Kesme gerilimi, kültürlenmiş et üretimini yapabilir veya bozabilir. Neden? Çünkü kullanılan hücreler koruyucu duvarlardan yoksundur, bu da onları biyoreaktörlerdeki akışkan kuvvetlerinden kaynaklanan hasara karşı savunmasız hale getirir. Bu makale, kesme geriliminin bu hücreleri nasıl etkilediğini, dayanabilecekleri eşikleri ve onları koruyan sistemlerin nasıl tasarlanacağını inceliyor.
Anahtar çıkarımlar:
- Kesme gerilimi, akışkan hareketinden kaynaklanır ve kırılgan hayvan hücrelerine zarar vererek zar hasarına, ayrılmaya veya ölüme neden olabilir.
- Çoğu memeli hücresi 0.3–1.7 Pascal, tolerans gösterir ancak daha düşük seviyeler bile stres tepkilerini tetikleyebilir.
- Karıştırıcı tipi, havalandırma yöntemleri ve biyoreaktör geometrisi gibi tasarım seçimleri doğrudan kesme kuvvetlerini etkiler.
- Hasarı en aza indirme stratejileri arasında daha nazik biyoreaktör tasarımlarının kullanılması (e.g. , hava kaldırma veya sallama sistemleri), karıştırma hızlarının optimize edilmesi ve Pluronic F68. gibi koruyucu ajanların eklenmesi yer alır.
Yetiştirilmiş et için, bu dengeyi yönetmek, hücrelerin zarar görmeden büyümesini ve farklılaşmasını sağlamak için kritiktir, özellikle üretim ölçeklendikçe. Bu eşiklerin arkasındaki bilimi ve biyoreaktör tasarımı için pratik çözümleri keşfedelim.
110: Dünya Gibi Dönen: Olivier De ile Daha İyi Hücre Kültürü için Düşük Kesme Kuvvetli Biyoreaktörler Tasarlamak...
Biyoreaktörlerde Kesme Gerilimini Etkileyen Faktörler
Biyoreaktörlerde kesme gerilimini etkileyen faktörleri anlamak, özellikle hassas hücreler söz konusu olduğunda, koşulları optimize etmek için çok önemlidir. Yoğunluğunu ve dağılımını şekillendiren ana unsurlara dalalım.
Biyoreaktör Tasarımı ve Çalışma Koşulları
Bir biyoreaktörün tasarımı, kesme geriliminin nerede ve nasıl meydana geldiğini belirlemede büyük bir rol oynar. Anahtar faktörlerden biri kullanılan çark türüdür.Örneğin, Rushton türbinleri, geminin ortalamasından 280 kat daha yüksek enerji dağılım oranları yaratabilirken, HE3 gibi yüksek verimli eksenel akış pervaneleri, ortalama dağılıma daha yakın oranlar olan 180 katına kadar oranlar üretir. Diğer tasarım unsurları, pervane çapı, hızı ve konumlandırma gibi, enerji dağılımını da etkiler. İlginç bir şekilde, havalandırma, karıştırmadan çok daha sert kuvvetler uygular. Küçük baloncuklar (1–2 mm) patladığında, 10⁷–10⁹ W/m³ arasında enerji seviyeleri açığa çıkarır, bu da tek bir olayda 1.000'den fazla hücreyi öldürebilir. Bu, özellikle kültive edilmiş et üretiminde baloncuk davranışını kritik bir husus haline getirir. Bafıllar, başka bir önemli tasarım unsurudur. Kültürde bir girdap oluşumunu engellerler, aksi takdirde baloncukları sıvıya çeker ve yüzeydeki patlama olaylarını artırır.Ayrıca, çarkın-vessel çap oranı ve çarkın tabandan yüksekliği, enerjinin biyoreaktör boyunca nasıl yayıldığını etkiler.
Kesme Geriliminin Düzensiz Dağılımı
Kesme gerilimi biyoreaktör boyunca eşit dağılmamıştır. Araştırmalar, enerji dağılımının çark çıkış alanı, iz vorteksleri ve kabarcıkların kırıldığı sıvı yüzeyi gibi belirli bölgelerde yoğunlaşma eğiliminde olduğunu göstermektedir. Bu sıcak noktalar, ölçek büyütme sırasında zorluklar yaratabilir.
