การแช่แข็งเซลล์ เป็นกระบวนการแช่แข็งและเก็บรักษาเซลล์ที่มีชีวิตที่อุณหภูมิต่ำมากเพื่อรักษาความมีชีวิตของเซลล์ในระยะยาว วิธีนี้มีความสำคัญต่อการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง เพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์มีความเสถียรและป้องกันการสูญเสียจากการปนเปื้อนหรือความล้มเหลวของอุปกรณ์ ขั้นตอนสำคัญได้แก่:
- การเตรียมการ: เก็บเกี่ยวเซลล์ในช่วงการเจริญเติบโต ตรวจสอบความมีชีวิต (เป้าหมายคือ ≥90%) และเตรียมเซลล์ในสื่อแช่แข็งที่มีสารป้องกันการแข็งตัวเช่น DMSO หรือกลีเซอรอล
- การแช่แข็ง: ใช้อัตราการทำความเย็นที่ควบคุมได้ (-1°C ถึง -3°C ต่อนาที) เพื่อป้องกันความเสียหายจากผลึกน้ำแข็ง เก็บเซลล์ในไอของไนโตรเจนเหลว (-135°C ถึง -190°C) สำหรับการเก็บรักษาระยะยาว
- การละลาย: ละลายเซลล์อย่างรวดเร็วในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เพื่อลดความเป็นพิษของสารป้องกันการแข็งตัว จากนั้นย้ายเซลล์ไปยังสื่อการเจริญเติบโตเพื่อการฟื้นตัว
- การควบคุมคุณภาพ: ติดฉลากขวดอย่างถูกต้อง ตรวจสอบสภาพการเก็บรักษา และทดสอบความมีชีวิตหลังการละลายเพื่อให้มั่นใจในการเก็บรักษาที่ประสบความสำเร็จ
ขั้นตอนการแช่แข็งเซลล์อย่างสมบูรณ์สำหรับสายเซลล์: กระบวนการ 4 ขั้นตอนจากการเตรียมการถึงการเก็บรักษา
การเตรียมเซลล์สำหรับการแช่แข็ง
การเก็บเกี่ยวเซลล์และการตรวจสอบความมีชีวิต
เพื่อให้มั่นใจในการฟื้นตัวที่ดีที่สุดหลังการละลาย ให้เก็บเกี่ยวเซลล์ในช่วงการเจริญเติบโตแบบลอการิทึม (log) สำหรับสายเซลล์ที่ยึดติด โดยทั่วไปจะเป็นเมื่อเซลล์มีความหนาแน่น 80–90% [2][3][6].
ตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้วิธี Trypan Blue exclusion ผสม Trypan Blue 0.4% กับสารแขวนลอยเซลล์ในอัตราส่วนเท่ากัน (1:1) จากนั้นนับเซลล์โดยใช้ haemocytometerเซลล์ที่มีชีวิตจะไม่ย้อมสีและจะปรากฏสว่างภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ในขณะที่เซลล์ที่ไม่มีชีวิตจะย้อมเป็นสีน้ำเงิน [4] โดยทั่วไป ควรตั้งเป้าหมายให้มีความมีชีวิตอย่างน้อย 90% เพื่อให้ได้อัตราการฟื้นตัวที่ดีที่สุด แม้ว่าบางโปรโตคอลอาจยอมรับขั้นต่ำที่ 75% [1][2][3][5].
ก่อนการเก็บเกี่ยว ใช้กล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบการปนเปื้อนของแบคทีเรียหรือเชื้อรา เซลล์แขวนลอยที่มีสุขภาพดีควรปรากฏสว่าง กลม และมีการหักเหแสงภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบอินเวอร์ทเฟสคอนทราสต์ [2][3].
