凍結保存は、細胞の生存能力を維持するために、超低温で生きた細胞を凍結し保存するプロセスです。この方法は、培養肉の生産において重要であり、一貫した安定した細胞株を確保し、汚染や機器の故障による損失から保護します。主なステップは以下の通りです：
- 準備：成長段階で細胞を収穫し、生存能力を確認します（目標は≥90%）、そしてDMSOやグリセロールなどの凍結保護剤を含む凍結媒体で準備します。
- 凍結：氷結晶の損傷を防ぐために、制御された冷却速度（-1°Cから-3°C毎分）を使用します。細胞は液体窒素蒸気（-135°Cから-190°C）で長期保存します。
- 解凍：37°Cの水浴で細胞を迅速に解凍し、凍結保護剤の毒性を最小限に抑えた後、回復のために成長媒体に移します。
- 品質管理: 瓶にラベルを正確に貼り、保管条件を監視し、解凍後の生存率をテストして成功した保存を確保します。
細胞株のための完全な凍結保存プロトコル: 準備から保管までの4ステッププロセス
凍結保存のための細胞の準備
細胞の収穫と生存率チェック
解凍後の回復を最良にするために、細胞を対数（log）成長期に収穫します。接着性細胞株の場合、通常は80〜90%のコンフルエンシーに達したときです。[2][3][6].
トリパンブルー排除法を使用して細胞の生存率をチェックします。0.4%トリパンブルーと細胞懸濁液を1:1の割合で混合し、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。生存可能な細胞は染料を排除し、顕微鏡下で明るく見えますが、非生存細胞は青く染まります [4]。理想的には、最良の回収率のために90％以上の生存率を目指しますが、一部のプロトコルでは最低75％を受け入れる場合があります [1][2][3][5].
収穫前に、顕微鏡を使用して細菌または真菌の汚染を確認してください。健康な懸濁細胞は、倒立位相差顕微鏡下で明るく、丸く、屈折性があるように見えるべきです [2][3].
細胞が必要な生存基準を満たしたら、前凍結ステップに進んでください。
凍結前の準備
接着細胞の場合は、トリプシンやTrypLE Expressなどの穏やかな解離方法を使用し、細胞膜が損傷しないようにインキュベーション時間を制限してください [5]。細胞株に応じて、1 × 10⁶から1 × 10⁷細胞/mLの濃度で細胞を準備します [1][6]。アリコートする際は、細胞懸濁液が均一に分配されるように、頻繁に混合してください [5]。
凍結メディアは、凍結プロセスが始まる前に、凍結保護剤の毒性を減少させるために、再懸濁中は2°Cから8°Cの間で冷却してください [5]。細胞が凍結メディアに懸濁されたら、迅速に凍結プロトコルに移行してください [1]。細胞は、遺伝的ドリフトや形態的変化のリスクを減らすために、可能な限り低いパッセージ番号で常に凍結保存してください。[5][7].
凍結保護剤と凍結媒体の選択
凍結保護剤の選択肢とその機能
ジメチルスルホキシド (DMSO) は、一般的に10%の濃度で凍結保護剤として広く使用されています。[2]。これは、細胞膜に浸透し、凍結中の氷の形成を減少させることによって機能します。しかし、DMSOは室温で細胞に対して毒性がある可能性があるため、迅速な解凍が重要であり、曝露を最小限に抑え、すぐに希釈する必要があります。[1].
