ตลาด B2B เนื้อสัตว์เพาะเลี้ยงแห่งแรกของโลก: อ่านประกาศ

โปรโตคอลการแช่แข็งเซลล์สำหรับสายเซลล์

Cryopreservation Protocols for Cell Lines

David Bell |

การเก็บรักษาในสภาพแช่แข็ง เป็นกระบวนการแช่แข็งและเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตที่อุณหภูมิต่ำมากเพื่อรักษาความมีชีวิตของพวกมันในระยะยาว วิธีนี้มีความสำคัญต่อการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง โดยมั่นใจได้ว่าเซลล์มีเสถียรภาพและสม่ำเสมอ และป้องกันการสูญเสียจากการปนเปื้อนหรือความล้มเหลวของอุปกรณ์ ขั้นตอนสำคัญประกอบด้วย:

  • การเตรียม: เก็บเซลล์ในระหว่างช่วงการเจริญเติบโต ตรวจสอบความมีชีวิต (ตั้งเป้า ≥90%) และเตรียมในสื่อแช่แข็งที่มีสารป้องกันการแช่แข็ง เช่น DMSO หรือกลีเซอรีน.
  • การแช่แข็ง: ใช้อัตราการทำความเย็นที่ควบคุม (-1°C ถึง -3°C ต่อ นาที) เพื่อป้องกันความเสียหายจากผลึกน้ำแข็ง เก็บเซลล์ในไอน้ำไนโตรเจนเหลว (-135°C ถึง -190°C) เพื่อการเก็บรักษาระยะยาว.
  • การละลาย: ละลายเซลล์อย่างรวดเร็วในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เพื่อลดความเป็นพิษของสารป้องกันการแช่แข็ง จากนั้นย้ายไปยังสื่อการเจริญเติบโตเพื่อการฟื้นตัว.
  • การควบคุมคุณภาพ: ระบุขวดอย่างถูกต้อง, ตรวจสอบสภาพการเก็บรักษา, และทดสอบความมีชีวิตหลังการละลายเพื่อให้แน่ใจว่าการเก็บรักษาประสบความสำเร็จ.
Complete Cryopreservation Protocol for Cell Lines: 4-Step Process from Preparation to Storage

โปรโตคอลการเก็บรักษาเซลล์ด้วยการแช่แข็งแบบครบวงจร: กระบวนการ 4 ขั้นตอนจากการเตรียมการจนถึงการเก็บรักษา

การเตรียมเซลล์สำหรับการเก็บรักษาแบบแช่แข็ง

การเก็บเกี่ยวเซลล์และการตรวจสอบความมีชีวิต

เพื่อให้แน่ใจว่าการฟื้นตัวที่ดีที่สุดหลังการละลาย ให้เก็บเกี่ยวเซลล์ในระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิธมิก (log) โดยทั่วไปจะเป็นช่วงที่เซลล์มีความหนาแน่น 80–90% [2][3][6].

ตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้วิธีการยกเว้น Trypan Blue ผสมส่วนเท่าๆ กัน (1:1) ของ 0.4% Trypan Blue กับการระงับเซลล์ จากนั้นนับเซลล์โดยใช้เครื่องนับเซลล์.เซลล์ที่มีชีวิตจะไม่ดูดซับสีย้อมและจะปรากฏสว่างใต้กล้องจุลทรรศน์ ในขณะที่เซลล์ที่ไม่มีชีวิตจะมีสีฟ้า [4] โดยทั่วไปแล้ว ควรตั้งเป้าหมายให้มีอัตราการมีชีวิตอย่างน้อย 90% เพื่ออัตราการฟื้นตัวที่ดีที่สุด แม้ว่าบางโปรโตคอลอาจยอมรับขั้นต่ำที่ 75% [1][2][3][5].

ก่อนการเก็บเกี่ยว ให้ใช้กล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบการปนเปื้อนจากแบคทีเรียหรือเชื้อรา เซลล์ที่แข็งแรงในสารแขวนลอยควรปรากฏสว่าง กลม และมีการหักเหของแสงใต้กล้องจุลทรรศน์แบบย้อนกลับ [2][3].

เมื่อเซลล์ตรงตามมาตรฐานการมีชีวิตที่กำหนดแล้ว ให้ดำเนินการไปยังขั้นตอนก่อนการแช่แข็ง

การเตรียมการก่อนการแช่แข็ง

สำหรับเซลล์ที่ยึดติด ใช้วิธีการแยกเซลล์อย่างอ่อนโยน เช่น ทริปซินหรือ TrypLE Express และจำกัดเวลาในการเพาะเลี้ยงเพื่อลดความเสียหายต่อเยื่อหุ้มเซลล์ [5]. เตรียมเซลล์ที่ความเข้มข้น 1 × 10⁶ ถึง 1 × 10⁷ เซลล์/mL ขึ้นอยู่กับสายเซลล์ [1][6]. ในขณะที่แบ่งปัน ให้แน่ใจว่าสารแขวนลอยของเซลล์ถูกผสมบ่อยๆ เพื่อรักษาการกระจายที่สม่ำเสมอใน cryovials [5].

เก็บสื่อแช่แข็งให้เย็นระหว่าง 2°C ถึง 8°C ในระหว่างการฟื้นฟูเพื่อลดความเป็นพิษของสารป้องกันการแช่แข็งก่อนที่กระบวนการแช่แข็งจะเริ่มขึ้น [5]. เมื่อเซลล์ถูกฟื้นฟูในสื่อแช่แข็ง ให้ดำเนินการตามโปรโตคอลการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว [1].ควรทำการเก็บรักษาเซลล์ด้วยการแช่แข็งในสภาพแวดล้อมที่ต่ำที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้เพื่อลดความเสี่ยงของการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมหรือการเปลี่ยนแปลงทางรูปแบบ [5][7].