เมื่อเซลล์มีมาตรฐานความมีชีวิตที่ต้องการแล้ว ให้ดำเนินการขั้นตอนก่อนการแช่แข็งต่อไป
การเตรียมก่อนการแช่แข็ง
สำหรับเซลล์ที่ยึดติด ใช้วิธีการแยกเซลล์อย่างอ่อนโยน เช่น ทริปซิน หรือ TrypLE Express และจำกัดเวลาการบ่มเพื่อหลีกเลี่ยงการทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ [5]. เตรียมเซลล์ที่ความเข้มข้น 1 × 10⁶ ถึง 1 × 10⁷ เซลล์/มล. ขึ้นอยู่กับสายเซลล์ [1][6]. ขณะทำการแบ่งส่วน ให้แน่ใจว่าสารแขวนลอยเซลล์ถูกผสมบ่อยๆ เพื่อรักษาการกระจายตัวที่สม่ำเสมอในหลอดแช่แข็ง [5].
รักษาสื่อแช่แข็งให้เย็นระหว่าง 2°C ถึง 8°C ระหว่างการระงับเพื่อช่วยลดความเป็นพิษของสารป้องกันการแข็งตัวก่อนที่กระบวนการแช่แข็งจะเริ่ม [5]. เมื่อเซลล์ถูกระงับในสื่อแช่แข็งแล้ว ให้ดำเนินการตามโปรโตคอลการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว [1]. ควรเก็บรักษาเซลล์ด้วยการแช่แข็งที่จำนวนการแบ่งเซลล์ที่ต่ำที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้เพื่อลดความเสี่ยงของการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมหรือการเปลี่ยนแปลงทางรูปร่าง [5][7].
การเลือกสารป้องกันการแข็งตัวและสื่อการแช่แข็ง
ตัวเลือกสารป้องกันการแข็งตัวและหน้าที่ของพวกมัน
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสารป้องกันการแข็งตัว โดยทั่วไปที่ความเข้มข้น 10% [2]. มันทำงานโดยการแทรกซึมเข้าไปในเยื่อหุ้มเซลล์และลดการก่อตัวของน้ำแข็งระหว่างการแช่แข็ง อย่างไรก็ตาม DMSO สามารถเป็นพิษต่อเซลล์ที่อุณหภูมิห้อง ดังนั้นการละลายอย่างรวดเร็วเป็นสิ่งสำคัญเพื่อลดการสัมผัสและเจือจางอย่างรวดเร็ว [1].
กลีเซอรอล ทำหน้าที่เป็นทางเลือกที่มีประโยชน์สำหรับสายเซลล์ที่ไวต่อ DMSO โดยทั่วไปใช้ในความเข้มข้นตั้งแต่ 5% ถึง 15% [8].มันมีประสิทธิภาพเป็นพิเศษสำหรับเซลล์ประเภทที่ DMSO อาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่ไม่ต้องการ [3] และมีแนวโน้มที่จะมีความเป็นพิษต่ำกว่าเมื่อเทียบกับ DMSO.
ในแอปพลิเคชันเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง โปรโตคอลการแช่แข็งแบบดั้งเดิมมักใช้ส่วนผสมของ 90% Fetal Bovine Serum (FBS) และ 10% DMSO [1] อย่างไรก็ตาม การพึ่งพาส่วนประกอบที่มาจากสัตว์จำกัดวิธีการเหล่านี้ในแง่ของการขยายขนาดและการอนุมัติตามกฎระเบียบ [9] เพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้ สื่อที่กำหนดทางเคมี - เช่น Synth-a-Freeze หรือ Recovery Cell Culture Medium - ให้ทางเลือกที่ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ สื่อเหล่านี้รักษาความมีชีวิตของเซลล์หลังการละลายสูงในขณะที่เอาชนะความท้าทายที่เกี่ยวข้องกับส่วนประกอบที่มาจากสัตว์ [9].