グリセロールは、一般的に5%から15%の濃度で使用され、DMSOに敏感な細胞株のための有用な代替品として機能します。[8]。それは、DMSOが望ましくない分化を引き起こす可能性のある細胞タイプに特に効果的であり、DMSOと比較して毒性が低い傾向があります。
培養肉の応用において、従来の凍結プロトコルは通常、90%の胎児牛血清（FBS）と10%のDMSOの混合物を使用します。[1]しかし、動物由来の成分に依存することは、スケーラビリティや規制承認の面でこれらの方法を制限します。[9]これらの問題に対処するために、化学的に定義されたメディア - 例えば、Synth-a-FreezeやRecovery Cell Culture Medium - は、動物成分を含まない代替手段を提供します。これらのメディアは、高い凍結後の細胞生存率を維持し、動物由来成分に関連する課題を克服します。[9]
冷凍媒体の比較
ここでは、培養肉生産に使用されるさまざまな冷凍媒体の利点と制限についての概要を示します：
| 媒体 | 利点 | 欠点 | 培養肉の適合性 |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO in FBS-DMEM | 確立されたプロトコル [1] | 動物由来成分を含む; バッチの変動性 [9] | 限られたスケーラビリティ |
| Synth-a-Freeze | 化学的に定義された; 一貫した品質; 動物成分不使用 [9] | 初期コストが高い [9] | はい |
| 回復細胞培養媒体 | 使いやすく、迅速な回復のために設計されています [9] | 特定の細胞株に最適化が必要な場合があります | はい |
| FBS中の10%グリセロール | DMSO感受性細胞の代替品 [1] | 動物由来の血清に依存しています [9] | スケーラビリティが制限されています |
2023年2月、東京女子医科大学の研究者たち、高橋宏信が率いるチームは、適切な凍結媒体を選ぶことの重要性を示しました。CELLBANKER 1および2のような商業オプションを使用して、彼らは成功裏に初代牛筋肉細胞を–80°Cで最大1年間凍結保存しました。驚くべきことに、これらの細胞は解凍後も増殖し、収縮性筋組織に分化する能力を保持し、サルコメア構造も intact でした。[10].
培養肉の生産においては、化学的に定義されたGMP準拠の培地がますます好まれています。STEMCELL Technologiesが強調するように：
細胞および遺伝子治療のような高度に規制された分野では、製品が品質基準に従って一貫して生産および管理されることを保証するために、GMP製造の完全に定義された凍結保存培地を使用することが推奨されます。[9]。
プラットフォームは、
凍結保存手順と冷却速度
ステップバイステップの凍結プロトコル
成功する凍結保存の鍵は、-1°Cから-3°Cの一定の冷却速度を維持することにあります[2]。この徐々のプロセスにより、水分が細胞からゆっくりと離れ、細胞膜を破裂させる可能性のある有害な細胞内氷結晶の形成を防ぎます[1]。
まず、細胞を150 x gで5分間遠心分離します[3]。遠心分離後、細胞ペレットを10% DMSOを含む冷凍媒体に再懸濁します。濃度は2–4×10⁶細胞/mL[3]です。DMSOの曝露を減らすために、次のステップである凍結に迅速に移動してください。
細胞懸濁液を事前にラベル付けされた凍結用バイアルに分配します。各バイアルには、細胞株名、パッセージ番号、ロット番号、細胞濃度、凍結日などの重要な詳細が明確に示されている必要があります。[3] バイアルの準備が整ったら、適切な冷却機器を選択して利用する時間です。
冷却機器と技術
バイアルをすぐに制御冷却装置に入れてください。Nalgene "Mr Frosty"（イソプロパノールを使用）やCorning "CoolCell"のような受動冷凍容器は人気の選択肢です。これらのツールは、-80°Cのフリーザーに置いた場合、約1°C毎分の冷却速度を達成できます。[2]
大規模な操作で一貫性が重要な場合、プログラム可能なレート制御フリーザーが最適な選択です。Sigma-Aldrichによると：
ECACCは定期的にプログラム可能なレート制御フリーザーを使用しています。これは細胞を凍結する最も信頼性が高く再現性のある方法です[3]。
