Penyimpanan Cryo adalah proses membekukan dan menyimpan sel hidup pada suhu ultra-rendah untuk mengekalkan viabiliti mereka dari semasa ke semasa. Kaedah ini adalah kritikal untuk pengeluaran daging yang ditanam, memastikan garis sel yang konsisten dan stabil serta melindungi daripada kerugian akibat pencemaran atau kegagalan peralatan. Langkah-langkah utama termasuk:
- Persiapan: Tuai sel semasa fasa pertumbuhannya, periksa viabiliti (sasaran ≥90%), dan sediakan mereka dalam media pembekuan dengan cryoprotectants seperti DMSO atau gliserol.
- Pembekuan: Gunakan kadar penyejukan terkawal (-1°C hingga -3°C per minit) untuk mengelakkan kerosakan kristal ais. Simpan sel dalam wap nitrogen cecair (-135°C hingga -190°C) untuk pemeliharaan jangka panjang.
- Pencairan: Pencairkan sel dengan cepat dalam mandian air 37°C untuk meminimumkan toksisiti cryoprotectant, kemudian pindahkan mereka ke media pertumbuhan untuk pemulihan.
- Kawalan Kualiti: Label vial dengan tepat, pantau keadaan penyimpanan, dan uji kebolehlangsungan selepas pencairan untuk memastikan pemeliharaan yang berjaya.
Protokol Cryopreservation Lengkap untuk Garis Sel: Proses 4 Langkah dari Persiapan ke Penyimpanan
Menyiapkan Sel untuk Cryopreservation
Pengambilan Sel dan Pemeriksaan Kebolehlangsungan
Untuk memastikan pemulihan terbaik selepas pencairan, ambil sel semasa fasa pertumbuhan logaritma (log) mereka. Untuk garis sel yang melekat, ini biasanya apabila mereka mencapai 80–90% kepadatan [2][3][6].
Periksa kebolehlangsungan sel menggunakan kaedah pengecualian Trypan Blue. Campurkan bahagian yang sama (1:1) 0.4% Trypan Blue dengan suspensi sel, kemudian kira sel menggunakan hemocytometer.Sel yang viabel akan mengecualikan pewarna dan kelihatan cerah di bawah mikroskop, manakala sel yang tidak viabel akan berwarna biru [4]. Sebaiknya, sasarkan untuk viabiliti sekurang-kurangnya 90% untuk kadar pemulihan yang terbaik, walaupun beberapa protokol mungkin menerima minimum 75% [1][2][3][5].
Sebelum menuai, gunakan mikroskop untuk memeriksa pencemaran bakteria atau kulat. Sel suspensi yang sihat harus kelihatan cerah, bulat, dan refraktif di bawah mikroskop kontras fasa terbalik [2][3].
Setelah sel memenuhi standard viabiliti yang diperlukan, teruskan ke langkah pra-beku.
Persiapan Pra-Pembekuan
Untuk sel yang melekat, gunakan kaedah disosiasi yang lembut, seperti tripsin atau TrypLE Express, dan hadkan masa inkubasi untuk mengelakkan kerosakan pada membran sel [5]. Sediakan sel pada kepekatan 1 × 10⁶ hingga 1 × 10⁷ sel/mL, bergantung kepada garis sel [1][6]. Semasa membahagikan, pastikan suspensi sel dicampur dengan kerap untuk mengekalkan pengagihan yang seragam di seluruh cryovial [5].
Simpan media pembekuan dalam keadaan sejuk antara 2°C dan 8°C semasa resuspensi untuk mengurangkan toksisiti cryoprotectant sebelum proses pembekuan bermula [5]. Setelah sel disuspensikan dalam media pembekuan, segera teruskan ke protokol pembekuan [1].Sentiasa cryopreserve sel pada nombor passage terendah yang mungkin untuk mengurangkan risiko drift genetik atau perubahan morfologi [5][7].
Pemilihan Cryoprotectants dan Media Pembekuan
Opsyen Cryoprotectant dan Fungsi Mereka
Dimetil sulfoxida (DMSO) digunakan secara meluas sebagai cryoprotectant, biasanya pada kepekatan 10% [2]. Ia berfungsi dengan menembusi membran sel dan mengurangkan pembentukan ais semasa pembekuan. Walau bagaimanapun, DMSO boleh menjadi toksik kepada sel pada suhu bilik, jadi pencairan yang cepat adalah penting untuk meminimumkan pendedahan dan mencairkannya dengan cepat [1].
