Hassas pH seviyelerini korumak, kültür et üretimi için kritik öneme sahiptir. Memeli hücreleri dar bir pH aralığında (7.1–7.4) gelişir, ancak metabolik asidifikasyon, CO₂ birikimi ve karıştırma zorlukları, özellikle büyük ölçekli biyoreaktörlerde pH kontrolünü karmaşık hale getirir. Etkili stratejiler şunları içerir:
- Gaz püskürtme: Fazla CO₂'yi osmolaliteyi artırmadan veya lokalize pH dalgalanmalarına neden olmadan giderir.
- Gelişmiş sensörler: Potansiyometrik sensörler paslanmaz çelik sistemler için yüksek doğruluk sunarken, optik sensörler tek kullanımlık biyoreaktörlerle iyi çalışır.
- Buffer optimizasyonu: HEPES gibi tamponların eklenmesi stabiliteyi artırır ancak aşırı laktat üretimini önlemek için dikkatli bir denge gerektirir.
- Otomatik sistemler: Geri bildirim döngüleri kullanarak gerçek zamanlı ayarlamalar, tutarlı pH seviyelerini sağlar.
Bu yaklaşımlar, laktik asit birikimi ve kesme gerilimi gibi zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olarak hücre sağlığını ve ürün verimlerini artırır.
Biyoproseste pH Ölçümlerini Anlamak
pH Yönetiminde Ana Zorluklar
Bu bölüm, daha önce tartışılan zorluklara dayanarak pH dengesizliğine katkıda bulunan ana faktörleri inceler.
Metabolik Asidifikasyon ve Laktik Asit Birikimi
Laktik asit, kültive edilmiş et biyoprosesinde büyük bir engeldir. Hücreler glikozu glikoliz yoluyla metabolize ederken, 1:1 oranında laktat ve hidrojen iyonları üretirler. Bu süreç önemli bir asit yükü oluşturur ve laktatı ortam asidifikasyonunun birincil itici gücü yapar [1].
Standart kültür medyasının tamponlama kapasitesi - tipik olarak pH birimi başına 1.1 ve 1.6 mM arasında [1] - genellikle hızlı hücre büyüme dönemlerinde yetersiz kalır.Hücreler çoğaldıkça, metabolik atık çıkışları artar ve bu da ortamın stabil bir pH seviyesini koruma yeteneğini aşar. Bu aşamada pH'daki keskin düşüş, doğrudan glikolitik laktik asit üretimine [1] atfedilebilir ve laktatın ortamın pH'sını istikrarsızlaştırmadaki önemli rolünü vurgular.
Komplikasyonlar burada bitmiyor. CO2 birikimi başka bir karmaşıklık katmanı ekler.
CO2 Birikimi ve pH Kayması
Hücresel solunum, ortama CO2 ekler ve burada çözünerek karbonik asit oluşturur. Ana sorun, çözünmüş CO2'nin kısmi basıncıdır (pCO2), bu da CO2'nin hücrelerden kaçıp kaçamayacağını etkiler. Ortamdaki pCO2 seviyeleri çok yükseldiğinde, CO2 hücrelerin içinde sıkışır, bu da hücre içi pH'da tehlikeli bir düşüşe neden olur ve sonunda hücre ölümüne yol açar [2].
"Eğer pCO2 çok yüksekse, CO2 hücrelerden ayrılamaz, bu nedenle hücre içi pH düşer ve hücreler ölür." - Alicat Scientific [2]
Bu sorun, büyük ölçekli biyoreaktörlerde daha belirgin hale gelir. Bu sistemler, daha küçük kaplara kıyasla CO2 gazının uzaklaştırılma verimliliğini azaltan daha düşük bir yüzey alanı-hacim oranına sahiptir [3]. Medyanın bir CO2 inkübatörüne transferi gibi rutin işlemler bile pH dalgalanmalarına neden olabilir. Örneğin, küçük medya hacimleri neredeyse anında alkalileşmeye başlar ve bu süreç 2-3 saatlik bir zaman sabitine sahiptir [1].
Kimyasal zorlukların yanı sıra, fiziksel süreçler de pH kararsızlığında önemli bir rol oynar.