การเลือกสารป้องกันการแช่แข็งและสื่อแช่แข็ง

ตัวเลือกสารป้องกันการแช่แข็งและฟังก์ชันของพวกเขา

ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสารป้องกันการแช่แข็ง โดยทั่วไปจะใช้ในความเข้มข้น 10% [2]. มันทำงานโดยการซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์และลดการเกิดน้ำแข็งระหว่างการแช่แข็ง อย่างไรก็ตาม DMSO อาจเป็นพิษต่อเซลล์ที่อุณหภูมิห้อง ดังนั้นการละลายอย่างรวดเร็วจึงเป็นสิ่งสำคัญเพื่อลดการสัมผัสและเจือจางอย่างรวดเร็ว [1].

กลีเซอรีน เป็นทางเลือกที่มีประโยชน์สำหรับเซลล์ที่ไวต่อ DMSO โดยทั่วไปจะใช้ในความเข้มข้นตั้งแต่ 5% ถึง 15% [8].มันมีประสิทธิภาพโดยเฉพาะสำหรับประเภทเซลล์ที่ DMSO อาจทำให้เกิดการแยกประเภทที่ไม่ต้องการ [3] และมักมีความเป็นพิษต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ DMSO.

ในแอปพลิเคชันเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง โปรโตคอลการแช่แข็งแบบดั้งเดิมมักใช้ส่วนผสมของ Fetal Bovine Serum (FBS) 90% และ DMSO 10% [1] อย่างไรก็ตาม การพึ่งพาส่วนประกอบที่มาจากสัตว์จำกัดวิธีการเหล่านี้ในแง่ของการขยายขนาดและการอนุมัติจากหน่วยงานกำกับดูแล [9] เพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้ สื่อที่กำหนดทางเคมี - เช่น Synth-a-Freeze หรือ Recovery Cell Culture Medium - ให้ทางเลือกที่ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ สื่อเหล่านี้รักษาความมีชีวิตของเซลล์หลังการละลายน้ำแข็งในระดับสูงในขณะที่เอาชนะความท้าทายที่เกี่ยวข้องกับส่วนประกอบที่มีต้นกำเนิดจากสัตว์ [9]

การเปรียบเทียบสื่อการแช่แข็ง

นี่คือการสรุปข้อดีและข้อจำกัดของสื่อการแช่แข็งต่างๆ ที่ใช้ในการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง:

สื่อ ข้อดี ข้อเสีย ความเหมาะสมของเนื้อที่เพาะเลี้ยง
10% DMSO ใน FBS-DMEM โปรโตคอลที่จัดตั้งขึ้น [1] มีส่วนประกอบที่มาจากสัตว์; ความแปรปรวนของแบทช์ [9] ขีดจำกัดในการขยายขนาด
Synth-a-Freeze กำหนดทางเคมี; คุณภาพสม่ำเสมอ; ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ [9] ต้นทุนเริ่มต้นสูงกว่า [9] ใช่
สื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ฟื้นฟูใช้งานง่าย; ออกแบบมาสำหรับการฟื้นฟูอย่างรวดเร็ว [9] อาจต้องการการปรับแต่งสำหรับเซลล์ไลน์เฉพาะ ใช่
กลีเซอรีน 10% ใน FBS ทางเลือกสำหรับเซลล์ที่ไวต่อ DMSO [1] ขึ้นอยู่กับเซรั่มที่มีต้นกำเนิดจากสัตว์ [9] ขีดจำกัดในการขยายขนาด

ในเดือนกุมภาพันธ์ 2023 นักวิจัยที่ มหาวิทยาลัยการแพทย์หญิงโตเกียว นำโดย Hironobu Takahashi ได้แสดงให้เห็นถึงความสำคัญของการเลือกสื่อการแช่แข็งที่เหมาะสม.ใช้ตัวเลือกเชิงพาณิชย์เช่น CELLBANKER 1 และ 2 พวกเขาประสบความสำเร็จในการแช่แข็งเซลล์กล้ามเนื้อโบวีนหลักที่อุณหภูมิ -80°C เป็นเวลานานถึงหนึ่งปี อย่างน่าทึ่ง เซลล์เหล่านี้ยังคงสามารถเจริญเติบโตและแยกตัวเป็นเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อที่หดตัวได้โดยมีโครงสร้างซาร์โคเมียร์ที่สมบูรณ์หลังจากการละลาย [10].

สำหรับการผลิตเนื้อที่ปลูกในห้องปฏิบัติการ สื่อที่มีการกำหนดทางเคมีและเป็นไปตามมาตรฐาน GMP กำลังได้รับความนิยมมากขึ้น ตามที่ STEMCELL Technologies เน้นย้ำ:

ในสาขาที่มีการควบคุมอย่างเข้มงวด เช่น การบำบัดด้วยเซลล์และยีน แนะนำให้ใช้สื่อการแช่แข็งที่ผลิตตาม GMP และมีการกำหนดอย่างเต็มที่เพื่อให้แน่ใจว่าผลิตภัณฑ์ถูกผลิตและควบคุมอย่างสม่ำเสมอตามมาตรฐานคุณภาพ [9].