Gliserol berfungsi sebagai alternatif berguna untuk garis sel yang sensitif kepada DMSO, biasanya digunakan dalam kepekatan antara 5% hingga 15% [8].Ia sangat berkesan untuk jenis sel di mana DMSO mungkin menyebabkan pembezaan yang tidak diingini [3], dan ia cenderung mempunyai toksisiti yang lebih rendah berbanding DMSO.
Dalam aplikasi daging yang ditanam, protokol pembekuan tradisional sering menggunakan campuran 90% Serum Bovine Fetal (FBS) dan 10% DMSO [1]. Walau bagaimanapun, kebergantungan kepada komponen yang berasal dari haiwan menghadkan kaedah ini dari segi kebolehan skala dan kelulusan peraturan [9]. Untuk menangani isu-isu ini, media yang ditakrifkan secara kimia - seperti Synth-a-Freeze atau Recovery Cell Culture Medium - menyediakan alternatif tanpa komponen haiwan. Media ini mengekalkan viabiliti sel pasca-pencairan yang tinggi sambil mengatasi cabaran yang berkaitan dengan komponen asal haiwan [9].
Perbandingan Media Pembekuan
Berikut adalah pecahan kelebihan dan kekurangan pelbagai media pembekuan yang digunakan dalam pengeluaran daging yang ditanam:
| Media | Kelebihan | Kekurangan | Kesuaian Daging yang Ditanam |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO dalam FBS-DMEM | Protokol yang telah ditetapkan [1] | Mengandungi komponen yang berasal dari haiwan; variabiliti batch [9] | Skalabiliti terhad |
| Synth-a-Freeze | Ditakrif secara kimia; kualiti yang konsisten; bebas daripada komponen haiwan [9] | Kos awal yang lebih tinggi [9] | Ya |
| Media Kultur Sel Pemulihan | Mudah digunakan; direka untuk pemulihan cepat [9] | Mungkin perlu pengoptimuman untuk garis sel tertentu | Ya |
| 10% Gliserol dalam FBS | Alternatif untuk sel sensitif DMSO [1] | Bergantung kepada serum asal haiwan [9] | Skalabiliti terhad |
Pada Februari 2023, penyelidik di Universiti Perubatan Wanita Tokyo, yang diketuai oleh Hironobu Takahashi, menunjukkan kepentingan memilih media pembekuan yang betul.Menggunakan pilihan komersial seperti CELLBANKER 1 dan 2, mereka berjaya melakukan cryopreservation sel myogenik lembu primer pada –80°C selama hampir setahun. Yang mengagumkan, sel-sel ini mengekalkan keupayaan mereka untuk membiak dan berdiferensiasi menjadi tisu otot kontraktil dengan struktur sarkomere yang utuh selepas dicairkan [10].
Untuk pengeluaran daging yang ditanam, media yang ditentukan secara kimia dan mematuhi GMP semakin digemari. Seperti yang disorot oleh STEMCELL Technologies:
Dalam bidang yang sangat dikawal seperti terapi sel dan gen, adalah disyorkan untuk menggunakan media cryopreservation yang dihasilkan GMP dan sepenuhnya ditentukan untuk memastikan bahawa produk dihasilkan dan dikawal secara konsisten mengikut standard kualiti [9].
Platform seperti
Prosedur Cryopreservation dan Kadar Penyejukan
Protokol Pembekuan Langkah demi Langkah
Kunci kejayaan cryopreservation terletak pada mengekalkan kadar penyejukan yang stabil antara -1°C hingga -3°C per minit[2]. Proses beransur ini membolehkan air meninggalkan sel dengan perlahan, mencegah pembentukan kristal ais intraselular yang merosakkan yang boleh merobek membran sel[1].
Mulakan dengan memusingkan sel pada 150 x g selama 5 minit[3]. Setelah dipusingkan, resuspend pelet sel dalam media pembekuan sejuk yang mengandungi 10% DMSO pada kepekatan 2–4×10⁶ sel/mL[3].Untuk mengurangkan pendedahan DMSO, bergerak dengan cepat ke langkah seterusnya - pembekuan.