การเปรียบเทียบสื่อการแช่แข็ง
นี่คือการแยกแยะข้อดีและข้อจำกัดของสื่อการแช่แข็งต่างๆ ที่ใช้ในการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง:
| สื่อ | ข้อดี | ข้อเสีย | ความเหมาะสมกับเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO ใน FBS-DMEM | โปรโตคอลที่ได้รับการยอมรับ [1] | มีส่วนประกอบที่มาจากสัตว์; ความแปรปรวนของชุด [9] | ความสามารถในการขยายขนาดจำกัด |
| Synth-a-Freeze | กำหนดทางเคมี; คุณภาพสม่ำเสมอ; ปราศจากส่วนประกอบจากสัตว์ [9] | ต้นทุนเริ่มต้นสูงกว่า [9] | ใช่ |
| สื่อการเพาะเลี้ยงเซลล์ฟื้นฟู | ใช้งานง่าย; ออกแบบมาเพื่อการฟื้นตัวอย่างรวดเร็ว [9] | อาจต้องการการปรับแต่งสำหรับสายเซลล์เฉพาะ | ใช่ |
| กลีเซอรอล 10% ใน FBS | ทางเลือกสำหรับเซลล์ที่ไวต่อ DMSO [1] | พึ่งพาซีรั่มที่มีแหล่งกำเนิดจากสัตว์ [9] | ขยายขนาดได้จำกัด |
ในเดือนกุมภาพันธ์ 2023 นักวิจัยที่ มหาวิทยาลัยการแพทย์สตรีโตเกียว นำโดย Hironobu Takahashi ได้แสดงให้เห็นถึงความสำคัญของการเลือกสื่อแช่แข็งที่เหมาะสม การใช้ตัวเลือกเชิงพาณิชย์เช่น CELLBANKER 1 และ 2 พวกเขาประสบความสำเร็จในการแช่แข็งเซลล์กล้ามเนื้อโคหลักที่อุณหภูมิ –80°C ได้นานถึงหนึ่งปี น่าทึ่งที่เซลล์เหล่านี้ยังคงความสามารถในการเพิ่มจำนวนและแยกแยะเป็นเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อที่หดตัวได้ด้วยโครงสร้างซาร์โคเมียร์ที่สมบูรณ์หลังจากการละลาย [10] .
สำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง สื่อที่กำหนดทางเคมีและเป็นไปตามมาตรฐาน GMP กำลังได้รับความนิยมมากขึ้น ดังที่ STEMCELL Technologies เน้นย้ำ:
ในสาขาที่มีการควบคุมอย่างเข้มงวดเช่นการบำบัดด้วยเซลล์และยีน แนะนำให้ใช้สื่อการแช่แข็งที่ผลิตตามมาตรฐาน GMP และกำหนดไว้อย่างสมบูรณ์เพื่อให้มั่นใจว่าผลิตภัณฑ์ถูกผลิตและควบคุมอย่างสม่ำเสมอตามมาตรฐานคุณภาพ [9].
แพลตฟอร์มเช่น
ขั้นตอนการแช่แข็งและอัตราการทำความเย็น
ขั้นตอนการแช่แข็งทีละขั้นตอน
กุญแจสำคัญในการแช่แข็งที่ประสบความสำเร็จคือการรักษาอัตราการทำความเย็นที่คงที่ที่ -1°C ถึง -3°C ต่อนาที[2] กระบวนการที่ค่อยเป็นค่อยไปนี้ช่วยให้น้ำออกจากเซลล์อย่างช้าๆ ป้องกันการก่อตัวของผลึกน้ำแข็งภายในเซลล์ที่อาจทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แตก[1].
เริ่มต้นด้วยการปั่นเซลล์ที่ 150 x g เป็นเวลา 5 นาที[3] เมื่อปั่นเสร็จแล้ว ให้ระงับเซลล์ในสื่อแช่แข็งเย็นที่มี 10% DMSO ที่ความเข้มข้น 2–4×10⁶ เซลล์/มล. [3] เพื่อลดการสัมผัส DMSO ให้ดำเนินการอย่างรวดเร็วไปยังขั้นตอนถัดไป - การแช่แข็ง
แจกจ่ายสารแขวนลอยเซลล์ลงในหลอดแช่แข็งที่มีฉลากล่วงหน้า แต่ละหลอดควรระบุรายละเอียดที่จำเป็นอย่างชัดเจน เช่น ชื่อสายเซลล์ หมายเลขการผ่าน หมายเลขล็อต ความเข้มข้นของเซลล์ และวันที่แช่แข็ง[3] เมื่อเตรียมหลอดเสร็จแล้ว ก็ถึงเวลาที่จะเลือกและใช้เครื่องมือทำความเย็นที่เหมาะสม
อุปกรณ์และเทคนิคการทำความเย็น
วางหลอดลงในอุปกรณ์ทำความเย็นที่ควบคุมอัตราทันที ภาชนะสำหรับแช่แข็งแบบพาสซีฟ เช่น Nalgene "Mr Frosty" (ซึ่งใช้ไอโซโพรพานอล) หรือ Corning "CoolCell" เป็นตัวเลือกที่นิยม เครื่องมือเหล่านี้สามารถทำอัตราการทำความเย็นได้ประมาณ 1°C ต่อนาที เมื่อวางในตู้แช่แข็งที่ -80°C[2]
สำหรับการดำเนินงานขนาดใหญ่ที่ความสม่ำเสมอเป็นสิ่งสำคัญ เครื่องแช่แข็งที่ควบคุมอัตราการแช่แข็งได้เป็นตัวเลือกที่ดีที่สุด ตามที่ Sigma-Aldrich:
ECACC ใช้เครื่องแช่แข็งที่ควบคุมอัตราการแช่แข็งได้เป็นประจำ นี่เป็นวิธีที่น่าเชื่อถือและสามารถทำซ้ำได้มากที่สุดในการแช่แข็งเซลล์[3].
