Karıştırma, hücrelerin oksijen ve besin almasını sağlarken atık birikimini önleyerek kültür et üretiminde kritik bir rol oynar. Ancak, aşırı karıştırma hücrelerin ayrılması, zar hasarı ve büyümenin azalması gibi sorunlara neden olur. Özellikle büyük ölçekli biyoreaktörlerde, doğru dengeyi bulmak esastır, çünkü küçük ayarlamalar bile üretimi etkileyebilir.
Önemli Çıkarımlar:
- Optimum Karıştırma: Araştırmalar, karıştırmalı tank reaktörlerinde 60 rpm'nin besin dağıtımı ve kesme gerilimi dengesini sağlamak için ideal olduğunu göstermektedir.
-
Biyoreaktör Türleri:
- Karıştırmalı Tank: Etkili karıştırma sağlar ancak yüksek kesme gerilimi riski taşır.
- Dalga Biyoreaktörleri: Nazik karıştırma, oksijen transferi ile sınırlıdır.
- Hava Kaldırma Sistemleri: Düşük stresle eşit karıştırma sağlar ancak hassas kontrol gerektirir.
- Koruyucu Önlemler: Poloxamer 188 gibi katkı maddeleri ve kabarcıksız oksijenlendirme hücre hasarını azaltır.
- Ölçeklendirme Zorlukları: Daha büyük sistemler, kesme risklerini artırır ve hassas izleme ile CFD modellemesi gerektirir.
Hücre bütünlüğünü korurken kültive edilmiş et üretimini ölçeklendirmek için hassas karıştırma kontrolünü sürdürmek çok önemlidir.
Karıştırmanın Hücre Büyümesi ve Hayatta Kalma Üzerindeki Etkisi
Son Çalışmalar Ne Gösteriyor
Son araştırmalar, hücre büyümesi ve hayatta kalmayı etkileyen belirli karıştırma eşiklerini belirlemiştir. Örneğin, 100 mL karıştırmalı tank biyoreaktörde mikro taşıyıcılar üzerinde FS-4 hücreleri kullanılarak yapılan bir ABM-CFD çalışması, 60 rpm'nin optimal karıştırma hızı olduğunu ortaya koymuştur. Bu hızda, besinler ve oksijen eşit şekilde dağıtılırken, kesme stresi 0–80 mPa arasında kalır. Ancak, 60 rpm'yi aşmak, artan kuvvetler nedeniyle hücre hasarına ve ayrılmasına yol açar.220 rpm'de, çarkın Reynolds sayısı 1,444'ten 5,294.7'ye fırlayarak türbülanslı akışa geçişi işaret eder. Bu türbülans, mikro taşıyıcılardan daha küçük girdaplar oluşturur ve bu da hücrelere ve zarlarına zarar verebilir [2].
İnsan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelere odaklanan başka bir çalışma, karıştırma yoğunluğundaki hafif artışların bile yapışma oranlarını önemli ölçüde azalttığını vurguladı. Bu, yapışkan hücrelerin mekanik strese karşı yüksek hassasiyetini gösterir [6].
Bu bulgular, karıştırma hızlarının hassas bir şekilde kalibre edilmesinin önemini vurgulamakta ve bu, sürekli iyileştirme gerektiren bir alan olarak kalmaktadır.
Doğru Karıştırma Yoğunluğunu Bulmak
Asıl zorluk, mikro taşıyıcıları askıya almak için gereken minimum karıştırma hızını (N<sub>js</sub>) kesme gerilimi sınırlarını aşmadan dengelemektir.Et hücreleri için ideal koşullar, yaklaşık 1 mW·kg⁻¹ enerji dağılım oranı ve 10 saniyenin altında bir karıştırma süresi içerir [1].
"Hücreler için aşırı mekanik strese maruz kalmadan uygun bir mikro ve makro ortamın korunması, biyoreaktör tasarımlarının ve süreçlerinin yenilik ve optimizasyonunu gerektirecektir" [2].