Agihkan suspensi sel ke dalam vial kriogenik yang telah dilabel terlebih dahulu. Setiap vial harus menunjukkan butiran penting seperti nama garis sel, nombor laluan, nombor lot, kepekatan sel, dan tarikh pembekuan[3]. Dengan vial yang disediakan, kini tiba masanya untuk memilih dan menggunakan peralatan penyejukan yang sesuai.
Peralatan dan Teknik Penyejukan
Letakkan vial segera ke dalam peranti penyejukan kadar terkawal. Bekas pembekuan pasif, seperti Nalgene "Mr Frosty" (yang menggunakan isopropanol) atau Corning "CoolCell", adalah pilihan yang popular. Alat ini boleh mencapai kadar penyejukan kira-kira 1°C per minit apabila diletakkan dalam peti sejuk -80°C[2].
Untuk operasi berskala lebih besar di mana konsistensi adalah kritikal, peti sejuk terkawal kadar yang boleh diprogram adalah pilihan terbaik. Seperti yang dinyatakan oleh Sigma-Aldrich:
ECACC secara rutin menggunakan peti sejuk terkawal kadar yang boleh diprogram. Ini adalah cara yang paling boleh dipercayai dan boleh diulang untuk membekukan sel[3].
Selepas sekitar 24 jam pada -80°C, pindahkan vial ke fasa wap nitrogen cecair, di mana suhu berada antara -135°C dan -190°C, untuk penyimpanan jangka panjang[4]. Elakkan menyimpan sel pada -80°C lebih dari seminggu, kerana ini boleh menjejaskan kebolehlangsungan mereka. Suhu di bawah -135°C adalah penting untuk pemeliharaan tanpa had[2]. Menggunakan fasa wap sebagai ganti fasa cecair mengurangkan risiko pencemaran silang sambil mengekalkan suhu yang cukup rendah.
Protokol Pencairan dan Pemulihan
Proses Pencairan
Pencairan sel dengan cepat adalah penting untuk mengehadkan pendedahan kepada cryoprotectant toksik dan mencegah kristal ais daripada menyebabkan kerosakan. Pastikan untuk memakai pelindung muka penuh dan sarung tangan terisolasi untuk keselamatan. Mulakan dengan mengeluarkan cryovial dari nitrogen cecair dan sedikit melonggarkan penutup untuk melepaskan sebarang tekanan yang terkumpul. Kemudian, ketatkan semula penutup tersebut.
Letakkan vial dalam mandian air 37°C, memastikan penutup berada di atas garis air. Biarkan ia mencair selama 1–2 minit, atau sehingga hanya tinggal beberapa kristal ais. Setelah dicairkan, lap bahagian luar vial dengan alkohol 70% untuk mengekalkan kemandulan.
Pindahkan kandungan vial ke dalam tiub yang mengandungi 5–10 mL medium pertumbuhan yang telah dipanaskan terlebih dahulu. Tambahkan medium dengan perlahan untuk membantu mengurangkan kejutan osmosis. Jika anda bekerja dengan garis sel suspensi, sentrifugakan suspensi sel dengan segera pada 300 × g selama 5 minit pada 4°C.Langkah ini membantu memadatkan sel dan mengeluarkan cryoprotectant. Selepas sentrifugasi, resuspend sel dalam medium segar. Untuk sel yang melekat, sentrifugasi biasanya tidak diperlukan. Sebaliknya, teruskan menanam sel ke dalam bekas kultur yang sesuai dan keluarkan sebarang DMSO yang tinggal semasa pertukaran media pertama, biasanya selepas 24 jam.
Penilaian Selepas Pencairan
Sejurus selepas pencairan, periksa kebolehlangsungan sel untuk memastikan pemulihan berjaya. Gunakan kaedah pengecualian Trypan Blue untuk penilaian ini. Idealnya, kebolehlangsungan sel harus melebihi 90% [11], tetapi minimum 75% adalah boleh diterima. Selepas 24 jam, periksa sel di bawah mikroskop kontras fasa untuk mengesahkan melekat, menilai ketumpatan sel, dan memeriksa sebarang tanda pencemaran.
