Cryopreservation adalah proses pembekuan dan penyimpanan sel hidup pada suhu ultra-rendah untuk mengekalkan daya hidup mereka dari masa ke masa. Kaedah ini adalah penting untuk pengeluaran daging yang ditanam, memastikan garis sel yang konsisten dan stabil serta melindungi daripada kerugian akibat pencemaran atau kegagalan peralatan. Langkah-langkah utama termasuk:
- Penyediaan: Tuai sel semasa fasa pertumbuhan mereka, periksa daya hidup (sasaran ≥90%), dan sediakan mereka dalam media pembekuan dengan cryoprotectant seperti DMSO atau gliserol.
- Pembekuan: Gunakan kadar penyejukan terkawal (-1°C hingga -3°C per minit) untuk mengelakkan kerosakan kristal ais. Simpan sel dalam wap nitrogen cecair (-135°C hingga -190°C) untuk pemeliharaan jangka panjang.
- Pencairan: Cairkan sel dengan cepat dalam air mandi 37°C untuk meminimumkan ketoksikan cryoprotectant, kemudian pindahkan mereka ke media pertumbuhan untuk pemulihan.
- Kawalan Kualiti: Label botol dengan tepat, pantau keadaan penyimpanan, dan uji daya tahan selepas pencairan untuk memastikan pemeliharaan yang berjaya.
Protokol Lengkap Pengawetan Sel untuk Garis Sel: Proses 4 Langkah dari Penyediaan hingga Penyimpanan
Penyediaan Sel untuk Pengawetan Sel
Penuaian Sel dan Pemeriksaan Daya Tahan
Untuk memastikan pemulihan terbaik selepas pencairan, tuai sel semasa fasa pertumbuhan logaritma (log) mereka. Untuk garis sel yang melekat, ini biasanya apabila mereka mencapai 80–90% ketumpatan [2][3][6].
Periksa daya tahan sel menggunakan kaedah pengecualian Trypan Blue. Campurkan bahagian yang sama (1:1) 0.4% Trypan Blue dengan suspensi sel, kemudian kira sel menggunakan haemocytometer.Sel-sel yang berdaya maju akan mengecualikan pewarna dan kelihatan terang di bawah mikroskop, manakala sel-sel yang tidak berdaya maju akan berwarna biru [4]. Sebaik-baiknya, sasarkan kebolehhidupan sekurang-kurangnya 90% untuk kadar pemulihan terbaik, walaupun beberapa protokol mungkin menerima minimum 75% [1][2][3][5].
Sebelum menuai, gunakan mikroskop untuk memeriksa pencemaran bakteria atau kulat. Sel-sel penggantungan yang sihat sepatutnya kelihatan terang, bulat, dan refraktif di bawah mikroskop fasa-kontras terbalik [2][3].
Sebaik sahaja sel-sel memenuhi piawaian kebolehhidupan yang diperlukan, teruskan ke langkah-langkah pra-pembekuan.
Persediaan Pra-Pembekuan
Untuk sel yang melekat, gunakan kaedah pemisahan lembut, seperti trypsin atau TrypLE Express, dan hadkan masa inkubasi untuk mengelakkan kerosakan pada membran sel [5]. Sediakan sel pada kepekatan 1 × 10⁶ hingga 1 × 10⁷ sel/mL, bergantung pada garis sel [1][6]. Semasa mengagihkan, pastikan suspensi sel dicampur dengan kerap untuk mengekalkan pengedaran seragam di seluruh kriovial [5].
Pastikan media pembekuan disejukkan antara 2°C dan 8°C semasa penyusunan semula untuk mengurangkan ketoksikan krioprotektan sebelum proses pembekuan bermula [5]. Setelah sel digantung dalam media pembekuan, segera teruskan ke protokol pembekuan [1].Sentiasa memelihara sel pada bilangan laluan terendah yang mungkin untuk mengurangkan risiko perubahan genetik atau morfologi [5][7].
Memilih Bahan Pelindung Beku dan Media Pembekuan
Pilihan Bahan Pelindung Beku dan Fungsinya
Dimetil sulfoksida (DMSO) digunakan secara meluas sebagai bahan pelindung beku, biasanya pada kepekatan 10% [2]. Ia berfungsi dengan menembusi membran sel dan mengurangkan pembentukan ais semasa pembekuan. Walau bagaimanapun, DMSO boleh menjadi toksik kepada sel pada suhu bilik, jadi pencairan cepat adalah penting untuk meminimumkan pendedahan dan mencairkannya dengan cepat [1].