Karıştırma ve Kesme Geriliminin pH Kararlılığı Üzerindeki Etkileri
pH'ı bir baz ekleyerek ayarlamak kendi risklerini de beraberinde getirir.Sodyum bikarbonat veya benzer bazlar biyoreaktörlere pompalandığında, kötü karışım, yakınlardaki hücrelere zarar veren yüksek pH'lı lokalize bölgeler oluşturabilir [2] [3]. Öte yandan, bazı eşit şekilde dağıtmak için gereken güçlü karıştırma, hem kırılgan memeli hücrelerine zarar veren kesme gerilimine hem de köpük oluşumuna yol açabilir [2] [3].
Kontrollü deneylerde, pH'ı stabilize etmek için baz eklenmesi, artan osmolalite nedeniyle genellikle hücre canlılığını azalttı [3]. Bu, zor bir denge oluşturur: yetersiz karışım pH sıcak noktalarına yol açarken, aşırı karışım sıcak noktaları önler ancak mekanik stresi artırır. Sorun, daha uzun karışım sürelerinin etkili pH kontrolünü hücre sağlığını tehlikeye atmadan sürdürmeyi zorlaştırdığı ölçek büyütme sırasında daha da zorlaşır.
pH İzleme ve Kontrol Teknolojileri
Memeli hücre kültürleri için pH'ı 7.1–7.4 aralığında tutmak kritik öneme sahiptir ve bu, hassas ve güvenilir izleme araçları gerektirir [2]. Potansiyometrik sensörler, serbest hidrojen iyonlarını ölçen elektrotlar olarak hareket eder ve biyoreaktörlerde sürekli pH izleme için altın standarttır [1]. Bu sensörler, otomatik sistemlerin gerekli pH seviyelerini korumak için anında ayarlamalar yapmasına olanak tanıyan gerçek zamanlı veriler sağlar. Yüksek doğrulukları, büyük ölçekli operasyonlar için onları vazgeçilmez kılar. Bunların yanı sıra, optik göstergeler pH ölçümü için başka bir etkili yol sunar.
Optik göstergeler, kantitatif pH ölçümleri sağlamak için spektroskopik analize dayanır.Fenol kırmızısı genellikle görsel bir gösterge olarak kullanılırken, daha hassas okumalar, 560 nm ve 430 nm olmak üzere iki belirli dalga boyundaki absorbansın oransal analizi ile elde edilir [1] . Bu yöntem, ortam hacmi veya boya konsantrasyonu gibi faktörleri telafi ederek tutarlı ve doğru sonuçlar sağlar.
"Serbest H+ iyonlarının konsantrasyonunu tahmin etmek sezgisel değildir, ancak elektrotlar veya gösterge boyaları ile ölçmek şans eseri basittir (e.g." - Johanna Michl ve diğerleri, Oxford Üniversitesi [1]
Modern pH kontrol sistemleri, bu ölçümleri otomatik geri besleme döngülerine entegre ederek pH seviyelerini dinamik olarak düzenlemenin ötesine geçer.
Otomatik geri besleme sistemleri, manuel müdahale gereksinimini ortadan kaldırarak gerçek zamanlı ayarlamalar yapmak için sensör verilerini kullanır. Bu sistemler, pH'ı bir baz ekleyerek veya gaz püskürtme tekniklerini kullanarak ayarlayabilir [2].Büyük ölçekli biyoreaktörler için gaz püskürtme özellikle etkilidir. Kütle akış kontrol cihazları kullanılarak, CO2 seviyeleri hızlı ve eşit bir şekilde ayarlanabilir, bu da uniform pH düzenlemesini sağlar [2]. Buna karşılık, baz pompalama, daha küçük sistemler için etkili olsa da, lokalize pH dengesizlikleri yaratabilir ve osmolaliteyi artırabilir, bu da onu daha büyük kaplar için daha az pratik hale getirir [2]. Ancak, gaz püskürtme, hücrelere zarar verebilecek kayma stresinden kaçınmak için püskürtücülerin tasarımına dikkat edilmesini gerektirir [2]. Kültür et üretiminde olanlar için, gelişmiş gaz kontrol sistemlerine yatırım yapmak, daha iyi hücre sağlığı ve daha yüksek verimlere yol açabilir, bu da onu değerli bir harcama haline getirir.
sbb-itb-ffee270
pH Yönetimi için Ölçeklendirme Stratejileri
Yetiştirilen Et Biyoreaktörleri için Potansiyometrik ve Optik pH Sensörleri
Potansiyometrik ve Optik Sensörler: Bir Karşılaştırma
Yetiştirilen et üretimi ölçeklendikçe doğru sensör teknolojisini seçmek giderek daha önemli hale gelir. Potansiyometrik sensörler, hassasiyetleri ve hızlı tepkileri nedeniyle paslanmaz çelik biyoreaktörler için tercih edilen seçenektir. Ancak, düzenli kalibrasyon ihtiyacı ve uzun süreli süreçlerde sapma eğilimi gibi zorluklarla birlikte gelirler. Jacob Crowe,
"Zamanla, pH ölçümleri sapabilir, bu da sürecin kararlılığını ve performansını etkiler.pH kaymasını izlemek ve hafifletmek, hem metabolizma hem de genel süreç üzerinde zararlı etkileri önlemek için hayati önem taşır" [8].