Teruskan memantau sel melalui laluan 1–3 untuk memastikan pembiakan normal dan bahawa mereka mengekalkan ciri-ciri yang diharapkan.Untuk garis sel yang pulih lebih perlahan, anda boleh meningkatkan kelangsungan hidup dengan meningkatkan kepekatan serum bovine janin awal kepada sekitar 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Penyimpanan dan Kemandirian Jangka Panjang
Keadaan dan Tempoh Penyimpanan
Untuk mengekalkan kemandirian garis sel dalam jangka panjang, adalah penting untuk menyimpannya pada suhu di bawah -135°C [7][2]. Ini memastikan mereka kekal terpelihara tanpa had.Kaedah yang disukai untuk menyimpan garis sel daging yang ditanam adalah nitrogen cecair fasa wap. Teknik ini mengekalkan suhu antara -135°C dan -190°C, menjadikannya ideal untuk pemeliharaan jangka panjang sambil menawarkan keselamatan yang lebih baik berbanding penyimpanan fasa cecair.
Jika anda perlu menyimpan sel pada -80°C, hadkan ini kepada tempoh 24 jam hingga satu minggu. Melebihi ini, kemandirian sel mungkin menurun.Untuk penyimpanan sementara pada suhu ini, pindahkan sel-sel ke penyimpanan nitrogen cecair secepat mungkin.
Gunakan vial kriogenik steril standard (1–2 mL) dengan benang dalaman dan O-ring untuk penyimpanan yang selamat [4][5]. Sentiasa letakkan cryovial yang ditutup dalam fasa gas dan bukannya fasa cecair nitrogen untuk mengurangkan risiko letupan vial semasa pencairan [5]. Selain itu, pastikan bekas nitrogen cecair pukal disimpan sekurang-kurangnya separuh penuh untuk mengekalkan penampan keselamatan.
Akhirnya, langkah kawalan kualiti yang ketat adalah penting untuk memastikan daya tahan jangka panjang sel-sel tersebut.
Pemeriksaan Kawalan Kualiti
Untuk memastikan kebolehpercayaan garis sel yang disimpan, ikuti protokol ketat untuk kawalan kualiti. Mulakan dengan melabel setiap vial dengan tepat menggunakan label yang tahan nitrogen cecair.Sertakan butiran penting seperti identiti garis sel, nombor lot, nombor laluan, dan tarikh pembekuan. Kekalkan pangkalan data elektronik untuk merekod lokasi tepat setiap vial, yang mengurangkan masa bekas penyimpanan perlu dibuka [7][2].
Sebelum mengkomitkan keseluruhan kumpulan untuk penyimpanan jangka panjang, uji kebolehlangsungan satu vial selepas penyimpanan fasa gas jangka pendek. Langkah ini membantu mengesahkan bahawa proses pembekuan berjaya dan mengenal pasti sebarang isu yang berpotensi [4][7][2]. Untuk stok sel yang sangat berharga, adalah bijak untuk menyimpan salinan di lokasi kedua untuk melindungi daripada kegagalan peralatan atau bencana tempatan [7][2].
Lengkapkan semua bekas penyimpanan dengan sistem pemantauan suhu dan penggera untuk mengesan tahap nitrogen cecair yang rendah [7]. Selain itu, pasang penggera oksigen di kawasan penyimpanan, yang ditetapkan untuk diaktifkan pada 18% oksigen (v/v), untuk meminimumkan risiko asfiksia bagi kakitangan yang bekerja dengan nitrogen cecair [7][2].
Protokol video Cryopreservation garis sel mamalia
Kesimpulan dan Poin Utama
Berikut adalah ringkasan cepat tentang langkah-langkah penting dan cadangan untuk cryopreservation yang berkesan dalam pengeluaran daging yang ditanam:
- Penuaian Sel: Kumpulkan sel semasa fasa pertumbuhan logaritma mereka, memastikan viabiliti melebihi 90%. Gunakan 10% DMSO sebagai cryoprotectant, walaupun gliserol boleh menjadi alternatif untuk garis sel yang lebih halus [11][1].