แพลตฟอร์มเช่น Cellbase ขณะนี้มีสื่อการแช่แข็งที่ได้รับการรับรองและเป็นไปตาม GMP ซึ่งออกแบบมาโดยเฉพาะเพื่อตอบสนองความต้องการในการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง.

ขั้นตอนการแช่แข็งและอัตราการทำความเย็น

โปรโตคอลการแช่แข็งแบบทีละขั้น

กุญแจสำคัญในการแช่แข็งที่ประสบความสำเร็จอยู่ที่การรักษาอัตราการทำความเย็นที่คงที่ที่ -1°C ถึง -3°C ต่อ นาที[2]. กระบวนการที่ค่อยเป็นค่อยไปนี้ช่วยให้น้ำออกจากเซลล์ได้อย่างช้าๆ ป้องกันการเกิดผลึกน้ำแข็งภายในเซลล์ที่เป็นอันตรายซึ่งอาจทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แตก[1].

เริ่มต้นโดยการปั่นเซลล์ที่ 150 x g เป็นเวลา 5 นาที[3]. เมื่อลงปั่นแล้ว ให้ทำการละลายเซลล์ในสื่อการแช่แข็งที่เย็นซึ่งมี 10% DMSO ที่ความเข้มข้น 2–4×10⁶ เซลล์/mL[3].เพื่อลดการสัมผัสกับ DMSO ให้เคลื่อนที่ไปยังขั้นตอนถัดไปอย่างรวดเร็ว - การแช่แข็ง.

แจกจ่ายการระงับเซลล์ลงในขวดแช่แข็งที่มีป้ายกำกับล่วงหน้าแต่ละขวดควรระบุรายละเอียดที่สำคัญอย่างชัดเจน เช่น ชื่อสายเซลล์ หมายเลขการผ่าน จำนวนล็อต ความเข้มข้นของเซลล์ และวันที่แช่แข็ง[3]. เมื่อเตรียมขวดเสร็จแล้ว ถึงเวลาเลือกและใช้เครื่องมือทำความเย็นที่เหมาะสม.

อุปกรณ์ทำความเย็นและเทคนิค

วางขวดลงในอุปกรณ์ทำความเย็นที่ควบคุมอัตราได้ทันที ภาชนะแช่แข็งแบบพาสซีฟ เช่น Nalgene "Mr Frosty" (ซึ่งใช้ไอโซโพรพานอล) หรือ Corning "CoolCell" เป็นตัวเลือกที่ได้รับความนิยม เครื่องมือเหล่านี้สามารถทำให้เกิดอัตราการทำความเย็นประมาณ 1°C ต่อ นาที เมื่อวางในช่องแช่แข็งที่ -80°C[2].

สำหรับการดำเนินงานในขนาดใหญ่ที่ความสม่ำเสมอเป็นสิ่งสำคัญ ตู้แช่แข็งที่ควบคุมอัตราได้แบบโปรแกรมเป็นตัวเลือกที่ดีที่สุด ตามที่ Sigma-Aldrich ระบุไว้:

ECACC ใช้ตู้แช่แข็งที่ควบคุมอัตราได้แบบโปรแกรมเป็นประจำ นี่คือวิธีที่เชื่อถือได้และสามารถทำซ้ำได้มากที่สุดในการแช่แข็งเซลล์[3].

หลังจากประมาณ 24 ชั่วโมง ที่ -80°C ให้ย้ายขวดไปยังเฟสไอของไนโตรเจนเหลว ซึ่งอุณหภูมิจะอยู่ระหว่าง -135°C และ -190°C สำหรับการเก็บรักษาระยะยาว[4]. หลีกเลี่ยงการเก็บเซลล์ที่ -80°C นานกว่าหนึ่งสัปดาห์ เนื่องจากอาจทำให้ความมีชีวิตของเซลล์ลดลง อุณหภูมิที่ต่ำกว่า -135°C เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเก็บรักษาอย่างไม่มีกำหนด[2]. การใช้เฟสไอแทนเฟสของเหลวช่วยลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนข้ามในขณะที่ยังคงอุณหภูมิที่ต่ำพอสมควร

โปรโตคอลการละลายและฟื้นฟู

กระบวนการละลาย

การละลายเซลล์อย่างรวดเร็วเป็นสิ่งสำคัญเพื่อจำกัดการสัมผัสกับสารป้องกันการแช่แข็งที่เป็นพิษและป้องกันไม่ให้ผลึกน้ำแข็งทำให้เกิดความเสียหาย ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้สวมหน้ากากเต็มหน้าและถุงมือที่มีฉนวนเพื่อความปลอดภัย เริ่มต้นโดยการนำขวดแช่แข็งออกจากไนโตรเจนเหลวและคลายฝาออกเล็กน้อยเพื่อปล่อยความดันที่สะสมอยู่ จากนั้นให้ขันฝาให้แน่นอีกครั้ง.

วางขวดในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C โดยให้แน่ใจว่าฝาอยู่เหนือระดับน้ำ ปล่อยให้ละลายเป็นเวลา 1–2 นาที หรือจนกว่าจะมีผลึกน้ำแข็งเหลือเพียงไม่กี่ชิ้น เมื่อละลายแล้ว ให้เช็ดด้านนอกของขวดด้วยแอลกอฮอล์ 70% เพื่อรักษาความสะอาด.