Biogen Idec'ten Weiwei Hu bu ölçeklendirme sorununu vurguluyor:
'Kesme hassasiyeti' algısı, biyoreaktör operasyonunda karıştırma ve havalandırma üzerinde tarihsel olarak keyfi bir üst sınır koymuştur; ancak, hücre yoğunlukları ve verimlilikler artmaya devam ettikçe, kütle transfer gereksinimleri bu keyfi düşük sınırların dayattıklarını aşabilir [4].
Örneğin, Jiangnan Üniversitesi'nden Junxuan Zhang ve Xueliang Li tarafından yapılan 2021 tarihli bir çalışma, hesaplamalı akışkanlar dinamiği kullanarak 250 mL'lik bir döner şişe ile 20 m³'lük karıştırmalı tank reaktörünü karşılaştırdı. En düşük karıştırma hızlarında bile, daha büyük reaktördeki kesme kuvvetlerinin hücreleri mikrokapsüllerden ayıracak kadar güçlü olduğunu gözlemlediler ve havalandırmanın karıştırmadan daha fazla stres yarattığını belirttiler [3].
Kültür Formatı ve Kesme Hassasiyeti
Kültür formatı, hücrelerin kesme stresini nasıl deneyimlediğini de belirler. Mikrokapsüller üzerinde büyüyen hücreler özellikle savunmasızdır. Yoğun karıştırma veya taşıyıcılar arasındaki çarpışmalar hücrelerin ayrılmasına neden olursa, bu hücreler etkili bir şekilde kaybedilir [4]. Öte yandan, hibridoma hücrelerinin süspansiyon kültürleri, hava-sıvı arayüzü olmadan baffled biyoreaktörlerde 1.500 RPM gibi yüksek karıştırma hızlarında canlılıklarını koruyarak dayanıklılık göstermiştir [4].
Farklı kültür sistemleri kesme kuvvetini çeşitli şekillerde ele alır. Sabit yataklı biyoreaktörler, hücreleri sabit yüzeylerde hareketsiz tutarak kesme kuvvetini en aza indirirken, akışkan yataklar mikrotaşıyıcıların hareketi ve yukarı doğru sıvı akışı ile orta ila yüksek kesme kuvveti uygular [2]. Özellikle gözenekli olan bazı mikrotaşıyıcılar, hücreleri aşırı kuvvetlerden koruyabilecek iç yüzeyler sunarak, katı mikrotaşıyıcılara kıyasla daha iyi koruma sağlar [2]. Bu farklılıklar, biyoreaktör tasarımında besin dağıtımını hücre hasarı riskiyle dikkatlice dengeleme ihtiyacını vurgular.
Farklı Hücre Tipleri İçin Kayma Gerilimi Eşik Değerleri
Yetiştirilen Et Hücre Tipleri İçin Kayma Gerilimi Tolerans Eşik Değerleri
Kayma geriliminin yönetimi, yetiştirilen et üretimi için kritik öneme sahiptir, çünkü düzensiz gerilim, güçlü hücre duvarlarına sahip olmayan hücrelere zarar verebilir. Her hücre tipinin tolere edebileceği belirli gerilim seviyelerini anlamak, hücre sağlığını korumaya, mekanosensitif tepkileri tetiklemeye veya farklılaşmayı teşvik etmeye yardımcı olur.
Yaygın Hücre Tipleri İçin Eşik Değerler
Kayma gerilimi toleransı hücre tipleri arasında önemli ölçüde değişir ve bu eşik değerlerini bilmek, biyoreaktör ayarlarını ince ayar yapmak için anahtardır.
Örneğin, C2C12 hattı gibi yetiştirilen et miyoblastları düşük kayma gerilimi altında gelişir. Yaklaşık 1.68 mPa döngüsel gerilim, miyotüp oluşumunu ve füzyonunu iyileştirir [8]. Fare kasından türetilen kök hücreler (MDSC'ler), 16 mPa maruz kaldıklarında daha iyi miyojenik farklılaşma ve daha geniş miyotüp oluşumu gösterirler [8]. Miyoblastlar miyotüplere olgunlaştıkça, daha yüksek stres seviyelerini yönetebilirler; 400 mPa ve 1,400 mPa arasında değişen darbeli stres, kas lifi boyutunu düzenleyen yolları aktive eder, bu da potansiyel olarak hipertrofiye yol açabilir [8].