Aşırı karıştırma iki zararlı etkiye sahip olabilir: stres kritik bir eşiği aştığında ani hücre ölümü ve kümülatif stresin neden olduğu durgunluk. Her iki sonuç da verimliliği engeller. Bu, karıştırma yoğunluğunun hassas kontrolünü ticari başarı için kritik bir faktör haline getirir, özellikle büyük ölçekli üretimde. 20 m³ kadar büyük hacimlere sahip sistemlerde, en az karıştırma bile hücrelerin ayrılmasına neden olabilir, bu da hücre canlılığını korurken ölçek büyütmenin karmaşıklığını vurgular.
Biyoreaktörlere Giriş: Karıştırma, çalkalama & kesme
Biyoreaktör Karıştırma Yöntemleri ve Etkileri
Kültür Et Üretimi için Biyoreaktör Türlerinin Karşılaştırılması
Farklı Biyoreaktör Sistemlerinin Karşılaştırılması
Bir biyoreaktörün tasarımı, besin dağılımını dengelemede ve mekanik stresi yönetmede kritik bir rol oynar. Her biyoreaktör türü, hücre hayatta kalma ve verimliliğini doğrudan etkileyen farklı karıştırma koşulları yaratır. Doğru sistemi seçmek, verimli besin dağıtımı ile hücrelere zarar verebilecek mekanik kuvvetleri en aza indirmek arasında bir denge bulmak anlamına gelir.
Karıştırmalı tank biyoreaktörleri kültürü karıştırmak için mekanik çarklara dayanır. Rushton çarkları, özellikle çark uçlarına yakın yerlerde lokalize kesme bölgelerine yol açan radyal akışlar üretir.Buna karşılık, eğimli kanatlı ve deniz kanatlı çarklar, hassas memeli hücreleri için daha uygun olan daha yumuşak akışlar yaratır. Mart 2025'te Şanghay'daki Biyoreaktör Mühendisliği Devlet Anahtar Laboratuvarı tarafından yapılan bir çalışma, karıştırmalı tank ve yörüngesel sallanan biyoreaktörlerde CHO-K1 hücre performansını karşılaştırdı. Karıştırmalı tank sistemi 520 rpm'de 71.6 × 10⁶ hücre/mL'ye ulaşırken, yörüngesel sallanan sistem sadece 100 rpm'de 83 × 10⁶ hücre/mL'ye ulaştı [4].
Dalga (sallanma) biyoreaktörleri çarkları tamamen ortadan kaldırır ve karıştırma için tepsi üzerinde sallanan tek kullanımlık bir torba kullanır. Bu düşük kesme ortamı, kırılgan hücre hatları için idealdir. Ancak, bu sistemler yüzey havalandırmasına bağlıdır, bu da yüksek yoğunluklu kültürlerde oksijen transferini sınırlayabilir. Etkili dalga oluşumunu sürdürmek için, çalışma hacmi torbanın toplam kapasitesinin %50'si ile sınırlandırılmıştır [7].
Airlift biyoreaktörler pnömatik karıştırma kullanır, gaz püskürtme sıvıyı bir yükseltici ve bir alçaltıcı arasında dolaştırır. İç hareketli parça olmadan, airlift sistemleri karıştırmalı tanklara kıyasla daha düşük kesme kuvvetleri ve eşit enerji dağılımı sağlar. Dalga biyoreaktörlerinin aksine, airlift tasarımları verimli dolaşımları sayesinde daha iyi oksijen transferi sunar [7] .