โอนเนื้อหาของขวดไปยังหลอดที่มีสื่อการเจริญเติบโตที่อุ่นล่วงหน้า 5–10 มิลลิลิตร เพิ่มสื่ออย่างช้าๆ เพื่อช่วยลดการช็อกออสโมติก หากคุณกำลังทำงานกับเซลล์สายการระงับ ให้ปั่นเซลล์ระงับทันทีที่ 300 × g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4°C.ขั้นตอนนี้ช่วยในการทำให้เซลล์เป็นเม็ดและกำจัดสารป้องกันการแช่แข็ง หลังจากการปั่นเหวี่ยง ให้ทำการละลายเซลล์ในสื่อใหม่ สำหรับเซลล์ที่ยึดติด การปั่นเหวี่ยงมักจะไม่จำเป็น แทนที่จะทำเช่นนั้น ให้เพาะเซลล์ลงในภาชนะเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมและกำจัด DMSO ที่เหลืออยู่ในระหว่างการเปลี่ยนสื่อครั้งแรก ซึ่งมักจะทำหลังจาก 24 ชั่วโมง.

การประเมินหลังการละลาย

ทันทีหลังจากการละลาย ให้ตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์เพื่อให้แน่ใจว่าการฟื้นฟูประสบความสำเร็จ ใช้เมธอดการยกเว้น Trypan Blue สำหรับการประเมินนี้ โดยทั่วไปแล้ว ความมีชีวิตของเซลล์ควรเกิน 90% [11] แต่ขั้นต่ำที่ยอมรับได้คือ 75% หลังจาก 24 ชั่วโมง ให้ตรวจสอบเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสเพื่อยืนยันการยึดติด ประเมินความหนาแน่นของเซลล์ และตรวจสอบสัญญาณของการปนเปื้อน.

ติดตามเซลล์ต่อไปผ่านการส่งต่อ 1–3 เพื่อให้แน่ใจว่ามีการเจริญเติบโตตามปกติและพวกมันยังคงรักษาลักษณะที่คาดหวังไว้.สำหรับเซลล์ไลน์ที่ฟื้นตัวช้ากว่า คุณสามารถปรับปรุงการอยู่รอดโดยการเพิ่มความเข้มข้นของเซรุ่มโคท้องแก่เริ่มต้นเป็นประมาณ 20% v/v.

การเก็บรักษาและความมีชีวิตในระยะยาว

เงื่อนไขการเก็บรักษาและระยะเวลา

เพื่อรักษาความมีชีวิตของเซลล์ไลน์ในระยะยาว จำเป็นต้องเก็บรักษาที่อุณหภูมิต่ำกว่า -135°C [7][2]. ซึ่งจะทำให้เซลล์ถูกเก็บรักษาไว้ได้ไม่มีกำหนด.

วิธีที่แนะนำในการเก็บรักษาเซลล์ไลน์เนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงคือการใช้ไนโตรเจนเหลวในรูปแบบไอ วิธีนี้จะรักษาอุณหภูมิให้อยู่ระหว่าง -135°C ถึง -190°C ทำให้เหมาะสำหรับการเก็บรักษาในระยะยาวและมีความปลอดภัยมากกว่าการเก็บรักษาในรูปแบบของเหลว.

หากคุณต้องการเก็บเซลล์ที่ -80°C ให้จำกัดระยะเวลาไว้ที่ 24 ชั่วโมงถึงหนึ่งสัปดาห์ นอกเหนือจากนี้ ความมีชีวิตของเซลล์อาจลดลง.สำหรับการเก็บรักษาชั่วคราวที่อุณหภูมินี้ ให้โอนเซลล์ไปยังการเก็บรักษาในไนโตรเจนเหลวโดยเร็วที่สุด.

ใช้ขวดเก็บรักษาแบบเยือกแข็งที่ปราศจากเชื้อมาตรฐาน (1–2 มล.) ที่มีเกลียวภายในและ O-ring เพื่อการเก็บรักษาที่ปลอดภัย [4][5]. ควรวางขวดเยือกแข็งที่ปิดสนิทในเฟสก๊าซแทนที่จะเป็นเฟสของเหลวของไนโตรเจนเพื่อลดความเสี่ยงของการระเบิดของขวดในระหว่างการละลาย [5]. นอกจากนี้ ควรตรวจสอบให้แน่ใจว่าเรือไนโตรเจนเหลวขนาดใหญ่มีระดับน้ำอย่างน้อยครึ่งหนึ่งเพื่อรักษาเบาะความปลอดภัย.

สุดท้ายนี้ มาตรการควบคุมคุณภาพที่เข้มงวดเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้แน่ใจว่าสภาพความมีชีวิตของเซลล์ในระยะยาว.

การตรวจสอบคุณภาพ

เพื่อให้แน่ใจในความเชื่อถือได้ของเซลล์สายพันธุ์ที่เก็บรักษาไว้ ให้ปฏิบัติตามโปรโตคอลที่เข้มงวดสำหรับการควบคุมคุณภาพ เริ่มต้นด้วยการติดป้ายแต่ละขวดด้วยป้ายที่ทนต่อไนโตรเจนเหลวอย่างถูกต้อง.รวมรายละเอียดที่สำคัญ เช่น ตัวตนของเซลล์ หมายเลขล็อต หมายเลขการผ่าน และวันที่แช่แข็ง รักษาฐานข้อมูลอิเล็กทรอนิกส์เพื่อติดตามตำแหน่งที่แน่นอนของแต่ละขวด ซึ่งช่วยลดเวลาที่ภาชนะจัดเก็บต้องเปิดอยู่ [7][2].

