Önce düzenleyip sonra kontrol ederseniz, hedef dışı bir değişikliği klona düzeltebilirsiniz. İş akışını basit tutardım: en düşük riskli düzenleme yöntemini seçin, düzenleyici maruziyetini kısa tutun ve ardından hem tahmin edilen hedef dışı bölgeleri hem de klon kararlılığını serbest bırakmadan önce test edin.
Biyoproses mühendisleri, hücre kültürü bilimcileri ve yetiştirilmiş et Ar&Ge ekipleri için ana nokta basittir. CRISPR sistemleri, genellikle 3–6 uyumsuzluk toleransıyla, yakın eşleşme bölgelerinde kesmeye devam edebilir ve bu hatalar genişletilmiş tek hücreli klonlara taşınabilir. Makale, risk kontrolünü üç aşamaya ayırıyor: düzenleme öncesi, düzenleme sırasında, ve düzenleme sonrası.
İşte tam kontrol listesi basit terimlerle:
-
İş için en düşük riskli düzenleme aracını seçin
- Temel düzenleme veya öncelikli düzenleme kullanın, eğer düzenlemeyi çift sarmallı kırılma olmadan gerçekleştirebiliyorlarsa
- Sadece gen düzenlemesi gerekiyorsa dCas9 tabanlı modülasyon kullanın
- Eğer bir nükleaz gerekiyorsa, yüksek doğruluklu Cas9 varyantı ile başlayın
-
Başlangıç malzemesini güvence altına alın
- Hücre hattı kimliğini doğrulayın
- Mikoplazma kontrolü yapın
- Geçiş numarasını kaydedin
- Çalışma hattında gerçek hedef lokusu dizileyin, sadece referans genomu değil
-
Islak çalışmadan önce kılavuzları tarayın
- Hedef dışı araçları birlikte kullanın: hizalama tabanlı ve puanlama tabanlı
- Daha yüksek hedef aktivitesine sahip olan yerine, daha temiz bir hedef dışı profile sahip bir kılavuzu tercih edin
- Kılavuz uzunluğuna dikkat edin, %40–60 GC içeriği, ve homopolimer dizileri
-
Hücre içindeki maruziyeti sınırlayın
- Plazmid veya viral sistemler yerine mümkünse RNP veya mRNA teslimatını kullanın
- Minimum etkili dozu kullanın
- Transfeksiyon sonuçlarını zorlamak için editör kalıcılığını uzatmaktan kaçının
-
Daha yüksek riskli durumlar için ekstra kontroller ekleyin
- Çift nikazları değerlendirin
- Zamanlama önemli olduğunda indüklenebilir, ayrık-Cas9, veya ışık kontrollü sistemleri kullanın
- Gerektiğinde kapatma adımı olarak anti-CRISPR proteinleri ekleyin
-
Düzenleme sonrası doğru şekilde doğrulayın
- Öncelikle hedefe uygun düzenlemeyi onaylayın
- Her tahmin edilen hedef dışı bölgeyi hedeflenmiş amplicon NGS ile kontrol edin
- Proje riski daha yüksek olduğunda GUIDE-seq, CIRCLE-seq, CAST-seq, UDiTaS, veya WGS'ye geçin
- Base veya prime editörler , için ilgili yerlerde RNA düzeyinde kontroller ekleyin
-
Tek bir klonu sadece sekans ile serbest bırakmayın
- 2–3 bağımsız klonu karşılaştırın
- Düzenlenmemiş bir ebeveyn kontrolü kullanın
- Kararsızlık veya fenotip kayması olan klonları çıkarın
- Düzenleme durumu, hedef dışı tarama ve kayıtlar tamamlandığında serbest bırakın
Kısaca düşünmenin bir yolu: hedef dışı kesimleri önlemek için tasarla, hücre içindeki zamanı sınırlamak için teslim et, ardından proje riskinin gerektirdiği derinlikte doğrula. Bu, tüm parçanın içinden geçen ipliktir.