約24時間を-80°Cで経過させた後、バイアルを液体窒素の蒸気相に移し、温度が-135°Cから-190°Cの範囲である長期保存を行います[4]。細胞を-80°Cで1週間以上保存することは避けてください。これは細胞の生存能力を損なう可能性があります。-135°C以下の温度は無期限の保存に不可欠です[2]。液体相ではなく蒸気相を使用することで、十分に低い温度を維持しながら交差汚染のリスクを減らすことができます。
解凍および回復プロトコル
解凍プロセス
細胞を迅速に解凍することは、毒性のある凍結保護剤への曝露を制限し、氷結晶による損傷を防ぐために重要です。安全のために、フルフェイスバイザーと断熱手袋を着用してください。まず、クリオバイアルを液体窒素から取り出し、蓋を少し緩めて内部の圧力を解放します。その後、蓋を再度締めます。
バイアルを37°Cの水浴に置き、蓋が水面より上にあることを確認します。1〜2分間、または氷結晶がわずかに残るまで解凍します。解凍が完了したら、バイアルの外側を70%のアルコールで拭いて無菌状態を維持します。
バイアルの内容物を、5〜10 mLの事前加温した培地が入ったチューブに移します。浸透圧ショックを軽減するために、培地をゆっくりと追加します。サスペンション細胞株を扱っている場合は、細胞懸濁液を直ちに4°Cで300 × gで5分間遠心分離します。このステップは細胞をペレット化し、クリオプロテクタントを除去します。遠心分離後、細胞を新しい培地に再懸濁します。接着細胞の場合、遠心分離は通常不要です。代わりに、細胞を適切な培養容器に直接播種し、最初のメディア交換時に残留DMSOを除去します。通常、これは24時間後に行います。
解凍後の評価
解凍直後に、細胞の生存率を確認して回復が成功したことを確認します。この評価にはトリパンブルー排除法を使用します。理想的には、細胞の生存率は90％を超えるべきですが、最低でも75％は許容されます。24時間後、位相差顕微鏡で細胞を観察し、接着を確認し、細胞密度を評価し、汚染の兆候がないかをチェックします。
正常な増殖を確保し、期待される特性を保持していることを確認するために、パッセージ1〜3を通じて細胞を引き続き監視します。細胞株がより遅く回復する場合、初期の胎牛血清濃度を約20% v/vに増加させることで生存率を改善できます。
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保存と長期的な生存能力
保存条件と期間
細胞株の生存能力を長期的に維持するためには、-135°C以下の温度で保存することが不可欠です。[7][2]。これにより、無期限に保存されることが保証されます。
培養肉細胞株の保存に推奨される方法は、蒸気相液体窒素です。この技術は、-135°Cから-190°Cの間の温度を維持し、液相保存に比べて安全性が向上しながら長期保存に理想的です。
-80°Cで細胞を保存する必要がある場合は、24時間から1週間の期間に制限してください。それを超えると、細胞の生存能力が低下する可能性があります。この温度での一時的な保管のために、できるだけ早く細胞を液体窒素保管に移してください。
安全な保管のために、内部ねじ付きおよびOリング付きの標準的な無菌凍結バイアル（1〜2 mL）を使用してください。[4][5]。凍結バイアルは、解凍中のバイアル爆発のリスクを減らすために、液体窒素の気相に常に置いてください。[5]。さらに、バルク液体窒素容器は安全バッファを維持するために、少なくとも半分は満たしておくことを確認してください。
最後に、細胞の長期的な生存能力を確保するためには、厳格な品質管理措置が重要です。
品質管理チェック
保存された細胞株の信頼性を確保するために、厳格な品質管理プロトコルに従ってください。まず、液体窒素に耐性のあるラベルで各バイアルを正確にラベル付けします。細胞株の識別、ロット番号、パッセージ番号、凍結日などの重要な詳細を含めてください。各バイアルの正確な位置を記録するために電子データベースを維持し、保存容器が開いている時間を短縮します。[7][2].
全バッチを長期保存にコミットする前に、短期ガス相保存後に1つのバイアルの生存率をテストしてください。このステップは、凍結プロセスが成功したことを確認し、潜在的な問題を特定するのに役立ちます。[4][7][2]。非常に貴重な細胞ストックの場合、機器の故障や地域の災害に対する備えとして、二次の場所に複製を保存することが賢明です。[7][2]。
すべての貯蔵容器に温度監視システムと低液体窒素レベルを検出するアラームを装備してください [7]。さらに、貯蔵エリアに酸素アラームを設置し、18%酸素（v/v）で作動するように設定して、液体窒素を扱う作業者の窒息リスクを最小限に抑えてください [7][2].