ก่อนที่จะส่งมอบชุดทั้งหมดไปยังการจัดเก็บระยะยาว ให้ทดสอบความมีชีวิตของขวดหนึ่งหลังจากการจัดเก็บในระยะสั้นในสภาพก๊าซ ขั้นตอนนี้ช่วยยืนยันว่ากระบวนการแช่แข็งประสบความสำเร็จและระบุปัญหาที่อาจเกิดขึ้น [4][7][2]. สำหรับสต็อกเซลล์ที่มีค่ามาก ควรจัดเก็บสำเนาที่สถานที่รองเพื่อป้องกันความล้มเหลวของอุปกรณ์หรือภัยพิบัติในท้องถิ่น [7][2].

ติดตั้งระบบตรวจสอบอุณหภูมิและสัญญาณเตือนในภาชนะเก็บทั้งหมดเพื่อตรวจจับระดับไนโตรเจนเหลวต่ำ [7]. นอกจากนี้ ให้ติดตั้งสัญญาณเตือนออกซิเจนในพื้นที่เก็บของ โดยตั้งค่าให้ทำงานเมื่อมีออกซิเจน 18% (v/v) เพื่อลดความเสี่ยงจากการขาดอากาศหายใจสำหรับบุคลากรที่ทำงานกับไนโตรเจนเหลว [7][2].

โปรโตคอลวิดีโอการเก็บรักษาเซลล์ในอุณหภูมิต่ำ

บทสรุปและข้อคิดสำคัญ

นี่คือการสรุปขั้นตอนและคำแนะนำที่สำคัญสำหรับการเก็บรักษาในอุณหภูมิต่ำอย่างมีประสิทธิภาพในการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง:

  • การเก็บเกี่ยวเซลล์: เก็บเซลล์ในระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิธมิค โดยต้องมั่นใจว่าความมีชีวิตอยู่เกิน 90% ใช้ DMSO 10% เป็นสารป้องกันการแช่แข็ง แม้ว่ากลีเซอรีนจะเป็นทางเลือกสำหรับเซลล์ที่บอบบางมากขึ้น [11][1].
  • การทำความเย็นและการเก็บรักษา: รักษาอัตราการทำความเย็นที่ควบคุมได้และโอนขวดอย่างรวดเร็วไปยังการเก็บรักษาในไนโตรเจนเหลวในรูปแบบไอเพื่อปกป้องความสมบูรณ์ของเซลล์ [11]

การศึกษาของ Roka Kakehi et al. เน้นความสำคัญของความแม่นยำในการแช่แข็งเซลล์ [10]:

"การรับประกันแหล่งเซลล์ที่เชื่อถือได้และสม่ำเสมอโดยการใช้การแช่แข็งเซลล์จะช่วยให้เราสามารถเพิ่มปริมาณเซลล์ที่มีแนวโน้มสำหรับการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยงได้" - Roka Kakehi et al., Tokyo Women's Medical University

  • กระบวนการละลาย: ละลายเซลล์ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลาประมาณสองนาที หยุดเมื่อมีน้ำแข็งละลายไป 80% ซึ่งจะช่วยลดความเป็นพิษของ DMSO และปรับปรุงการฟื้นฟูเซลล์ [1]. ติดตามด้วยการตรวจสอบความมีชีวิตหลังการละลายเพื่อให้แน่ใจว่าประสบความสำเร็จและปรับปรุงขั้นตอนในอนาคต.

วิธีการเหล่านี้ทำงานร่วมกันกับการควบคุมคุณภาพที่เข้มงวดเสมอ ระบุขวดอย่างถูกต้อง รักษาบันทึกให้เป็นระเบียบ และดำเนินการตรวจสอบอย่างละเอียดก่อนการเก็บรักษาระยะยาว [11]. สำหรับความต้องการการเก็บรักษาในสภาพแช่แข็งที่เฉพาะเจาะจง แพลตฟอร์มเช่น Cellbase เชื่อมโยงนักวิจัยกับผู้จัดจำหน่ายที่เชื่อถือได้ของตู้แช่แข็งที่ควบคุมอัตรา ระบบเก็บรักษาในสภาพแช่แข็ง และเครื่องมือที่จำเป็นอื่น ๆ ที่ออกแบบมาสำหรับการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง.

คำถามที่พบบ่อย

ข้อดีของการใช้สื่อที่กำหนดทางเคมีสำหรับการเก็บรักษาเซลล์ในสภาพแช่แข็งในการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยงคืออะไร?

สื่อที่กำหนดทางเคมีมีประโยชน์หลายประการเมื่อพูดถึงการเก็บรักษาเซลล์ในสภาพแช่แข็งสำหรับการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง โดยการกำจัดส่วนประกอบที่ไม่ชัดเจน เช่น เซรั่มที่ได้จากสัตว์ พวกเขาช่วยให้ ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอและคาดการณ์ได้ - เป็นปัจจัยที่สำคัญสำหรับการรักษาความน่าเชื่อถือในระยะยาวของเซลล์.

ข้อได้เปรียบอีกประการหนึ่งคือความเสี่ยงที่ลดลงจากการปนเปื้อนและความแปรปรวน ซึ่งไม่เพียงแต่สนับสนุนมาตรฐานคุณภาพและความปลอดภัยที่สูงขึ้น แต่ยังสอดคล้องอย่างสมบูรณ์แบบกับความแม่นยำและความสามารถในการขยายตัวที่จำเป็นเพื่อตอบสนองความต้องการด้านกฎระเบียบและความคาดหวังของผู้บริโภคในอุตสาหกรรมเนื้อที่เพาะเลี้ยง

การเลือกสารป้องกันการแช่แข็งมีผลต่อการอยู่รอดของเซลล์ในระหว่างการแช่แข็งและการละลายอย่างไร?