| Biyoreaktör Türü | Karıştırma Mekanizması | Kesme Gerilimi | Elde Edilen Hücre Yoğunluğu | Ana Sınırlama |
|---|---|---|---|---|
| Karıştırmalı Tank | Mekanik çark | Yüksek (yerel) | 71.6 × 10⁶ hücre/mL | Çark ucu hasar riski |
| Yörüngesel Sallama | Kabın dönüşü | Orta | 83 × 10⁶ hücre/mL | Kesme gerilimi zirveleri |
| Dalga (Sallanma) | Yatay sallanma | Çok düşük | Yüksek | Sınırlı oksijen transferi |
| Hava kaldırma | Gaz püskürtme | Düşük (uniform) | Yüksek | Hassas gaz kontrolü gerektirir |
"Karıştırmalı tank reaktörlerinde... lokalize çark karışımı, hücrelerin mekanik strese maruz kalmasına neden olan büyük kesme gradyanları oluşturur." – Cellexus [7]
Biyoreaktörler büyüdükçe, karıştırma verimliliği ile hücre koruması arasındaki ödünleşimler daha belirgin hale gelir.Karıştırmalı tank sistemleri, besin maddelerini dağıtmakta son derece etkilidir ancak yüksek kesme bölgelerinde hücrelere zarar vermemek için dikkatli hız ayarlamaları gerektirir. Öte yandan, dalga ve hava kaldırmalı biyoreaktörler daha nazik bir karıştırma sağlar, kesme gerilimi riskini azaltır, ancak yoğun kültürlerde oksijen iletimiyle mücadele edebilirler. Bu karşılaştırmalar, hücre bütünlüğünü korurken büyük ölçekli biyoproses optimizasyonu için gereken hassas dengeyi vurgular.
sbb-itb-ffee270
Kesme Gerilimini Azaltma ve Hücre Büyümesini İyileştirme
Yeni Biyoreaktör Tasarımları ve Koruyucu Katkı Maddeleri
Kesme gerilimini en aza indirmek, kültive edilmiş et üretiminde hücre büyümesini teşvik etmek için esastır. Biyoreaktör tasarımındaki yenilikler ve koruyucu katkı maddelerinin kullanımı, hücre canlılığını ve karıştırma verimliliğini önemli ölçüde artırmıştır.Bir umut verici yaklaşım, çalkalanan biyoreaktörleri içerir; bu sistemler, çarkla karıştırma ve kabarcık patlaması nedeniyle oluşan zarar verici kesme kuvvetlerinden kaçınmak için kap hareketine ve yüzey havalandırmasına dayanır. Bu sistemler, geleneksel karıştırmalı tank sistemlerinde 71.6 × 10⁶ hücre/mL ile karşılaştırıldığında 83 × 10⁶ hücre/mL vererek etkileyici sonuçlar göstermiştir [4] .
Karıştırmalı tank sistemlerinde, çarkın geometrisi de fark yaratır. Radyal Rushton çarkları, hücrelerin "sakin" bölgelerde toparlanmasına olanak tanıyan akış desenleri oluşturur ve yüksek kesme kuvvetlerinin etkisini azaltır. TTP'den araştırmacıların gözlemlediği gibi:
Radyal Rushton çark reaktörlerindeki hücreler, çift eksenli çark sistemlerindekilerin aksine sakin fazlar sırasında toparlanır [5].
Yetiştirilen et üretiminde en iyi sonuçlar için, çark ucu hızını 0.6–1.8 m/s hücre büyümesini korumak için önerilir [9] .
Poloxamer 188 (Pluronic F-68) gibi koruyucu katkı maddeleri, gaz-sıvı arayüzündeki yüzey gerilimini azaltarak, kabarcık oluşumu ve patlaması sırasında hücreleri hasardan koruyarak önemli bir rol oynar. Poloxamer 188 için ideal konsantrasyon 1 g/L'dir, çünkü daha yüksek miktarlar ek bir fayda sağlamaz [9]. Mikroküreler üzerinde yetiştirilen yapışkan hücreler için, aralıklı karıştırma rejimi sonuçları daha da iyileştirebilir. Örneğin, ekim aşamasında 30 dakika KAPALI ve 5 dakika AÇIK bir desen kullanmak, boncuktan boncuğa transferi teşvik ederken hidrodinamik stresi en aza indirir. Bu yaklaşım, sığır uydu hücrelerinin 3 × 10⁶ hücre/mL yoğunluklarına ulaşmasını sağlamıştır [3] .