Gliserol berfungsi sebagai alternatif berguna untuk garis sel yang sensitif kepada DMSO, biasanya digunakan dalam kepekatan antara 5% hingga 15% [8].Ia amat berkesan untuk jenis sel di mana DMSO mungkin menyebabkan pembezaan yang tidak diingini [3], dan ia cenderung mempunyai ketoksikan yang lebih rendah berbanding DMSO.
Dalam aplikasi daging yang ditanam, protokol pembekuan tradisional sering menggunakan campuran 90% Serum Bovine Fetal (FBS) dan 10% DMSO [1]. Walau bagaimanapun, kebergantungan kepada komponen yang berasal dari haiwan mengehadkan kaedah ini dari segi kebolehskalaan dan kelulusan peraturan [9]. Untuk menangani isu-isu ini, media yang ditakrifkan secara kimia - seperti Synth-a-Freeze atau Recovery Cell Culture Medium - menyediakan alternatif bebas komponen haiwan. Media ini mengekalkan daya hidup sel yang tinggi selepas pencairan sambil mengatasi cabaran yang berkaitan dengan komponen asal haiwan [9].
Perbandingan Media Pembekuan
Berikut adalah pecahan kelebihan dan kekurangan pelbagai media pembekuan yang digunakan dalam pengeluaran daging ternakan:
| Medium | Kelebihan | Kekurangan | Kesesuaian Daging Ternakan |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO dalam FBS-DMEM | Protokol yang telah ditetapkan [1] | Mengandungi komponen yang berasal dari haiwan; kebolehubahan kumpulan [9] | Keterbatasan skala |
| Synth-a-Freeze | Didefinisikan secara kimia; kualiti konsisten; bebas daripada komponen haiwan [9] | Kos awal yang lebih tinggi [9] | Ya |
| Medium Kultur Sel Pemulihan | Mudah digunakan; direka untuk pemulihan cepat [9] | Mungkin memerlukan pengoptimuman untuk garis sel tertentu | Ya |
| 10% Gliserol dalam FBS | Alternatif untuk sel sensitif DMSO [1] | Bergantung pada serum asal haiwan [9] | Keterbatasan skala |
Pada Februari 2023, penyelidik di Tokyo Women's Medical University, yang diketuai oleh Hironobu Takahashi, menunjukkan kepentingan memilih media pembekuan yang betul. Menggunakan pilihan komersial seperti CELLBANKER 1 dan 2, mereka berjaya mengekalkan sel myogenik lembu primer pada –80°C sehingga setahun. Menariknya, sel-sel ini mengekalkan keupayaan mereka untuk membiak dan membezakan menjadi tisu otot kontraktil dengan struktur sarkomer yang utuh selepas pencairan [10] .
Untuk pengeluaran daging yang ditanam, media yang ditakrifkan secara kimia dan mematuhi GMP semakin digemari. Seperti yang STEMCELL Technologies tekankan:
Dalam bidang yang sangat dikawal selia seperti terapi sel dan gen, adalah disyorkan untuk menggunakan media kriopreservasi yang dihasilkan GMP dan ditakrifkan sepenuhnya untuk memastikan bahawa produk dihasilkan dan dikawal secara konsisten mengikut piawaian kualiti [9].
Platform seperti
Prosedur Pembekuan dan Kadar Penyejukan
Protokol Pembekuan Langkah demi Langkah
Kunci kejayaan kriopreservasi terletak pada mengekalkan kadar penyejukan yang stabil iaitu -1°C hingga -3°C per minit[2]. Proses beransur-ansur ini membolehkan air meninggalkan sel secara perlahan, menghalang pembentukan kristal ais intraselular yang merosakkan yang boleh memecahkan membran sel[1].
Mulakan dengan memusingkan sel pada 150 x g selama 5 minit[3]. Setelah dipusingkan, gantung semula pelet sel dalam medium pembekuan sejuk yang mengandungi 10% DMSO pada kepekatan 2–4×10⁶ sel/mL [3].Untuk mengurangkan pendedahan DMSO, bergerak cepat ke langkah seterusnya - pembekuan.