CRISPR Hedef Dışı Risk Kontrolü: Hücre Hattı Düzenlemesi için 3 Aşamalı Kontrol Listesi
Ön düzenleme kontrol listesi: düzenleme başlamadan önce riski azaltın
Düzenleme hedefini tanımlayın ve en düşük riskli düzenleme yöntemini seçin
Tek bir reaktif sipariş etmeden önce, düzenlemenin ne yapması gerektiği konusunda çok net olun. Bir knockout, bir knock-in, tek nükleotid değişikliği ve transkripsiyonel modülasyon aynı hedef dışı riski taşımaz. Ayrıca aynı aracı gerektirmezler.
Genel risk sırası basittir. Cas9 ve Cas12 gibi DSB oluşturan nükleazlar, büyük silinmeler, translokasyonlar ve DNA hasar yanıtlarını tetikleyebildikleri için riskin üst ucunda yer alır [1] [7]. Baz düzenleyiciler ve baş düzenleyiciler, çift sarmal kırılmalarını (DSB) önlemek ve yapısal varyasyon riskini azaltmak için nikazlar kullanır [1] [5]. Transkripsiyonel modülasyon için, dCas9 gibi epigenetik düzenleyiciler transkripsiyonel modifikasyonlarla birleştirilerek DNA dizisini değiştirmeden bırakır [1].
Pratik kural basittir: ihtiyacınız olan düzenlemeyi hala sağlayabilen en az genotoksik yöntemi kullanın. Tek nükleotid değişiklikleri için, CBEs veya ABEs, hala indel tanıtabilen HDR'den daha uygundur [3][1]. Yer değiştirmeler ve küçük eklemeler veya silmeler için, baş düzenleme genellikle standart CRISPR-Cas9'dan daha düşük hedef dışı aktivite gösterir [1] . Eğer bir nükleaz kullanmanız gerekiyorsa, SpCas9-HiFi, eSpCas9, veya SpCas9-HF1 gibi yüksek doğrulukta bir varyant seçin [1][6].
Düzenleme yaklaşımı belirlendikten sonra, çalışma hücre hattını ve kesin hedef dizisini kilitleyin.
Hücre hattı kimliğini, geçmişini ve hedef lokus dizisini doğrulayın
Eğer hücre hattı yanlış tanımlanmış veya çapraz kontamine olmuşsa, iş akışının geri kalanı sarsılmaya başlar. İyi tasarlanmış bir kılavuz RNA bile kötü başlangıç malzemesini kurtaramaz. Herhangi bir düzenleme başlamadan önce hücre hattı kimliğini kontrol edin. Aynı zamanda, mikoplazma durumunu doğrulayın ve mevcut pasaj numarasını kaydedin, çünkü yüksek pasajlı hücreler genomik kararlılığı ve düzenleme verimliliğini değiştirebilir [1][6].
Aynı derecede önemli olan, yalnızca bir referans genomuna güvenmeyin. Çalışma hücre hattındaki tam hedef lokusu dizileyin. Bu adım, kılavuz bağlanmasını engelleyebilecek veya yeni hedef dışı bölgeler oluşturabilecek SNP'leri veya indelleri belirlemenize yardımcı olur [1][6].
Ardından, kılavuz tasarımına geçin.
Reaktifleri seçmeden önce in silico hedef dışı tarama yapın
Hedef lokus onaylandıktan sonra, ıslak laboratuvar çalışmasına başlamadan önce aday kılavuz RNA'ları in silico olarak tarayın. Cas-OFFinder veya FlashFry, gibi hizalama tabanlı araçları ve CFD puanlama veya DeepCRISPR. gibi puanlama tabanlı araçları kullanın. İlk grup, dizi homolojisine sahip genomik bölgeleri bulmaya yardımcı olur. İkinci grup, bu bölgeleri tahmin edilen kesim olasılığına göre sıralamaya yardımcı olur [1] [5].