Bu tasarım ve katkı stratejilerine ek olarak, oksijen iletimini iyileştirmek, kesme gerilimini daha da azaltabilir.
Baloncuksuz Oksijenlendirme Kullanımı
Baloncuksuz oksijenlendirme, hücreleri kesme hasarından korumanın başka bir etkili yolunu sunar. Gaz-sıvı arayüzünde baloncuk patlaması, 10⁶ ila 10⁸ W/m³ kadar yüksek enerji dağılım oranları üretebilir, bu da çoğu memeli hücresinin tolere edebileceği 10⁴ W/m³ alt ölümcül eşiğini [9] aşar. Baloncukları ortadan kaldırarak, bu yöntem yüksek yoğunluklu kültürleri korumaya yardımcı olur.
Yörüngesel sallanan ve sallanan biyoreaktörlerde yaygın olarak kullanılan yüzey havalandırması, kesme kuvvetlerini azaltmada özellikle etkilidir.Yakın zamanda yapılan bir çalışmada vurgulandığı gibi:
OSB'ler, geleneksel çark bıçakları ve kabarcık oluşumu veya kırılmasının neden olduğu kesme hasarını etkili bir şekilde azaltmak için gemi gövdesi hareketini ve yüzey havalandırmasını kullanır [4].
Sallanan biyoreaktörler, kültürlenmiş et üretimi için de umut vaat ediyor. Tek kullanımlık olmaları, düşük işletme maliyetleri ve nazik bir hidrodinamik ortam gibi avantajlar sunarlar [8].
Bununla birlikte, yüzey havalandırması çok yüksek hücre yoğunluklarında zorluklarla karşılaşır. Örneğin, yörüngesel olarak sallanan bir biyoreaktör, 20.12 h⁻¹ oksijen kütle transfer katsayısı (kLa) elde etti ve teorik olarak 118 × 10⁶ hücre/mL hücre yoğunluklarını destekledi.Ancak pratikte, hücre yoğunluğu 80 × 10⁶ hücre/mL'yi aştığında, süspansiyonun viskozitesi artar ve bu da oksijen transfer verimliliğini azaltan Newtonsal olmayan, kayma incelmesi davranışına yol açar. Bu durum, hücre yoğunlukları arttıkça dikkatli optimizasyon ihtiyacını vurgular.
Büyük Ölçekli Üretim için Karıştırma Kontrolü
Karıştırma Hızlarının Ayarlanması ve İzleme Sistemleri
Büyük ölçekli sistemlerde, karıştırma üzerinde hassas kontrol sağlamak çok önemlidir. İlk 24 saat boyunca, hücrelerin mikroküre taşıyıcılara tutunmasını optimize etmek için karıştırma hızlarının 30–50 rpm arasında tutulması önerilir [6] . Haziran 2022'de Doğu Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nden bir çalışma bu yaklaşımın önemini vurgular: 45 rpm'de, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücreler 98.68% uyum oranı 1. Günde, hızın 55 rpm'ye çıkarılması uyum oranlarının 51.32% [6] seviyesine düşmesine neden oldu.
Bağlanma aşamasından sonra, hücre kümelenmesini önlemek için karıştırma hızı, yeni askıya alınmış hızın (N₍JS₎) biraz üzerine çıkmalıdır. Araştırmalar, karıştırma yoğunluğunun 1.3 × N₍JS₎ civarında tutulmasının hücre büyümesini desteklediğini, bunun 2 × N₍JS₎ seviyesine çıkarılmasının ise azalan bağlanma verimliliği nedeniyle büyümeyi engellediğini göstermektedir [10] .