Edarkan suspensi sel ke dalam vial kriogenik yang telah dilabelkan terlebih dahulu. Setiap vial harus menunjukkan butiran penting seperti nama garis sel, nombor laluan, nombor lot, kepekatan sel, dan tarikh pembekuan dengan jelas[3]. Dengan vial yang telah disediakan, tiba masanya untuk memilih dan menggunakan peralatan penyejukan yang sesuai.
Peralatan dan Teknik Penyejukan
Letakkan vial segera ke dalam peranti penyejukan kadar terkawal. Bekas pembekuan pasif, seperti Nalgene "Mr Frosty" (yang menggunakan isopropanol) atau Corning "CoolCell", adalah pilihan yang popular. Alat-alat ini boleh mencapai kadar penyejukan kira-kira 1°C per minit apabila diletakkan dalam peti sejuk -80°C[2] .
Untuk operasi berskala besar di mana konsistensi adalah kritikal, peti sejuk beku yang dikawal kadar secara boleh atur cara adalah pilihan terbaik. Seperti yang dinyatakan oleh Sigma-Aldrich:
ECACC secara rutin menggunakan peti sejuk beku yang dikawal kadar secara boleh atur cara. Ini adalah cara yang paling boleh dipercayai dan boleh diulang untuk membekukan sel[3].
Selepas sekitar 24 jam pada -80°C, pindahkan vial ke fasa wap nitrogen cecair, di mana suhu berkisar antara -135°C dan -190°C, untuk penyimpanan jangka panjang [4]. Elakkan menyimpan sel pada -80°C lebih dari seminggu, kerana ini boleh menjejaskan daya hidup mereka. Suhu di bawah -135°C adalah penting untuk pemeliharaan tanpa had[2]. Menggunakan fasa wap dan bukannya fasa cecair mengurangkan risiko pencemaran silang sambil mengekalkan suhu yang cukup rendah.
Protokol Pencairan dan Pemulihan
Proses Pencairan
Pencairan sel dengan cepat adalah penting untuk menghadkan pendedahan kepada krioprotektan toksik dan mengelakkan kristal ais daripada menyebabkan kerosakan. Pastikan memakai pelindung muka penuh dan sarung tangan berinsulasi untuk keselamatan. Mulakan dengan mengeluarkan kriovial dari nitrogen cecair dan longgarkan sedikit penutup untuk melepaskan sebarang tekanan yang terkumpul. Kemudian, ketatkan semula penutup.
Letakkan vial dalam mandian air 37°C, pastikan penutup kekal di atas garis air. Biarkan ia mencair selama 1–2 minit, atau sehingga hanya tinggal beberapa kristal ais. Setelah cair, lap bahagian luar vial dengan alkohol 70% untuk mengekalkan kesterilan.
Pindahkan kandungan vial ke dalam tiub yang mengandungi 5–10 mL medium pertumbuhan yang telah dipanaskan terlebih dahulu. Tambahkan medium perlahan-lahan untuk membantu mengurangkan kejutan osmotik. Jika anda bekerja dengan garis sel penggantungan, sentrifug sel penggantungan dengan segera pada 300 × g selama 5 minit pada 4°C.Langkah ini membantu memendapkan sel dan mengeluarkan krioprotektan. Selepas sentrifugasi, gantung semula sel dalam medium segar. Untuk sel yang melekat, sentrifugasi biasanya tidak diperlukan. Sebaliknya, benih terus sel ke dalam bekas kultur yang sesuai dan keluarkan sebarang DMSO yang tinggal semasa pertukaran media pertama, biasanya selepas 24 jam.
Penilaian Selepas Pencairan
Sejurus selepas pencairan, periksa daya hidup sel untuk memastikan pemulihan berjaya. Gunakan kaedah pengecualian Trypan Blue untuk penilaian ini. Sebaik-baiknya, daya hidup sel harus melebihi 90% [11], tetapi minimum 75% boleh diterima. Selepas 24 jam, periksa sel di bawah mikroskop fasa-kontras untuk mengesahkan lekatan, menilai ketumpatan sel, dan memeriksa sebarang tanda pencemaran.