Kılavuzlar kısa listeye alındığında, hedef dışı profili daha temiz olan, ham hedefteki verimliliği geçmelidir. %70 hedefte verimliliğe sahip ve tahmin edilen hedef dışı olmayan bir kılavuz, %90 verimliliğe ve birkaç yüksek riskli siteye sahip olandan daha güvenli bir başlangıç noktasıdır [6]. Bazı ayarlarda, kılavuz uzunluğunu 20 bp'den 17-18 bp'ye kısaltmak, hedefteki doğrulukta çok fazla kayıp olmadan hedef dışı olayları 500 katına kadar azaltabilir [5]. %40 ile %60 arasında GC içeriği hedefleyin ve dört veya daha fazla aynı bazın ardışık gelmesinden kaçının [6][5].
Öyle olsa da, in silico taramanın sınırları vardır. Kromatin durumu, hücre döngüsü veya hücreye özgü bağlamı iyi hesaba katmaz [1][6][4]. Bunu bir filtre olarak düşünün, kanıt olarak değil.Deneysel doğrulamayı değiştirmez, ancak alanı daraltır.
En yüksek riskli tahmin edilen bölgeleri düzenleme ve doğrulama planına dahil edin.
sbb-itb-ffee270
Düzenleme kontrol listesi: kontrol editörü seçimi, teslimat ve maruz kalma
Yüksek özgüllüklü editörler ve iyi sıralanmış kılavuz RNA'lar kullanın
Tahmin edilen off-target kısa listesinden başlayın ve editörü seçmek için kullanın. Çoğu durumda, yüksek sadakatli bir SpCas9 varyantı - SpCas9-HiFi, eSpCas9 veya SpCas9-HF1 - vahşi tip SpCas9'dan daha iyi bir varsayılan seçenektir [6][1]. Vahşi tip SpCas9, üç ila beş baz çifti uyumsuzluğunu, özellikle PAM-uzak bölgesinde, tolere edebilir ve bu da hassas hücre hatlarında anlamlı off-target riski yaratır [3].
Burada basit bir kural yardımcı olur: Hala istenen düzenlemeyi sağlayan en az aktif yüksek sadakatli editörü kullanın.
Temel editörler için, bystander düzenlemeleri ve RNA hedef dışı etkilerini DNA hedef dışı riskinden ayrı olarak takip edin [1][8] . Bunlar farklı hata modlarıdır ve ayrı kontroller gerektirir. Düzenlemeyi çift sarmal kırılmalar olmadan, yapabiliyorsanız, baz düzenleme veya prime düzenleme daha yüksek riskli iş akışlarına daha iyi uyabilir [1][8].
Editör seçildikten sonra, bir sonraki iş, hücre içindeki süresini mümkün olduğunca kısa tutmaktır.
Geçici teslimat ve minimum etkili doz ile editör kalıcılığını sınırlayın
Editör kalıcılığı, editör seçimi kadar önemlidir.Editör hücrede ne kadar uzun süre aktif kalırsa, düşük olasılıklı bölgelerde hareket etme süresi o kadar fazla olur. Bu, teslimat formatını önemli bir kontrol noktası yapar.
Geçici teslimat yöntemlerini kullanın, örneğin RNP'ler veya mRNA, ve editör ifadesini uzatan plazmid DNA veya viral vektörlerden kaçının [1] [5]. Pratikte, RNP teslimatı varsayılan olmalıdır [6].
Doz da önemlidir. Yüksek nükleaz konsantrasyonu, düşük hassasiyetli hedef dışı bölgelerde kesilme olasılığını artırır [5]. Minimum etkili dozu. kullanın. Transfeksiyon verimliliği düşükse, sadece daha fazla reaktif ekleyip en iyisini ummayın. Bu genellikle sorunu çözmek yerine başka bir yere kaydırır.
Daha yüksek riskli iş akışları için hassasiyet önlemleri ekleyin
Bazı iş akışlarının ekstra koruma önlemlerine ihtiyacı vardır. Bu, özellikle onkogenler, tümör baskılayıcılar, veya p53-duyarlı hücre hatları, yakınındaki hedefler için geçerlidir, burada tek bir hedef dışı olayın büyük maliyeti olabilir [1][6][3].