การเลือกสารป้องกันการแช่แข็งเป็นปัจจัยสำคัญในการรักษาสุขภาพของเซลล์ในระหว่างการแช่แข็งและการละลาย ตัวเลือกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสองตัวคือ dimethyl sulfoxide (DMSO) และ glycerol ซึ่งแต่ละตัวมีลักษณะที่แตกต่างกัน DMSO เป็นที่รู้จักในด้านความสามารถในการซึมเข้าสู่เซลล์ได้อย่างรวดเร็วและให้การป้องกันที่แข็งแกร่ง อย่างไรก็ตาม มันมีข้อควรระวัง: ที่ความเข้มข้นสูงหรือเมื่อสัมผัสเป็นเวลานาน อาจทำให้เกิดความเป็นพิษซึ่งอาจลดความมีชีวิตของเซลล์

ในทางตรงกันข้าม กลีเซอรีนมีความเป็นพิษน้อยกว่าและสามารถนำไปใช้โดยตรงได้ข้อเสียของมันอยู่ที่อัตราการซึมผ่านของเซลล์ที่ช้ากว่า ซึ่งอาจส่งผลให้การป้องกันที่ได้ไม่ทันทีเท่ากับ DMSO.

การบรรลุความสมดุลที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ การปรับความเข้มข้นและระยะเวลาในการสัมผัสของสารป้องกันการแช่แข็งอย่างเหมาะสมช่วยปกป้องเซลล์ในขณะที่ลดความเสี่ยงของความเป็นพิษ นอกจากนี้ การปฏิบัติตามแนวทางที่ดีที่สุดสำหรับอัตราการทำความเย็นและสภาพการเก็บรักษาเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่ามีอัตราการฟื้นตัวที่สูงที่สุดหลังจากการละลาย.

ทำไมการควบคุมอัตราการทำความเย็นจึงสำคัญในระหว่างการแช่แข็ง?

การรักษาอัตราการทำความเย็นที่คงที่ ซึ่งปกติอยู่ระหว่าง –1°C ถึง –3°C ต่อ นาที เป็นกุญแจสำคัญในการรักษาเซลล์ให้มีชีวิต อุณหภูมิที่ลดลงอย่างค่อยเป็นค่อยไปช่วยให้เซลล์สามารถขจัดน้ำออกได้ในอัตราที่ควบคุมได้ ลดโอกาสในการเกิดผลึกน้ำแข็งที่เป็นอันตรายซึ่งอาจทำให้เยื่อหุ้มเซลล์ฉีกขาดหรือเสียหาย.

วิธีการที่มีการวัดนี้ช่วยปกป้องโครงสร้างของเซลล์ เพิ่มอัตราการอยู่รอดและการทำงานของเซลล์เมื่อถูกละลาย.การปฏิบัติตามโปรโตคอลการทำความเย็นอย่างแม่นยำเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้แน่ใจว่าการเก็บรักษาและการฟื้นฟูเซลล์สายพันธุ์ในระยะยาวประสบความสำเร็จ.

บทความบล็อกที่เกี่ยวข้อง

Author David Bell

About the Author

David Bell is the founder of Cultigen Group (parent of Cellbase) and contributing author on all the latest news. With over 25 years in business, founding & exiting several technology startups, he started Cultigen Group in anticipation of the coming regulatory approvals needed for this industry to blossom.

David has been a vegan since 2012 and so finds the space fascinating and fitting to be involved in... "It's exciting to envisage a future in which anyone can eat meat, whilst maintaining the morals around animal cruelty which first shifted my focus all those years ago"

ข้อมูลเชิงลึก & ข่าวสาร

ดูทั้งหมด
  • Spectroscopy Methods for Growth Media Analysis

    Spectroscopy Methods for Growth Media Analysis

    Spectroscopy offers a fast, accurate way to monitor growth media in cultivated meat production. By tracking nutrients like glucose and glutamine in real time, it helps optimise cell growth and...

  • Economic Modelling for Serum-Free Media Production

    Economic Modelling for Serum-Free Media Production

    Serum-free media (SFM) is critical for cultivated meat production, replacing animal-derived serum like FBS to address ethical concerns and regulatory demands. However, its high cost - often over 50% of...

  • Sterility Testing Methods for Bioreactors

    วิธีการทดสอบความปลอดเชื้อสำหรับเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ

    การทดสอบความปลอดเชื้อเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง ซึ่งแม้แต่การปนเปื้อนเล็กน้อยก็อาจนำไปสู่ความล้มเหลวของชุดการผลิตที่มีค่าใช้จ่ายสูง กระบวนการนี้ช่วยให้มั่นใจได้ว่าไม่มีจุลินทรีย์ที่เป็นอันตรายรบกวนการทำงานของเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ ปกป้องทั้งคุณภาพของผลิตภัณฑ์และความสามารถในการทำกำไร ด้วยอัตราการปนเปื้อนเฉลี่ย 11.2% - และเพิ่มขึ้นเป็น 19.5% สำหรับการผลิตขนาดใหญ่ ผู้ผลิตต้องเผชิญกับความท้าทายที่สำคัญในการรักษาสภาพแวดล้อมที่ปลอดเชื้อ ประเด็นสำคัญได้แก่: แหล่งที่มาของการปนเปื้อนหลัก: บุคลากร วัตถุดิบ และการดำเนินงานของเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพเป็นจุดเริ่มต้นทั่วไปสำหรับจุลินทรีย์ วิธีการทดสอบ: การกรองผ่านเยื่อสำหรับปริมาณมาก การฉีดตรงสำหรับตัวอย่างขนาดเล็ก และการทดสอบปริมาณจุลินทรีย์ระหว่างการผลิตเป็นที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลาย การตรวจสอบแบบเรียลไทม์: เครื่องมือเช่นเซ็นเซอร์ออกซิเจนที่ละลายและการวิเคราะห์ก๊าซที่ปล่อยออกมาช่วยให้สามารถตรวจจับกิจกรรมของจุลินทรีย์ได้ตั้งแต่เนิ่นๆ เทคโนโลยีที่เกิดขึ้นใหม่: การตรวจสอบด้วย AI, การฆ่าเชื้อด้วยพลาสมาเย็น, และระบบการถ่ายภาพอัตโนมัติ ช่วยให้การจัดการการปนเปื้อนรวดเร็วและแม่นยำยิ่งขึ้น สำหรับผู้ผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง การผสมผสานการทดสอบความปลอดเชื้อแบบดั้งเดิมกับโซลูชันการตรวจสอบขั้นสูงเป็นสิ่งสำคัญเพื่อลดความเสี่ยงและปรับปรุงประสิทธิภาพการผลิต...

  • How to Measure Scaffold Degradation in Bioreactors

    วิธีการวัดการเสื่อมสภาพของโครงสร้างในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ

    การเสื่อมสลายของโครงสร้างเป็นปัจจัยสำคัญในการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง มันต้องสอดคล้องกับการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อ: ถ้าเร็วเกินไป เซลล์จะสูญเสียการสนับสนุน; ถ้าช้าเกินไป การพัฒนาเนื้อเยื่อจะถูกขัดขวาง เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่มีการไหลแบบไดนามิก เร่งการเสื่อมสลายเมื่อเทียบกับการตั้งค่าคงที่ ปล่อยผลพลอยได้ที่เป็นกรดและเปลี่ยนโครงสร้างของโครงสร้าง การวัดที่แม่นยำช่วยให้มั่นใจในความสม่ำเสมอและคุณภาพในการขยายการผลิต ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญ: การเลือกวัสดุ: การผสมผสานเช่น PCL (การเสื่อมสลายช้า) และ PLGA (การเสื่อมสลายเร็วกว่า) ช่วยให้สามารถปรับแต่งได้ การตั้งค่าเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ: การไหลแบบไดนามิก (e.g., 4 mL/min) เลียนแบบสภาวะทางสรีรวิทยาแต่เร่งการไฮโดรไลซิส วิธีการวัด: การสูญเสียน้ำหนัก (การวิเคราะห์ด้วยวิธี gravimetric)....

  • Organoleptic Testing: Key Metrics for Cultivated Meat

    การทดสอบทางประสาทสัมผัส: ตัวชี้วัดสำคัญสำหรับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง

    การทดสอบทางประสาทสัมผัสมีความสำคัญสำหรับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงเพื่อเลียนแบบคุณสมบัติทางประสาทสัมผัสของเนื้อสัตว์ทั่วไป เมตริกที่สำคัญได้แก่: ความชุ่มฉ่ำ: วัดโดยใช้ Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) และการทดสอบการสูญเสียความชื้นระหว่างการปรุงอาหาร ความท้าทายรวมถึงการเลียนแบบปริมาณไขมันและการกักเก็บความชื้น ความนุ่ม: ประเมินด้วยการวิเคราะห์โปรไฟล์เนื้อสัมผัส (TPA) และแรงเฉือน Warner-Bratzler (WBSF) เนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการบรรลุเนื้อสัมผัสที่นุ่มขึ้น ความรู้สึกในปากและเนื้อสัมผัส: วิเคราะห์ผ่านวิทยาศาสตร์การไหลและความแข็งของโครงสร้าง ผลิตภัณฑ์ปัจจุบันขาดความซับซ้อนของเส้นใยของเนื้อสัตว์ที่เป็นชิ้นเต็ม รสชาติและกลิ่นหอม: เทคนิคเช่น GC-MS และจมูกอิเล็กทรอนิกส์ระบุสารประกอบสำคัญ เช่น สารจากปฏิกิริยา Maillard เพื่อเลียนแบบรสชาติเนื้อสัตว์ ในขณะที่เนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงยังคงมีปัญหาเรื่องความชุ่มฉ่ำและความซับซ้อนของรสชาติ ความก้าวหน้าในระบบการเพาะเลี้ยงร่วมและโครงสร้างที่เพิ่มรสชาติกำลังลดช่องว่างกับเนื้อสัตว์ทั่วไป...