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) de benzersiz bir şekilde yanıt verir. Örneğin, 100 mPa ve 1,500 mPa arasında kayma stresine maruz kalan köpek MSC'leri, PECAM-1 ve VE-cadherin gibi endotelyal belirteçleri yukarı regüle ederken, düz kas belirteçlerini aşağı regüle eder [10].
Kesme Gerilimi Eşik Karşılaştırma Tablosu
Farklı kültürlenmiş et hücre tipleri arasında kesme gerilimi eşiklerinin hızlı bir karşılaştırması:
| Hücre Tipi | Kesme Gerilimi Eşiği (mPa) | Gözlemlenen Etkiler | Kaynak |
|---|---|---|---|
| Memeli Hücreleri (Genel) | 300–1,700 | Temel aralık; bu seviyelerin üzeri hücre hasarına veya apoptoza yol açabilir | [1] |
| C2C12 Miyoblastlar (Adherent) | ~1.68 | Geliştirilmiş canlılık ve artmış miyotüp oluşumu | [8] |
| Fare MDSC'leri (Yapışkan) | ~16 | Gelişmiş farklılaşma ve geniş miyotüp oluşumu | [8] |
| C2C12 Miyotüpleri (Yapışkan) | 400–1,400 | Kası lifi boyutunu düzenleyen yolların aktivasyonu (potansiyel hipertrofi) | [8] |
| Köpek MSC'leri | 100–1,500 | Endotelyal belirteçlerin yukarı regülasyonu, düz kas belirteçlerinin azalması | [10] |
| Hücre Yüzey Sensörleri (Integrinler) | 100–1,000 | Mekanosensitif iyon kanalları ve reseptörlerin aktivasyonu | [1] |
Bağlam için, standart bir şişede 100–200 rpm hızında bir kültürü karıştırmak, 300–660 mPa, kesme gerilimi seviyeleri oluştururken, 20–60 rpm hızında çalışan orbital çalkalayıcılar 600 mPa ile 1,600 mPa arasında değişen daha yüksek kuvvetler üretir [1]. Daha nazik sistemler, sallanan biyoreaktörler gibi (±5° at 1 Hz) yaklaşık 90 mPa [9], stres yaratır ve klinostat biyoreaktörler yaklaşık 10 mPa, de çalışarak mekanosensitif hücre yüzey sensörleri için aktivasyon eşiğinin oldukça altında kalır [1] .
Bu eşikler, biyoreaktör koşullarını ayarlamak için bir kılavuz görevi görür, ölçek büyütme ve hücre büyüme aşamaları sırasında optimal ortamların korunmasına yardımcı olur.
sbb-itb-ffee270
Kesme Stresi Hasarını Azaltma Yöntemleri
Yetiştirilen et üretiminde kesme stresi hasarını en aza indirmek, hassas bir denge sağlamakla ilgilidir. Amaç, hassas hücreleri mekanik zarardan korurken verimli karıştırma ve oksijen dağıtımını sağlamaktır. Bu, akıllı biyoreaktör tasarımı ve düşünceli operasyonel stratejilerin bir kombinasyonunu içerir.
Biyoreaktör Tasarım Değişiklikleri
HAD (Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği) modellemesi kullanmak, biyoreaktör performansını optimize etmede önemli bir adımdır. Modern HAD teknikleri artık hücreler ve mikrokapsüller arasındaki etkileşimleri dikkate alan çok fazlı akış simülasyonlarını içermektedir. Bu, kayma gerilimi ve potansiyel zararlarının daha doğru değerlendirilmesiyle sonuçlanır [5].