Öte yandan, optik sensörler, özellikle tek kullanımlık biyoreaktör sistemleri için pratik bir seçenek olarak ortaya çıkmaktadır. Bu sensörler, tek kullanımlık torbalara önceden monte edilebilir, bu da kontaminasyon risklerini azaltır ve döngüler arasında sterilizasyon ihtiyacını ortadan kaldırır [7]. Mikroakışkan sistemlerde, optik sensörler, 262,500 hücre/mL yoğunlukta %95.45 hücre canlılığı elde ederek etkili sonuçlar göstermiştir [9].
| Özellik | Potansiyometrik Sensörler | Optik Sensörler |
|---|---|---|
| Doğruluk | Yüksek, ancak kayma eğilimli | Yüksek; gerçek zamanlı izleme için ideal |
| Bakım | Sık kalibrasyon gerektirir | Minimal; genellikle tek kullanımlık |
| Ölçeklenebilirlik | Paslanmaz çelik kurulumlar için standart | Tek kullanımlık ve mikroakışkanlar için harika |
| Tepki Süresi | Hızlı, elektrot kararlılığı ile sınırlı | Anında gerçek zamanlı geri bildirim |
| Maliyet Etkileri | Daha yüksek işçilik ve bakım maliyetleri | Daha düşük işçilik; tek kullanımlıklara entegre edilmiş |
Sensör seçimi büyük ölçüde reaktör tipine bağlıdır.Paslanmaz çelik biyoreaktörler, sürüklenmeyi yönetmek için önlemlerle potansiyometrik sensörlerden faydalanabilirken, tek kullanımlık platformlar entegre optik sensörlerin kolaylığından yararlanabilir. Bu kararlar, ortam optimizasyonu sırasında pH stabilitesinin nasıl sürdürüleceğini doğrudan etkiler. Ortam Optimizasyonu ve Tampon İyileştirmeleri Uygun sensörler yerleştirildikten sonra, kültür ortamının tamponlama sistemini stabilize etmek, ölçek büyütme sırasında pH kontrolünü sürdürmek için esastır. Memeli hücreleri, CO₂/HCO₃⁻ tampon sistemine (pKa 6.15, 37°C'de) bağlıdır, ancak tamponlama kapasitesi genellikle yetersizdir. Örneğin, standart DMEM %10 FBS ile tipik olarak sadece 1.1 ila 1.6 mM tamponlama sağlar. Bunu ele almak için, HEPES gibi uçucu olmayan tamponlar (NVB'ler) eklemek.3 at 37°C) önemli ölçüde tamponlama gücünü artırabilir ve problemli osmolalite değişimlerine neden olmadan [1]. Önerilen yöntem, önce ortamı hedef pH'a titrasyon yaparak ayarlamak, ardından inkübatörün pCO₂'si ile uyumlu bir konsantrasyonda NaHCO₃ eklemektir. Bu yaklaşım, taze medyanın CO₂'ye maruz kaldığında meydana gelen başlangıç pH kaymasını azaltır, bu süreç NVB'lerle iki saate kadar sürebilir [1].
Ancak, daha güçlü tamponlama sistemleri artan glikolizi tetikleyebilir ve bu da daha yüksek laktat üretimine yol açabilir. Bazı hücre hatlarında, glikozun %90'ına kadar olan kısmı doğrudan laktata dönüştürülür [1] ve geliştirilmiş tamponlama bazen bu etkiyi artırarak daha fazla laktik asit birikimine neden olabilir [10].
Gaz Karıştırma ve Karıştırma Teknikleri
Gaz karıştırma, büyük ölçekli kültive edilmiş et üretiminde pH yönetimi için pratik bir yol sunar.Alicat Scientific notları:
"Gaz kabarcıkları, spargerlerden, bazdan daha hızlı ve çok daha az karıştırma ile eşit şekilde karıştırılabilir ve dağıtılabilir" [2].