  • Top QA Sensors for Bioreactor Monitoring

    เซ็นเซอร์ QA ชั้นนำสำหรับการตรวจสอบไบโอรีแอคเตอร์

    การผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงต้องการการควบคุมพารามิเตอร์สำคัญอย่างแม่นยำ เช่น ค่า pH อุณหภูมิ และระดับออกซิเจน แม้แต่การเบี่ยงเบนเล็กน้อยก็อาจนำไปสู่ผลผลิตที่ลดลง การปนเปื้อน หรือการสิ้นเปลืองทรัพยากร เซ็นเซอร์ QA มีบทบาทสำคัญในการรักษาสภาพเหล่านี้ ปรับปรุงความน่าเชื่อถือของกระบวนการ และรับรองการปฏิบัติตามมาตรฐานข้อบังคับ นี่คือภาพรวมอย่างรวดเร็วของเซ็นเซอร์ QA ชั้นนำสำหรับการตรวจสอบเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ: Cellbase: แพลตฟอร์ม B2B ที่คัดสรรมาเพื่อจัดหาเครื่องมือการตรวจสอบเฉพาะสำหรับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง ระบบสเปกโทรสโกปีรามัน: การวัดแบบเรียลไทม์ที่ไม่ต้องสัมผัสของเมตาบอไลต์หลายชนิดพร้อมกัน เซ็นเซอร์ก๊าซละลายและ pH: เซ็นเซอร์ดิจิตอลขั้นสูงสำหรับการติดตามออกซิเจน CO₂ และ pH อย่างแม่นยำ...

  • Cryopreservation Protocols for Cell Lines

    โปรโตคอลการแช่แข็งเซลล์สำหรับสายเซลล์

    การเก็บรักษาในสภาพแช่แข็ง เป็นกระบวนการแช่แข็งและเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตที่อุณหภูมิต่ำมากเพื่อรักษาความมีชีวิตของพวกมันในระยะยาว วิธีนี้มีความสำคัญต่อการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง โดยมั่นใจได้ว่าเซลล์มีเสถียรภาพและสม่ำเสมอ และป้องกันการสูญเสียจากการปนเปื้อนหรือความล้มเหลวของอุปกรณ์ ขั้นตอนสำคัญประกอบด้วย: การเตรียม: เก็บเซลล์ในระหว่างช่วงการเจริญเติบโต ตรวจสอบความมีชีวิต (ตั้งเป้า ≥90%) และเตรียมในสื่อแช่แข็งที่มีสารป้องกันการแช่แข็ง เช่น DMSO หรือกลีเซอรีน. การแช่แข็ง: ใช้อัตราการทำความเย็นที่ควบคุม (-1°C ถึง -3°C ต่อ นาที) เพื่อป้องกันความเสียหายจากผลึกน้ำแข็ง เก็บเซลล์ในไอน้ำไนโตรเจนเหลว (-135°C ถึง -190°C) เพื่อการเก็บรักษาระยะยาว. การละลาย: ละลายเซลล์อย่างรวดเร็วในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ...

  • Cultivated Meat Material Unit Converter

    ตัวแปลงหน่วยวัสดุเนื้อสัตว์เพาะเลี้ยง

    ทำให้การผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยงง่ายขึ้นด้วยเครื่องมือแปลงหน่วยของเรา ในโลกที่พัฒนาอย่างรวดเร็วของเนื้อที่เพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการ ความแม่นยำคือสิ่งสำคัญ ไม่ว่าคุณจะเป็นนักวิจัยหรือตำแหน่งผู้จัดการการผลิต การจัดการวัสดุมักหมายถึงการต้องจัดการกับหน่วยวัดที่แตกต่างกัน นั่นคือจุดที่ เครื่องมือแปลงวัสดุเนื้อที่เพาะเลี้ยงที่เชื่อถือได้เข้ามามีบทบาท มันช่วยทำให้กระบวนการเป็นไปอย่างราบรื่น ทำให้คุณสามารถมุ่งเน้นไปที่นวัตกรรมแทนที่จะต้องคำนวณตัวเลข ทำไมการแปลงหน่วยจึงสำคัญ จากการปรับปริมาตรของไบโอรีแอคเตอร์ไปจนถึงการวัดความเข้มข้นของสารอาหาร ภาคส่วนเนื้อที่เพาะเลี้ยงต้องการความแม่นยำ การคำนวณที่ผิดพลาดเล็กน้อยในน้ำหนักหรือความเข้มข้นสามารถทำให้ทั้งชุดผลิตภัณฑ์ผิดพลาด เครื่องมือของเราช่วยให้คุณสามารถสลับระหว่างหน่วยวัด เช่น ลิตรเป็นแกลลอนหรือ มก./ลิตรเป็นเปอร์เซ็นต์ได้อย่างง่ายดาย มันถูกออกแบบมาสำหรับมืออาชีพที่ต้องการผลลัพธ์ที่รวดเร็วและเชื่อถือได้โดยไม่ต้องยุ่งยากกับการแปลงด้วยมือเพิ่มประสิทธิภาพในกระบวนการทำงานของคุณ จินตนาการถึงการแปลงกิโลกรัมเป็นปอนด์หรือการขยายสูตรในไม่กี่วินาที นี่ไม่ใช่แค่การประหยัดเวลา—มันเกี่ยวกับการรับประกันความสม่ำเสมอในกระบวนการของคุณ สำหรับผู้ที่ทำงานกับโปรตีนทางเลือก การมีเครื่องมือแปลงที่เฉพาะเจาะจงเป็นสิ่งจำเป็น ลองใช้ดูและดูว่าหน้าที่ประจำวันของคุณจะราบรื่นขึ้นเพียงใดเมื่อมีการสนับสนุนที่เหมาะสมอยู่ในมือของคุณ. คำถามที่พบบ่อย ฉันสามารถแปลงหน่วยประเภทใดได้บ้างด้วยเครื่องมือนี้? คุณสามารถแปลงระหว่างหน่วยต่างๆ ที่ใช้กันทั่วไปในการผลิตเนื้อที่เพาะเลี้ยง สำหรับปริมาตร เปลี่ยนระหว่างลิตร มิลลิลิตร...