หลังจากประมาณ 24 ชั่วโมง ที่ -80°C ให้ย้ายหลอดไปยังเฟสไอของไนโตรเจนเหลว ซึ่งอุณหภูมิอยู่ระหว่าง -135°C และ -190°C สำหรับการเก็บรักษาระยะยาว[4] . หลีกเลี่ยงการเก็บเซลล์ที่ -80°C นานกว่าหนึ่งสัปดาห์ เนื่องจากอาจทำให้ความมีชีวิตของเซลล์ลดลง อุณหภูมิต่ำกว่า -135°C เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเก็บรักษาอย่างไม่มีกำหนด[2]. การใช้เฟสไอแทนเฟสของเหลวช่วยลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนข้ามในขณะที่ยังคงรักษาอุณหภูมิที่ต่ำเพียงพอ
โปรโตคอลการละลายและการฟื้นฟู
กระบวนการละลาย
การละลายเซลล์อย่างรวดเร็วเป็นสิ่งสำคัญเพื่อลดการสัมผัสกับสารป้องกันการแข็งตัวที่เป็นพิษและป้องกันไม่ให้ผลึกน้ำแข็งทำให้เกิดความเสียหาย ตรวจสอบให้แน่ใจว่าสวมหน้ากากป้องกันใบหน้าและถุงมือกันความร้อนเพื่อความปลอดภัย เริ่มต้นด้วยการนำขวดแช่แข็งออกจากไนโตรเจนเหลวและคลายฝาเล็กน้อยเพื่อปล่อยแรงดันที่สะสม จากนั้นขันฝาให้แน่นอีกครั้ง
วางขวดในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C โดยให้ฝาอยู่เหนือระดับน้ำ ปล่อยให้ละลายเป็นเวลา 1–2 นาที หรือจนกว่าจะเหลือผลึกน้ำแข็งเพียงเล็กน้อย เมื่อละลายแล้ว ให้เช็ดภายนอกของขวดด้วยแอลกอฮอล์ 70% เพื่อรักษาความปลอดเชื้อ
ถ่ายโอนเนื้อหาของขวดลงในหลอดที่มีสารอาหารที่อุ่นไว้ล่วงหน้า 5–10 มล. เติมสารอาหารอย่างช้าๆ เพื่อช่วยลดการช็อกออสโมติก หากคุณกำลังทำงานกับสายเซลล์แขวนลอย ให้ปั่นเซลล์แขวนลอยทันทีที่ 300 × g เป็นเวลา 5 นาที ที่ 4°Cขั้นตอนนี้ช่วยให้เซลล์ตกตะกอนและกำจัดสารป้องกันการแข็งตัว หลังจากการปั่นเหวี่ยง ให้ระงับเซลล์ในสื่อใหม่ สำหรับเซลล์ที่ยึดติด การปั่นเหวี่ยงมักไม่จำเป็น ให้หว่านเซลล์ลงในภาชนะเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมโดยตรงและกำจัด DMSO ที่เหลืออยู่ในระหว่างการเปลี่ยนสื่อครั้งแรก ซึ่งมักจะหลังจาก 24 ชั่วโมง
การประเมินหลังการละลาย
ทันทีหลังจากการละลาย ให้ตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์เพื่อให้แน่ใจว่าการฟื้นตัวประสบความสำเร็จ ใช้วิธีการยกเว้น Trypan Blue สำหรับการประเมินนี้ ในอุดมคติ ความมีชีวิตของเซลล์ควรเกิน 90% [11] แต่ขั้นต่ำ 75% ก็ยอมรับได้ หลังจาก 24 ชั่วโมง ให้ตรวจสอบเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์เพื่อยืนยันการยึดติด ประเมินความหนาแน่นของเซลล์ และตรวจสอบสัญญาณการปนเปื้อนใดๆ