Dar operasyonel marjlar göz önüne alındığında, sürekli izleme kritiktir. BioStar 1.5c biyoreaktör gibi sistemler, çözünmüş oksijen (DO) ve pH problarından gelen gerçek zamanlı geri bildirimlere dayanarak karıştırma ve gaz akışını ayarlamak için gelişmiş yazılımlar kullanır [6].Optik DO sensörleri burada önemli bir rol oynar, DO seviyeleri belirlenen bir eşik değerin - genellikle %40 civarında - altına düştüğünde karıştırmayı hassas bir şekilde ayarlamak için gereken hassasiyeti sunar, böylece kesme gerilimini en aza indirir [7] [6]. Doğu Çin ekibi, DO'yu %40 ve pH'ı 7.2'de tutarak Mettler Toledo problarını kullanarak bu yöntemi uyguladı. Bu yaklaşım, 27.3 × 10⁵ hücre/mL maksimum hücre yoğunluğu ile standart parti kültür tekniklerine göre 2.9 kat iyileşme sağladı [6].
Yükseltme yaparken, hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) modelleri, mikrokapsülleri askıya almak için optimal karıştırıcı hızını belirlemede, kesme sınırlarını aşmadan, paha biçilmezdir [10][6]. Sadece kaplar arasında devir sayısını eşleştirmek yerine, CFD analizi, reaktörler arasında hacim-ortalama kesme gerilme hızını hizalamayı önerir.Bu, daha büyük bir biyoreaktörde - örneğin 200 mL'lik bir spinner flask'tan 1.5 L'lik bir biyoreaktöre ölçeklendirme gibi - hidrodinamik ortamın hücre büyümesi için elverişli kalmasını sağlar [6].
Bu stratejiler, gelişmiş biyoreaktör sistemlerine geçişte hassas kontrol ve izlemenin önemini vurgular.
Özel Ekipman Bulma Cellbase
Yetiştirilmiş et üretimi için doğru ekipmanı temin etmek zor olabilir. Standart laboratuvar tedarik platformları genellikle bu alanın özel ihtiyaçlarına, örneğin düşük kesme kuvvetli çarklar veya yüksek yoğunluklu memeli hücre kültürlerine uygun optik çözünmüş oksijen sensörleri gibi, hitap etmez. İşte bu noktada
Yetiştirilmiş et endüstrisi için ilk özel B2B pazaryeri olarak,
İzleme sistemlerinizi yükseltiyor veya özel bileşenler tedarik ediyorsanız,
Sonuç
Oksijen ve besin maddesi dağıtımı arasında doğru dengeyi sağlamak ve zararlı kesme gerilimini önlemek, kültürlenmiş et biyoreaktörlerinde karıştırmayı optimize etmenin anahtarıdır. Araştırmalar, doğru biyoreaktör tasarımlarını seçerek, karıştırma hızlarını ince ayarlayarak ve koruyucu stratejiler kullanarak bunun başarılabileceğini göstermektedir.
Aralıklı karıştırma, radyal Rushton çarkları ve CFD (Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği) ile izlenen gerçek zamanlı ayarlamalar gibi teknikler, hücrelerin iyi toparlanmasını ve istikrarlı bir şekilde büyümesini sağlamakta büyük rol oynar. Üretim, laboratuvar şişelerinden endüstriyel hacimlere ölçeklendikçe, Newtonsal olmayan akışkan davranışını anlamak ve tutarlı Kolmogorov uzunluk ölçeklerini korumak, mekanik hasarı önlemek için kritik hale gelir. Bu gelişmeler, hücreleri korumayı kolaylaştırır ve ölçeklendirme çabalarını basitleştirir.
Böyle platformlar
SSS
Kültürlenmiş et için biyoreaktörlerde aşırı karıştırma hangi sorunlara yol açabilir?