Faydalı önlemler şunları içerir:
- Çift nikazlar, yakın kesim gerektirir. Tek bir hedef dışı nik genellikle mutasyon olmadan onarılır, bu nedenle hedef dışı risk standart nükleaz kurulumuna kıyasla çok düşer [4][1].
- İndüklenebilir, ışık kontrollü veya bölünmüş-Cas9 sistemleri, teslimat verimli olduğunda ve maruz kalma süresi kısa tutulması gerektiğinde düzenleyici aktiviteyi dar bir zaman aralığında tutmaya yardımcı olur [1].
- Anti-CRISPR (Acr) proteinleri, kapatma anahtarı olarak işlev görür. Doğal olarak oluşan bu Acr proteinleri, belirli bir süre sonra CRISPR-Cas kompleksini devre dışı bırakabilir, böylece düzenleyici aktivite üzerinde moleküler bir fren sağlar [1].
Düzenleme sonrası kontrol listesi: hedef dışı olayları tespit edin ve klonları doğrulayın
Tahmin edilen hedef dışı bölgeleri hedefli dizileme ile tarayın
Düzenleme tamamlandığında, önce hedef bölgedeki istenen değişikliği doğrulayın. Havuzlanmış hücrelerde hızlı bir ilk geçiş için, T7 Endonükleaz I, bir restriksiyon sindirimi veya bir flanking PCR gibi bir uyumsuzluk-kesme testi kullanabilirsiniz.Yorumlamada dikkatli olun: bu yöntemlerin her birinin, özellikle nadir düzenlemeler veya homozigot varyantlar için duyarlılık sınırları vardır [9].
Klon düzeyinde doğrulama için, hedeflenmiş amplikon NGS standarttır. Allel frekansının nicel bir görünümünü verir ve varyantları %0.01 ila %0.1 [3].
oranında tespit edebilir. Tahmin edilen her off-target bölgeyi hedeflenmiş amplikon NGS ile dizileyin. Bu, varsayılan doğrulama adımı olmalıdır.
Proje riski daha yüksek olduğunda genom çapında veya yapısal testlere geçin
Saha bazlı tarama her zaman yeterli değildir. Düzenleyici, hedef lokus veya hücre hattı gizli risk öneriyorsa, önceden tahmin etmediğiniz olayları tespit edebilecek testlere geçin.
Genom çapında keşif testleri GUIDE-seq ve CIRCLE-seq gibi önceden off-target site listelerine ihtiyaç duymaz.GUIDE-seq, indel frekansları %0.03 kadar düşük olan hedef dışı bölgeleri tespit edebilir [2]. CIRCLE-seq, hedef dışı bölgelerin %94 kadarını in vitro tanımlayabilir [3] . Bu yöntemler, hücre tipi bağlamının hedef dışı aktiviteyi maskeleyebileceği durumlarda faydalıdır.
Büyük yeniden düzenlemelerden endişe ediyorsanız, standart amplikon okumaları ana sorunu gözden kaçırabilir. Silinmeler, inversiyonlar ve translokasyonlar, CAST-seq ve UDiTaS gibi yapısal değişiklikler için tasarlanmış testlere ihtiyaç duyar [1].
Tüm genom dizilemesi (WGS) en geniş seçenektir. Genom genelinde indelleri, yapısal varyasyonları ve kopya numarası değişikliklerini tespit edebilir [1]. Takas derinlik ve maliyetle ilgilidir: genellikle 20–60× kapsama alanı gerektirir, bu da onu toplu popülasyonların rutin taraması için kötü bir seçenek yapar [1].
Tahmin edilen bölgeler için hedeflenmiş amplicon NGS kullanın. Daha yüksek riskli projeler için genom çapında veya yapısal testlere geçin. Baz veya prime editörler için, RNA düzeyindeki hedef dışı etkileri kontrol etmek için RNA-seq ekleyin.