ติดตามการตรวจสอบเซลล์ผ่านการผ่าน 1–3 เพื่อให้แน่ใจว่าการเพิ่มจำนวนเป็นปกติและพวกมันยังคงรักษาลักษณะที่คาดหวังไว้สำหรับเซลล์ไลน์ที่ฟื้นตัวช้ากว่า คุณสามารถปรับปรุงการอยู่รอดได้โดยการเพิ่มความเข้มข้นของเซรั่มโคในระยะเริ่มต้นเป็นประมาณ 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
การเก็บรักษาและความมีชีวิตในระยะยาว
สภาพและระยะเวลาการเก็บรักษา
เพื่อรักษาความมีชีวิตของเซลล์ไลน์ในระยะยาว จำเป็นต้องเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิต่ำกว่า -135°C [7][2]. สิ่งนี้จะช่วยให้พวกมันคงสภาพได้อย่างไม่มีกำหนด
วิธีที่แนะนำสำหรับการเก็บรักษาเซลล์ไลน์เนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงคือการใช้ไนโตรเจนเหลวในเฟสไอระเหย เทคนิคนี้จะรักษาอุณหภูมิระหว่าง -135°C ถึง -190°C ซึ่งเหมาะสำหรับการเก็บรักษาระยะยาวและให้ความปลอดภัยที่ดีกว่าการเก็บในเฟสของเหลว
หากคุณจำเป็นต้องเก็บเซลล์ที่ -80°C ควรจำกัดระยะเวลาไว้ที่ 24 ชั่วโมงถึงหนึ่งสัปดาห์ หลังจากนั้นความมีชีวิตของเซลล์อาจลดลงสำหรับการเก็บรักษาชั่วคราวที่อุณหภูมินี้ ให้ย้ายเซลล์ไปยังการเก็บรักษาในไนโตรเจนเหลวโดยเร็วที่สุด
ใช้หลอดเก็บแช่แข็งมาตรฐานที่ปลอดเชื้อ (1–2 มล.) ที่มีเกลียวภายในและโอริงสำหรับการเก็บรักษาอย่างปลอดภัย [4][5] ควรวางหลอดแช่แข็งที่ปิดสนิทในเฟสก๊าซแทนที่จะเป็นเฟสของเหลวของไนโตรเจนเพื่อลดความเสี่ยงของการระเบิดของหลอดในระหว่างการละลาย [5] นอกจากนี้ ควรตรวจสอบให้แน่ใจว่าภาชนะไนโตรเจนเหลวจำนวนมากถูกเก็บไว้ให้เต็มอย่างน้อยครึ่งหนึ่งเพื่อรักษาความปลอดภัย
สุดท้าย มาตรการควบคุมคุณภาพที่เข้มงวดเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์มีความมีชีวิตยาวนาน
การตรวจสอบคุณภาพ
เพื่อให้แน่ใจว่ามีความน่าเชื่อถือของสายเซลล์ที่เก็บไว้ ให้ปฏิบัติตามโปรโตคอลที่เข้มงวดสำหรับการควบคุมคุณภาพ เริ่มต้นด้วยการติดฉลากหลอดแต่ละหลอดอย่างถูกต้องด้วยฉลากที่ทนต่อไนโตรเจนเหลวรวมรายละเอียดที่จำเป็น เช่น อัตลักษณ์ของเซลล์ไลน์ หมายเลขล็อต หมายเลขพาสเสจ และวันที่แช่แข็ง รักษาฐานข้อมูลอิเล็กทรอนิกส์เพื่อบันทึกตำแหน่งที่แน่นอนของแต่ละหลอด ซึ่งช่วยลดเวลาที่ภาชนะเก็บต้องเปิด [7][2].