Teruskan memantau sel melalui laluan 1–3 untuk memastikan percambahan normal dan bahawa mereka mengekalkan ciri-ciri yang dijangkakan.Untuk garis sel yang pulih dengan lebih perlahan, anda boleh meningkatkan kelangsungan hidup dengan meningkatkan kepekatan serum lembu janin awal kepada sekitar 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Penyimpanan dan Daya Tahan Jangka Panjang
Syarat dan Tempoh Penyimpanan
Untuk mengekalkan daya tahan garis sel dalam jangka panjang, adalah penting untuk menyimpannya pada suhu di bawah -135°C [7][2]. Ini memastikan mereka kekal terpelihara selama-lamanya.
Kaedah pilihan untuk menyimpan garis sel daging yang ditanam adalah fasa wap nitrogen cecair. Teknik ini mengekalkan suhu antara -135°C dan -190°C, menjadikannya ideal untuk pemeliharaan jangka panjang sambil menawarkan keselamatan yang lebih baik berbanding penyimpanan fasa cecair.
Jika anda perlu menyimpan sel pada -80°C, hadkan ini kepada tempoh 24 jam hingga satu minggu. Selepas itu, daya tahan sel mungkin menurun.Untuk penyimpanan sementara pada suhu ini, pindahkan sel ke penyimpanan nitrogen cecair secepat mungkin.
Gunakan vial kriogenik steril standard (1–2 mL) dengan ulir dalaman dan O-ring untuk penyimpanan yang selamat [4][5]. Sentiasa letakkan vial kriogenik yang tertutup di fasa gas dan bukannya fasa cecair nitrogen untuk mengurangkan risiko letupan vial semasa pencairan [5]. Selain itu, pastikan bekas nitrogen cecair pukal disimpan sekurang-kurangnya separuh penuh untuk mengekalkan penampan keselamatan.
Akhirnya, langkah-langkah kawalan kualiti yang ketat adalah kritikal untuk memastikan daya tahan jangka panjang sel.
Pemeriksaan Kawalan Kualiti
Untuk memastikan kebolehpercayaan garis sel yang disimpan, ikuti protokol ketat untuk kawalan kualiti. Mulakan dengan melabel setiap vial dengan tepat menggunakan label tahan nitrogen cecair. Sertakan butiran penting seperti identiti sel, nombor lot, nombor laluan, dan tarikh pembekuan. Kekalkan pangkalan data elektronik untuk merekod lokasi tepat setiap vial, yang mengurangkan masa bekas penyimpanan perlu dibuka [7][2].
Sebelum menyimpan keseluruhan kumpulan untuk jangka panjang, uji daya tahan satu vial selepas penyimpanan fasa gas jangka pendek. Langkah ini membantu mengesahkan bahawa proses pembekuan berjaya dan mengenal pasti sebarang isu berpotensi [4][7][2]. Untuk stok sel yang sangat berharga, adalah bijak untuk menyimpan salinan di lokasi sekunder untuk melindungi daripada kegagalan peralatan atau bencana tempatan [7][2].
Lengkapkan semua bekas penyimpanan dengan sistem pemantauan suhu dan penggera untuk mengesan paras nitrogen cecair yang rendah [7]. Selain itu, pasang penggera oksigen di kawasan penyimpanan, ditetapkan untuk mencetuskan pada 18% oksigen (v/v), untuk meminimumkan risiko lemas bagi kakitangan yang bekerja dengan nitrogen cecair [7][2].
Protokol video kriopreservasi garis sel mamalia
Kesimpulan dan Pengajaran Utama
Berikut adalah ringkasan cepat langkah-langkah penting dan cadangan untuk kriopreservasi yang berkesan dalam pengeluaran daging yang ditanam:
- Penuaian Sel: Kumpulkan sel semasa fasa pertumbuhan logaritma mereka, memastikan daya hidup melebihi 90%. Gunakan 10% DMSO sebagai krioprotektan, walaupun gliserol boleh menjadi alternatif untuk garis sel yang lebih halus [11][1].