- Penyejukan dan Penyimpanan: Menjaga kadar penyejukan yang terkawal dan segera memindahkan vial ke penyimpanan nitrogen cecair fasa wap untuk melindungi integriti sel [11]
Satu kajian oleh Roka Kakehi et al. menekankan kepentingan ketepatan dalam kriopreservasi [10]:
"Memastikan sumber sel yang boleh dipercayai dan konsisten dengan menggunakan kriopreservasi akan membolehkan kita meningkatkan bekalan stabil sel-sel yang menjanjikan untuk pengeluaran daging yang ditanam." - Roka Kakehi et al., Universiti Perubatan Wanita Tokyo
- Proses Pencairan: Cairkan sel dalam mandian air 37°C selama kira-kira dua minit, berhenti apabila 80% ais telah cair. Ini mengurangkan ketoksikan DMSO dan meningkatkan pemulihan sel [1]. Ikuti dengan pemeriksaan viabiliti pasca pencairan untuk memastikan kejayaan dan menyesuaikan prosedur masa depan.
Kaedah-kaedah ini berfungsi seiring dengan amalan kawalan kualiti yang ketat. Sentiasa label vial dengan tepat, kekalkan rekod yang teratur, dan laksanakan pemeriksaan menyeluruh sebelum penyimpanan jangka panjang [11]. Untuk keperluan cryopreservation yang khusus, platform seperti
Soalan Lazim
Apa kelebihan menggunakan media yang ditakrifkan secara kimia untuk cryopreserving garis sel dalam pengeluaran daging yang ditanam?
Media yang ditakrifkan secara kimia membawa pelbagai manfaat apabila berkaitan dengan cryopreserving garis sel untuk pengeluaran daging yang ditanam. Dengan mengeluarkan komponen yang tidak ditakrifkan, seperti serum yang berasal dari haiwan, ia memastikan hasil yang konsisten dan boleh diramalkan - faktor penting untuk mengekalkan kebolehpercayaan jangka panjang garis sel.
Satu lagi kelebihan utama adalah risiko pencemaran dan variabiliti yang dikurangkan. Ini bukan sahaja menyokong standard kualiti dan keselamatan yang lebih tinggi tetapi juga selaras dengan ketepatan dan skala yang diperlukan untuk memenuhi kedua-dua permintaan peraturan dan jangkaan pengguna dalam industri daging yang ditanam.
Bagaimana pilihan cryoprotectant mempengaruhi kelangsungan hidup sel semasa pembekuan dan pencairan?
Pilihan cryoprotectant adalah faktor utama dalam memelihara kesihatan sel semasa pembekuan dan pencairan. Dua pilihan yang digunakan secara meluas adalah dimetil sulfoxide (DMSO) dan gliserol, masing-masing dengan ciri-ciri yang berbeza. DMSO dikenali kerana kemampuannya untuk menembusi sel dengan cepat dan memberikan perlindungan yang kuat. Walau bagaimanapun, ia datang dengan amaran: pada kepekatan tinggi atau dengan pendedahan yang berpanjangan, ia boleh menjadi toksik, berpotensi menurunkan kebolehlangsungan sel.
Gliserol, sebaliknya, kurang toksik dan boleh digunakan secara langsung.Kelemahan terletak pada kadar penembusan sel yang lebih perlahan, yang mungkin mengakibatkan perlindungan yang kurang segera berbanding DMSO.
Mencapai keseimbangan yang betul adalah penting. Menyesuaikan kepekatan dan masa pendedahan cryoprotectant dengan betul membantu melindungi sel sambil meminimumkan risiko ketoksikan. Selain itu, mematuhi amalan terbaik untuk kadar penyejukan dan keadaan penyimpanan adalah penting untuk memastikan kadar pemulihan yang tertinggi selepas pencairan.
Kenapa penting untuk mengawal kadar penyejukan semasa cryopreservation?
Menjaga kadar penyejukan yang stabil, biasanya antara –1°C dan –3°C per minit, adalah kunci untuk memastikan sel tetap hidup. Penyejukan secara beransur-ansur membolehkan sel mengering pada kadar yang terkawal, mengurangkan kemungkinan pembentukan kristal ais yang berbahaya, yang boleh merobek atau merosakkan membran sel.
Pendekatan yang terukur ini melindungi struktur sel, meningkatkan kelangsungan hidup dan fungsi mereka setelah dicairkan.Mengikuti protokol penyejukan yang tepat adalah penting untuk memastikan penyimpanan jangka panjang dan pemulihan garis sel yang berjaya.