ก่อนที่จะเก็บชุดทั้งหมดในระยะยาว ทดสอบความมีชีวิตของหลอดหนึ่งหลังจากการเก็บในระยะสั้นในสภาพก๊าซ ขั้นตอนนี้ช่วยยืนยันว่ากระบวนการแช่แข็งประสบความสำเร็จและระบุปัญหาที่อาจเกิดขึ้น [4][7][2]. สำหรับสต็อกเซลล์ที่มีมูลค่าสูง ควรเก็บสำเนาไว้ที่สถานที่สำรองเพื่อป้องกันความล้มเหลวของอุปกรณ์หรือภัยพิบัติในท้องถิ่น [7][2].
ติดตั้งระบบตรวจสอบอุณหภูมิและสัญญาณเตือนในภาชนะเก็บทั้งหมดเพื่อตรวจจับระดับไนโตรเจนเหลวที่ต่ำ [7]. นอกจากนี้ ติดตั้งสัญญาณเตือนออกซิเจนในพื้นที่เก็บของ โดยตั้งค่าให้ทำงานที่ระดับออกซิเจน 18% (v/v) เพื่อลดความเสี่ยงจากการขาดอากาศหายใจสำหรับบุคลากรที่ทำงานกับไนโตรเจนเหลว [7][2].
วิดีโอโปรโตคอลการแช่แข็งเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
บทสรุปและข้อคิดสำคัญ
นี่คือการสรุปขั้นตอนและคำแนะนำที่สำคัญสำหรับการแช่แข็งที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง:
- การเก็บเกี่ยวเซลล์: เก็บเซลล์ในช่วงการเจริญเติบโตแบบลอการิทึม โดยให้แน่ใจว่าความมีชีวิตเกิน 90% ใช้ DMSO 10% เป็นสารป้องกันการแข็งตัว แต่กลีเซอรอลสามารถเป็นทางเลือกสำหรับเซลล์ที่บอบบางกว่า [11][1].
- การทำความเย็นและการเก็บรักษา: รักษาอัตราการทำความเย็นที่ควบคุมได้และย้ายขวดไปยังการเก็บรักษาในไนโตรเจนเหลวในเฟสไออย่างรวดเร็วเพื่อปกป้องความสมบูรณ์ของเซลล์ [11]
การศึกษาของ Roka Kakehi และคณะ เน้นย้ำถึงความสำคัญของความแม่นยำในการแช่แข็งเซลล์ [10]:
"การรับประกันแหล่งเซลล์ที่เชื่อถือได้และสม่ำเสมอโดยใช้การแช่แข็งเซลล์จะช่วยให้เราสามารถเพิ่มการจัดหาเซลล์ที่มีศักยภาพสำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงได้อย่างมั่นคง" - Roka Kakehi et al., Tokyo Women's Medical University
- กระบวนการละลาย: ละลายเซลล์ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C ประมาณสองนาที หยุดเมื่อ 80% ของน้ำแข็งละลายแล้ว เพื่อลดความเป็นพิษของ DMSO และปรับปรุงการฟื้นตัวของเซลล์ [1]. ติดตามด้วยการตรวจสอบความมีชีวิตหลังการละลายเพื่อให้แน่ใจว่าประสบความสำเร็จและปรับปรุงขั้นตอนในอนาคต.
วิธีการเหล่านี้ทำงานร่วมกันกับการควบคุมคุณภาพอย่างเข้มงวดเสมอ ติดฉลากขวดอย่างถูกต้อง รักษาบันทึกให้เป็นระเบียบ และดำเนินการตรวจสอบอย่างละเอียดก่อนการจัดเก็บระยะยาว [11] สำหรับความต้องการการแช่แข็งเฉพาะทาง แพลตฟอร์มเช่น
คำถามที่พบบ่อย
ข้อดีของการใช้สื่อที่กำหนดทางเคมีสำหรับการแช่แข็งเซลล์ไลน์ในการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยงคืออะไร?