Gaz kabarcıklarını eşit şekilde dağıtarak, sparging kimyasal baz eklemelerinden daha tutarlı bir yaklaşım sağlar. Örneğin, 2018 yılında yapılan bir çalışma, baş boşluğu havalandırmasını artırırken sabit sparge oranlarını korumanın, 30 L'den 250 L'ye ölçek büyütme sırasında titrelerin sabit kalmasını sağladığını gösterdi [2].
1–4 mm çapında kabarcıklar üreten makro spargerler, kültürden fazla CO₂'yi çıkarmada özellikle etkilidir. Bu, pH'ı doğal olarak yükseltir ve osmolaliteyi artırabilecek kimyasal bazlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır [2] [5]. Daha yeni bir "sadece gaz" pH kontrol stratejisi, otomatik hava sparging geri besleme döngüleri kullanır.pH düştüğünde, daha fazla CO₂'yi uzaklaştırmak için hava akışı artar. Bu yöntem, ambr®250 biyoreaktörlerinden 200 L kaplara başarıyla ölçeklendirilmiş ve beslemeli kesikli kültürler boyunca hassas pH seviyeleri korunmuştur [6].
Verimli gaz transferini minimal kesme stresi ile dengelemek, ölçek büyütme sırasında kritik bir zorluk olmaya devam etmektedir. Gazla çalışan dolaşım kullanan hava kaldırmalı biyoreaktörler, daha az kesme stresi ile daha nazik bir karıştırma seçeneği sunar. Hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) simülasyonları, biyoreaktör tasarımlarının ölçek büyütmeden önce optimize edilmesine olanak tanıyarak, çark bıçakları yakınındaki yüksek kesme bölgelerini de belirlemeye yardımcı olabilir [4]. Bu yaklaşımların
pH Kontrol Ekipmanlarını Cellbase üzerinden Tedarik Etme
Tedarik İçin Neden Cellbase Tercih Edilmeli?
Kültür et biyoprosesinde hassas pH kontrolü esastır, bu nedenle doğru ekipmanın tedarik edilmesi çok önemlidir. Genel laboratuvar tedarik platformları, bu alandaki dar pH aralıkları için gereken uzmanlıktan genellikle yoksundur.
pH Kontrol Teknolojilerini Bulma Cellbase
Yükseltme için, platform, verimli gaz bazlı pH yönetimi için kritik olan kütle akış kontrolörlerine ve özel spargerlere erişim sağlar. Alicat Scientific'in vurguladığı gibi:
"pH'ı sağlıklı biyolojik seviyelerde tutmak, ürün titrelerini artırmak için yukarı akış biyoprosesinde potansiyel olarak en güçlü araçtır" [2] .
Ayrıca,
Satın alma uzmanları, otoklavlanabilir CO₂ sensörleri ve tek kullanımlık pH probları dahil olmak üzere CO₂ sıyırma ekipmanlarını da temin edebilir. Bu araçlar, hassas pH kontrolünü sürdürmek için ölçeklenebilir stratejileri destekler ve gelişmiş pH yönetimini büyük ölçekli üretime entegre etmeyi kolaylaştırır [11]. Hedefe yönelik çözümler sunarak,
Sonuç: Yetiştirilen Et Biyoprosesinde pH Kontrolü için En İyi Uygulamalar
Yetiştirilen et üretiminde memeli hücrelerinin hayatta kalması için 7.1 ila 7.4 pH aralığını korumak kritiktir [2]. pH'ı bu aralıkta tutmak, yukarı akış biyoproses sırasında ürün verimlerini artırmada önemli bir rol oynar.
pH kontrolü zorluklarını ele almak için birkaç etkili uygulama ortaya çıkmıştır. Öne çıkan bir yöntem, ölçek büyütme sırasında baz eklemek yerine gaz püskürtme kullanmaktır. Gaz püskürtme, fazla CO₂'yi eşit bir şekilde dağıtarak ve minimum karıştırma ile etkili bir şekilde uzaklaştırır, bu da pH tutarsızlıkları ve osmolalite dalgalanmaları gibi sorunları önlemeye yardımcı olur [2] . Aryogen Pharmed tarafından 2021 yılında yapılan bir çalışma, bu yöntemin 250 litrelik bir ölçekte başarı sağladığını ve nihai ürün veriminde %51 artış elde edildiğini göstermiştir [3].