Birden fazla bağımsız klon seçin ve serbest bırakma kriterlerini belgeleyin
Dizi kontrollerinden sonra, fenotipi birden fazla klonda test edin.
Tek bir düzenlenmiş klonla ilerlemeyin. En az iki ila üç bağımsız klonal popülasyonu izole edin ve genişletin ve bunları düzenlenmemiş ebeveyn kontrolü ile karşılaştırın [4][9]. Kararsızlık veya fenotip kayması gösteren klonları çıkarın [3]. Daha sonra hedeflenen amplicon NGS kullanarak, heterozigot veya homozigot olsun, gerekli allel durumunda planlanan düzenlemeyi onaylayın [9].
Dokümantasyon, sonunda yapılan bir yönetici işi değildir. Klon serbest bırakmanın bir parçasıdır. Parental hat arka planını, sgRNA tasarımını, nükleaz varyantını, teslimat yöntemini ve tüm QC sonuçlarını kaydedin [3]. Bir klon, planlanan düzenleme onaylandığında, tahmin edilen off-target siteler net olduğunda ve tam kayıt yerinde olduğunda ancak ilerlemelidir.
Genome Editing with CRISPR: Off-Target Etkilerini Etkili Bir Şekilde Minimize Etme Yöntemleri
Sonuç: Daha temiz hücre hattı düzenlemeleri için üç aşamalı kontrol listesi
Bir araya getirildiğinde, kontrol listesi off-target kontrolünü tek seferlik bir QC kontrolü olarak değil, aşamalı bir süreç olarak ele alır. Amaç basittir: riski erken kesmek, düzenleyici aktiviteyi sınırlamak ve ardından sonucu doğrulamak.
Doğrulama derinliği riske uygun olmalıdır. Yalnızca hedeflenen alel durumunda onaylanmış birden fazla bağımsız klon serbest bırakılmalıdır.
SSS
Neden tek bir klona güvenilmez?
Tek bir klona güvenmek risklidir. CRISPR düzenlemesi mükemmel derecede spesifik değildir, bu nedenle istenmeyen hedef dışı mutasyonlar oluşturabilir.
Bu yüzden ekipler genellikle birden fazla klonal popülasyonu genişletir. Bunu yapmak, zararlı hedef dışı değişiklikler olmadan istenen hedef düzenlemesini taşıyan bir hattı bulmayı kolaylaştırır.
Başka bir neden daha var: hücre hatları genetik heterojenlik gösterebilir. Birden fazla klonun dizilenmesi, hedef lokuslarda istenen homozigot knockout veya diğer hedef bölge modifikasyonunun mevcut olduğunu doğrulamaya yardımcı olur.
Amplicon NGS ne zaman yeterlidir?
Amplicon tabanlı yeni nesil dizileme, genellikle hesaplama araçları veya diğer tarama yöntemleri tarafından işaretlenen potansiyel hedef dışı bölgeleri doğrulamak için hedefe yönelik ve maliyet etkin bir yol gerektiğinde yeterlidir.
Tüm genom dizilemesi, hedef dışı etkileri tam olarak ölçmenin tek yoludur. Ancak birçok uygulama için bu düzeyde bir analiz gerekli değildir.
En güvenli editörü nasıl seçerim?
Hedef bölgenizi iyi kesen en az aktif CRISPR nükleaz varyantını seçin.
En iyi varyantı sadece tahminle seçemezsiniz. Tek güvenilir yol, seçilen nükleaz varyantları arasında küçük bir tarama yapıp düzenlemeyi yeni nesil dizileme ile okumaktır..
Yetiştirilmiş et AR&GE için, size pratik bir yol sunar: kısa bir varyant listesiyle başlayın, ardından hedef bölgeyi verimli bir şekilde düzenlemeye devam eden en az aktif seçeneği bulana kadar zayıf olanları adım adım test edin.