สื่อที่กำหนดทางเคมีมีประโยชน์หลายประการเมื่อพูดถึงการแช่แข็งเซลล์ไลน์สำหรับการผลิตเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง โดยการกำจัดส่วนประกอบที่ไม่กำหนด เช่น เซรั่มที่มาจากสัตว์ พวกเขามั่นใจได้ถึง ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอและคาดการณ์ได้ - ปัจจัยสำคัญสำหรับการรักษาความน่าเชื่อถือในระยะยาวของเซลล์ไลน์
ข้อดีที่สำคัญอีกประการหนึ่งคือความเสี่ยงที่ลดลงของการปนเปื้อนและความแปรปรวน ซึ่งไม่เพียงแต่สนับสนุนมาตรฐานคุณภาพและความปลอดภัยที่สูงขึ้นเท่านั้น แต่ยังสอดคล้องอย่างสมบูรณ์แบบกับความแม่นยำและความสามารถในการขยายขนาดที่จำเป็นเพื่อตอบสนองความต้องการด้านกฎระเบียบและความคาดหวังของผู้บริโภคในอุตสาหกรรมเนื้อสัตว์ที่เพาะเลี้ยง
การเลือกใช้สารป้องกันการแข็งตัวมีผลต่อการอยู่รอดของเซลล์ระหว่างการแช่แข็งและการละลายอย่างไร
การเลือกใช้สารป้องกันการแข็งตัวเป็นปัจจัยสำคัญในการรักษาสุขภาพของเซลล์ระหว่างการแช่แข็งและการละลาย ตัวเลือกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสองตัวเลือกคือ dimethyl sulfoxide (DMSO) และ glycerol ซึ่งแต่ละตัวมีลักษณะเฉพาะ DMSO เป็นที่รู้จักในด้านความสามารถในการแทรกซึมเซลล์อย่างรวดเร็วและให้การปกป้องที่แข็งแกร่ง อย่างไรก็ตาม มันมาพร้อมกับข้อแม้: ที่ความเข้มข้นสูงหรือการสัมผัสเป็นเวลานาน มันอาจเป็นพิษได้ ซึ่งอาจลดความมีชีวิตของเซลล์
ในทางตรงกันข้าม glycerol มีความเป็นพิษน้อยกว่าและสามารถใช้ได้โดยตรงข้อเสียของมันอยู่ที่อัตราการแทรกซึมของเซลล์ที่ช้ากว่า ซึ่งอาจส่งผลให้การป้องกันไม่ทันทีเมื่อเทียบกับ DMSO.
การบรรลุสมดุลที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ การปรับความเข้มข้นและเวลาการสัมผัสของสารป้องกันการแข็งตัวอย่างเหมาะสมช่วยปกป้องเซลล์ในขณะที่ลดความเสี่ยงของความเป็นพิษ นอกจากนี้ การปฏิบัติตามแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับอัตราการทำความเย็นและสภาพการเก็บรักษาเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้แน่ใจว่าอัตราการฟื้นตัวสูงสุดหลังการละลาย.
ทำไมการควบคุมอัตราการทำความเย็นระหว่างการแช่แข็งจึงสำคัญ?
การรักษาอัตราการทำความเย็นที่คงที่ โดยปกติระหว่าง –1°C และ –3°C ต่อนาที เป็นกุญแจสำคัญในการรักษาเซลล์ให้มีชีวิต การทำความเย็นอย่างค่อยเป็นค่อยไปช่วยให้เซลล์ขาดน้ำในอัตราที่ควบคุมได้ ลดโอกาสการเกิดผลึกน้ำแข็งที่เป็นอันตรายซึ่งสามารถฉีกหรือทำลายเยื่อหุ้มเซลล์.
วิธีการที่วัดผลนี้ช่วยปกป้องโครงสร้างของเซลล์ เพิ่มการอยู่รอดและการทำงานของเซลล์เมื่อถูกละลาย.การปฏิบัติตามโปรโตคอลการทำความเย็นอย่างแม่นยำเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้มั่นใจถึงการเก็บรักษาและการฟื้นฟูสายเซลล์ในระยะยาวที่ประสบความสำเร็จ