哺乳類細胞株の凍結保存ビデオプロトコル
結論と重要なポイント
培養肉生産における効果的な凍結保存のための重要なステップと推奨事項の簡単な要約は以下の通りです：
- 細胞収穫：細胞の対数成長期に収穫し、細胞の生存率が90％を超えることを確認してください。10％DMSOを凍結保護剤として使用しますが、よりデリケートな細胞株にはグリセロールが代替品として使用できます [11][1]。
- 冷却と保存: 制御された冷却速度を維持し、細胞の完全性を保護するために、バイアルを蒸気相液体窒素保存に迅速に移動させます [11]
ロカ・カケヒらの研究は、凍結保存における精度の重要性を強調しています [10]:
"凍結保存を使用することで、細胞の信頼できる一貫した供給源を確保し、培養肉生産のための有望な細胞の安定供給を増加させることができます。" - ロカ・カケヒら、東京女子医科大学
- 解凍プロセス: 37°Cの水浴で約2分間細胞を解凍し、氷の80%が溶けた時点で停止します。これによりDMSOの毒性が低減し、細胞の回復が改善されます [1]. 解凍後の生存率チェックを行い、成功を確認し、今後の手順を微調整します。
これらの方法は、厳格な品質管理慣行と連携して機能します。常にバイアルに正確にラベルを付け、整理された記録を維持し、長期保存前に徹底的なチェックを実施してください [11]。特化した凍結保存のニーズには、
よくある質問
培養肉生産における細胞株の凍結保存に化学的に定義された媒体を使用する利点は何ですか？
化学的に定義された媒体は、培養肉生産のための細胞株を凍結保存する際に多くの利点をもたらします。動物由来の血清のような未定義成分を取り除くことで、一貫性があり予測可能な結果を確保し、細胞株の長期的な信頼性を維持するための重要な要素となります。
もう一つの重要な利点は、汚染や変動のリスクが低減されることです。これは、より高い品質と安全基準をサポートするだけでなく、培養肉産業における規制の要求と消費者の期待の両方を満たすために必要な精度とスケーラビリティとも完全に一致します。
冷凍および解凍中の細胞生存に対するクリオプロテクタントの選択はどのように影響しますか？
クリオプロテクタントの選択は、冷凍および解凍中の細胞の健康を保つ上で重要な要素です。広く使用されている2つのオプションは、ジメチルスルホキシド (DMSO)とグリセロールで、それぞれ異なる特性を持っています。DMSOは、細胞に迅速に浸透し、強力な保護を提供する能力で知られています。しかし、高濃度または長時間の曝露では毒性を持つ可能性があり、細胞の生存率を低下させることがあります。
対照的に、グリセロールは毒性が低く、直接適用することができます。その欠点は、細胞浸透率が遅いため、DMSOと比較して即時の保護が少なくなる可能性があることです。
適切なバランスを達成することが重要です。凍結保護剤の濃度と曝露時間を適切に調整することで、細胞を保護しつつ、毒性のリスクを最小限に抑えることができます。さらに、冷却速度や保存条件に関するベストプラクティスを遵守することが、解凍後の回復率を最大限に高めるために不可欠です。
凍結保存中に冷却速度を制御することがなぜ重要なのですか？
通常、–1°Cから–3°C毎分の間で一定の冷却速度を維持することが、細胞の生存性を保つための鍵です。徐々に冷却することで、細胞は制御されたペースで脱水し、有害な氷結晶が形成される可能性を減少させ、細胞膜を破損させることができます。
この計画的なアプローチは、細胞の構造を保護し、解凍後の生存率と機能性を向上させます。細胞株の長期保存と回復を成功させるためには、正確な冷却プロトコルに従うことが不可欠です。