- Penyejukan dan Penyimpanan: Mengekalkan kadar penyejukan yang terkawal dan segera memindahkan vial ke penyimpanan nitrogen cecair fasa wap untuk melindungi integriti sel [11]
Satu kajian oleh Roka Kakehi et al. menekankan kepentingan ketepatan dalam kriopreservasi [10]:
"Memastikan sumber sel yang boleh dipercayai dan konsisten dengan menggunakan kriopreservasi akan membolehkan kami meningkatkan bekalan stabil sel yang menjanjikan untuk pengeluaran daging yang diternak." - Roka Kakehi et al., Universiti Perubatan Wanita Tokyo
- Proses Pencairan: Cairkan sel dalam mandian air 37°C selama kira-kira dua minit, berhenti apabila 80% ais telah cair. Ini mengurangkan ketoksikan DMSO dan meningkatkan pemulihan sel [1]. Ikuti dengan pemeriksaan daya hidup selepas pencairan untuk memastikan kejayaan dan menyesuaikan prosedur masa depan.
Kaedah-kaedah ini berfungsi seiring dengan amalan kawalan kualiti yang ketat. Sentiasa labelkan vial dengan tepat, kekalkan rekod yang teratur, dan laksanakan pemeriksaan menyeluruh sebelum penyimpanan jangka panjang [11]. Untuk keperluan kriopreservasi khusus, platform seperti
Soalan Lazim
Apakah kelebihan menggunakan media yang ditakrifkan secara kimia untuk kriopreservasi garisan sel dalam pengeluaran daging yang ditanam?
Media yang ditakrifkan secara kimia membawa pelbagai manfaat apabila ia berkaitan dengan kriopreservasi garisan sel untuk pengeluaran daging yang ditanam. Dengan mengeluarkan komponen yang tidak ditakrifkan, seperti serum yang berasal dari haiwan, mereka memastikan hasil yang konsisten dan boleh diramal - faktor penting untuk mengekalkan kebolehpercayaan jangka panjang garisan sel.
Satu lagi kelebihan utama adalah risiko pencemaran dan variasi yang dikurangkan. Ini bukan sahaja menyokong piawaian kualiti dan keselamatan yang lebih tinggi tetapi juga selaras dengan ketepatan dan kebolehan skala yang diperlukan untuk memenuhi kedua-dua tuntutan peraturan dan jangkaan pengguna dalam industri daging yang diternak.
Bagaimana pemilihan krioprotektan mempengaruhi kelangsungan hidup sel semasa pembekuan dan pencairan?
Pemilihan krioprotektan adalah faktor utama dalam memelihara kesihatan sel semasa pembekuan dan pencairan. Dua pilihan yang banyak digunakan adalah dimetil sulfoksida (DMSO) dan gliserol, masing-masing dengan ciri-ciri yang berbeza. DMSO dikenali kerana kemampuannya menembusi sel dengan cepat dan memberikan perlindungan yang kuat. Walau bagaimanapun, ia datang dengan peringatan: pada kepekatan tinggi atau dengan pendedahan yang berpanjangan, ia boleh menjadi toksik, berpotensi menurunkan daya hidup sel.
Gliserol, sebaliknya, kurang toksik dan boleh digunakan secara langsung.Kelemahannya terletak pada kadar penembusan sel yang lebih perlahan, yang mungkin mengakibatkan perlindungan yang kurang segera berbanding DMSO.
Mencapai keseimbangan yang betul adalah penting. Menyesuaikan kepekatan dan masa pendedahan cryoprotectant dengan betul membantu melindungi sel sambil meminimumkan risiko ketoksikan. Selain itu, mematuhi amalan terbaik untuk kadar penyejukan dan keadaan penyimpanan adalah penting untuk memastikan kadar pemulihan tertinggi selepas pencairan.
Mengapa penting untuk mengawal kadar penyejukan semasa cryopreservation?
Menjaga kadar penyejukan yang stabil, biasanya antara –1°C dan –3°C per minit, adalah kunci untuk memastikan sel kekal berdaya maju. Penyejukan secara beransur-ansur membolehkan sel mengalami dehidrasi pada kadar yang terkawal, mengurangkan kemungkinan pembentukan kristal ais yang berbahaya, yang boleh merobek atau merosakkan membran sel.
Pendekatan yang terukur ini melindungi struktur sel, meningkatkan kelangsungan hidup dan fungsinya setelah dicairkan.Mengikuti protokol penyejukan yang tepat adalah penting untuk memastikan penyimpanan jangka panjang dan pemulihan garis sel yang berjaya.
