維持することは、健康な細胞の成長と生産性にとって重要です。バッファリングシステムやpHセンサーを使用したリアルタイムモニタリングと組み合わせることで、ガススパージングはプロセス効率を向上させるだけでなく、細胞の生存率も向上させます。これは、培養肉のバイオプロセシングの成功を確実にするための重要な要素です。
培養肉生産において、pHモニタリングのために光学センサーよりも電位差センサーが優れている理由は何ですか？
電位差センサーは、培養肉生産において重要な役割を果たしています。 リアルタイムのpH測定を高精度で提供できるためです。適切なpHレベルを維持することは、細胞成長に適した環境を作るために不可欠であり、これらのセンサーはそのために必要なデータを提供するのに優れています。さらに、手頃な価格で、大規模なバイオリアクターにシームレスに統合できるため、産業環境での連続モニタリングに理想的です。
さらに、これらのセンサーは複雑な培養媒体の課題に対応するように設計されており、厳しい条件下でも信頼性の高い性能を発揮します。ただし、精度を維持するためには定期的な校正が必要です。その精度、信頼性、コスト効率のブレンドにより、ポテンショメトリックセンサーは培養肉のバイオプロセシングにおける効果的なpH制御のための選択肢となっています。 なぜ乳酸の蓄積が安定したpHレベルの維持を困難にするのですか？ 乳酸の蓄積は、培養環境の酸性度を高めてpHを低下させることでpH制御を複雑にします。これにより、ほとんどの細胞が成長し正常に機能するために慎重に制御されたpH範囲を必要とするため、細胞の生存率と生産性が損なわれる可能性があります。 乳酸レベルの管理は、健康な細胞の成長をサポートし、製品の品質を維持するために培養肉のバイオプロセシングにおいて重要です。リアルタイムpHモニタリング、pHバッファーの使用、または給餌プロトコルの調整などのアプローチは、環境を安定させ、pHの急激な変動を避けるのに役立ちます。