Biyoreaktörlerde aşırı karıştırma, kültürlenmiş et üretimi için ciddi bir sorun olabilir çünkü hücre büyümesini ve hayatta kalmayı olumsuz etkileyebilir. Yoğun karıştırma, hassas hayvan hücrelerine zarar verebilecek yüksek kesme gerilimi yaratır. Bu tür mekanik stres, hücre zarının zarar görmesine, canlılığın azalmasına ve hatta doku gelişiminin engellenmesine neden olabilir.
Bu zorlukları önlemek için, karıştırma parametrelerini ince ayarlamak çok önemlidir.Amaç, mekanik stresi en aza indirirken verimli besin ve oksijen transferi arasında bir denge kurmaktır. Karıştırıcı tasarımı, karıştırma hızı ve biyoreaktörün geometrisi gibi anahtar faktörler, kültivasyon süreci boyunca sağlıklı ve verimli hücreleri korumak için dikkatlice ayarlanmalıdır.
Biyoreaktör seçimi, kültive et üretiminde hücre büyümesini ve canlılığını nasıl etkiler?
Kültive et üretiminde biyoreaktör seçimi çok önemlidir çünkü karıştırma verimliliği, oksijen transferi ve kesme stresi gibi faktörleri etkileyerek hücre büyümesi ve sağlığını doğrudan etkiler.
Karıştırmalı tank biyoreaktörleri, bu koşullar üzerinde hassas kontrol sundukları için büyük ölçekli üretim için popüler bir seçenektir. Ancak, hassas hücrelere zarar verebilecek kesme kuvvetleri de üretebilirler, bu nedenle zararları en aza indirmek için karıştırıcı tasarımlarını ve işletim parametrelerini ince ayarlamak önemlidir.
Diğer tasarımlar, örneğin hava kaldırmalı biyoreaktörler, daha basittir ve daha az enerji tüketir. Ancak, karıştırma üzerinde aynı düzeyde kontrol sağlamayabilirler, bu da hücre büyümesini etkileyebilir. Öte yandan, hollow-fibre biyoreaktörler yüksek hücre yoğunluklarını desteklemek için kan damarlarını taklit eder, ancak bunları ölçeklendirmek bir zorluk olabilir.
Doğru biyoreaktörü seçmek, ölçeklenebilirlik, maliyet ve hücrelerin özel ihtiyaçları gibi faktörler arasında doğru dengeyi bulmaya bağlıdır, böylece kültürlenmiş et üretimi için etkili bir şekilde büyüyüp gelişebilirler.
Büyük ölçekli kültürlenmiş et üretiminde kayma gerilimi nasıl azaltılabilir?
Büyük ölçekli kültürlenmiş et üretiminde kayma gerilimini en aza indirmek, biyoreaktör tasarımı ve işletiminde dikkatli ayarlamalar gerektirir. Pervane tipi, reaktör şekli ve karıştırma ayarları gibi faktörler önemli bir rol oynar.Örneğin, çark ucu hızlarını azaltmak veya belirli çark tasarımlarını tercih etmek, hücre büyümesi için kritik olan uygun karıştırma ve oksijen dağıtımını korurken kesme kuvvetlerini azaltabilir.
Bu süreçte faydalı bir diğer araç ise hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD)'dir. CFD simülasyonları, mühendislerin akış desenlerini ve kesme dağılımını ayrıntılı bir şekilde incelemelerine olanak tanır, bu da onların bilinçli tasarım değişiklikleri yapmalarına yardımcı olur. Ayrıca, sallanan veya dalga karışımlı biyoreaktörler, doğal olarak daha düşük kesme kuvvetleri ürettikleri için geleneksel karıştırmalı tank sistemlerine nazaran daha nazik bir alternatif sunar. Gelişmiş sensörler ve öngörücü kontrol algoritmaları ile gerçek zamanlı izleme, kesme gerilimini güvenli sınırlar içinde tutmaya daha fazla yardımcı olabilir ve daha sorunsuz bir üretim süreci sağlar.