Diğer önemli bir uygulama ise doğrudan pH izleme olup, yalnızca pCO₂ ölçümlerine güvenmek yerine kültür sağlığı hakkında daha kapsamlı bir anlayış sağlar. Bu özellikle önemlidir çünkü çözünmüş CO₂ seviyeleri, belirli hücre hatlarında glikoz metabolizmasının %90'ına kadarını oluşturabilen laktik asit birikimini hesaba katmaz [1]. Metabolik aktivitenin zirveye ulaştığı üstel büyüme aşamasında pH'ı doğrudan izlemek daha da kritik hale gelir.
HEPES gibi uçucu olmayan tamponlar için tampon dengesi dikkate alınmalıdır. HEPES tamponlarının stabilize olması iki saate kadar sürebilir ve dikkatlice bikarbonat ve CO₂ ile titre edilmelidir [1]. Ancak, tamponlama kapasitesinin artırılması, istenen dengeleyici etkiyi engelleyebilecek laktat üretimini istemeden artırabilir [1] . Sensör tabanlı izleme ve gaz püskürtme teknikleriyle birleştirildiğinde, bu tampon değerlendirmeleri kararlı ve optimal süreç koşullarını korumaya yardımcı olur.
SSS
Gaz püskürtme, kültür eti üretiminde pH kontrolünü nasıl destekler?
Gaz püskürtme, kültür eti üretimi sırasında pH seviyelerinin dengede tutulmasında önemli bir rol oynar. Hücreler büyüdükçe, solunumun bir yan ürünü olarak karbondioksit (CO₂) salgılarlar. Bu CO₂, kültür ortamının pH'ını düşürebilir ve hücre sağlığına zarar verebilir. Hava, oksijen veya inert gazlar gibi gazları biyoreaktöre sokarak, püskürtme fazla CO₂'yi uzaklaştırmaya yardımcı olur. Bu, ortamın aşırı asidik hale gelmesini önler ve pH'ı sabit tutar.
Kültür ortamını yaklaşık 7.1 ila 7.4 arasındaki ideal pH aralığında tutmak, sağlıklı hücre büyümesi ve verimliliği için çok önemlidir. Tamponlama sistemleri ve pH sensörleri kullanılarak yapılan gerçek zamanlı izleme ile birleştirildiğinde, gaz püskürtme sadece süreç verimliliğini artırmakla kalmaz, aynı zamanda hücre canlılığını da artırır. Kültür eti biyoprosesinin başarısını sağlamak için kritik bir bileşendir.
Potansiyometrik sensörler, kültür et üretiminde pH izleme için optik sensörlerden daha iyi bir seçim yapan nedir?
Potansiyometrik sensörler, gerçek zamanlı pH ölçümleri sağlama yetenekleri sayesinde kültür et üretiminde önemli bir rol oynar. Doğru pH seviyelerini korumak, hücre büyümesi için doğru ortamı yaratmak açısından önemlidir ve bu sensörler, bunu başarmak için gereken verileri sağlama konusunda mükemmeldir. Ayrıca, nispeten ekonomiktirler ve büyük ölçekli biyoreaktörlere sorunsuz bir şekilde entegre olurlar, bu da onları endüstriyel ortamlarda sürekli izleme için ideal kılar.
Dahası, bu sensörler karmaşık kültür medyasının zorluklarıyla başa çıkacak şekilde tasarlanmıştır ve zorlu koşullarda bile güvenilir performans sunar. Ancak, doğruluklarını korumak için periyodik kalibrasyon gerektirirler.Hassasiyet, güvenilirlik ve maliyet etkinliğinin birleşimiyle, potansiyometrik sensörler, kültürlenmiş et biyoprosesinde etkili pH kontrolü için tercih edilen bir seçenek haline gelmiştir.
Laktik asit birikimi, stabil pH seviyelerini korumayı neden zorlaştırır?
Laktik asit birikimi, kültür ortamının asitliğini artırarak pH kontrolünü zorlaştırır ve pH'ın düşmesine neden olur. Bu durum, çoğu hücrenin büyümesi ve düzgün çalışması için dikkatlice kontrol edilen bir pH aralığına ihtiyaç duyması nedeniyle hücre canlılığına ve verimliliğine zarar verebilir.
Laktik asit seviyelerini yönetmek, sağlıklı hücre büyümesini desteklemek ve ürün kalitesini korumak için kültürlenmiş et biyoprosesinde çok önemlidir. Gerçek zamanlı pH izleme, pH tamponları kullanma veya besleme protokollerini ayarlama gibi yaklaşımlar, ortamı stabilize etmeye ve zararlı pH dalgalanmalarından kaçınmaya yardımcı olabilir.