Biyoreaktör tipi, kayma gerilimi seviyelerini belirlemede büyük bir rol oynar. Karıştırmalı tank reaktörleri hala yaygın olarak kullanılırken, alternatif tasarımlar daha nazik koşullar sunabilir:
- Hava kaldırmalı biyoreaktörler: Bunlar mekanik karıştırıcıları ortadan kaldırır, bunun yerine mekanik kaymayı azaltmak için gaz kaynaklı dolaşım kullanır [5].
- Dalga veya sallanan biyoreaktörler: Çarklar yerine yüzey hareketine dayanarak, nazik karıştırma gerektiren düşük-orta yoğunluklu kültürler için idealdir [5] .
- Dikey tekerlek biyoreaktörleri: Özellikle agregat bazlı kültürler için etkili olan bu biyoreaktörler, insan iPSC agregatlarının genişlemesi sırasında hücre canlılığını korumada başarı göstermiştir [11].
Diğer önemli bir faktör, hücre süspansiyonlarının Newtonyen olmayan davranışıdır. Örneğin, serum içeren süspansiyonlar, geleneksel modellerin genellikle yakalayamadığı kayma incelmesi özellikleri sergiler. Sisko modeli gibi gelişmiş modellerin kullanılması, kayma geriliminin daha doğru tahminlerini sağlar, mekanik kuvvetleri ince ayarlamaya yardımcı olur ve genetik ifadeyi değiştirebilecek eşikleri önler [6].
Hücre Ekimi ve Karıştırma Yöntemleri
Operasyonel stratejiler de kesme gerilimi hasarını azaltmada büyük rol oynar. Örneğin, erken hücre tutunma aşamalarında aralıklı karıştırma kesme maruziyetini sınırlarken besinlerin etkili bir şekilde dağıtılmasını sağlar. Karıştırmayı ayarlamak, serum içeriği, hücre yoğunluğu ve kültürün yaşı gibi faktörlerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir [6].
Karıştırma hızlarını belirlerken, CFD modellemesi yeterli oksijen transferi sağlarken mekanik zarara neden olmadan ideal dengeyi belirlemeye yardımcı olabilir. Bölümlendirilmiş simülasyonlar, kesme gerilimi dağılımını daha da iyileştirerek süreci daha verimli hale getirebilir [5].
Biyoreaktör Tasarımı ve Ölçek Büyütme Üzerindeki Etki
Kültür eti üretimi için biyoreaktörleri ölçeklendirirken, kayma gerilimi eşiklerini anlamak ve uygulamak kritik öneme sahiptir. Bu eşikler, hücre canlılığını sağlamak için üretim hacimleri arttıkça karıştırıcı hızı, hava dağıtıcı tasarımı ve diğer parametreler hakkında kararları etkiler.
Biyoreaktör İşletim Parametrelerini Belirleme
Kayma gerilimi eşikleri, operasyonel sınırların tanımlanmasında önemli bir rol oynar. Örneğin, hematopoietik kök hücreler (HSC'ler) yaklaşık 0.092 Pa [12]. bir eşiğe sahiptir. Bu seviyenin altında kalmak - yaklaşık 0.068 Pa üreten 50 rpm'de çalışmak gibi - sağlıklı hücre genişlemesini destekler ve 27.4 kat artış. sağlar. Ancak, karıştırmayı 100 rpm'ye çıkarmak kayma gerilimini yaklaşık 0.192 Pa'ya yükseltir, bu da %72 apoptoz oranı ile sonuçlanır ve genişlemeyi 24 ile sınırlar.5‐fold [12].
"HSC'lerin çoğalması ve işlevi için eşik kayma gerilimi 0.092 Pa olarak bildirilmiştir." – Hosseinizand ve diğerleri. [12]
Kayma hasarı, türbülanslı girdaplar bir hücre veya agreganın çapının yaklaşık üçte ikisinden daha küçük hale geldiğinde meydana gelir[12][13]. 50 rpm'de, girdaplar yaklaşık 280 µm ölçer, bu hücreler için güvenlidir. Ancak 100 rpm'de, girdaplar 166 µm'ye küçülerek mekanik hasar riskini artırır.
Havalandırma ek hidrodinamik stres getirir. Küçük kabarcıklar (1 mm çapında) patlama sırasında yaklaşık 6.4 m/s yerel akışkan hızları üretirken, daha büyük 6 mm kabarcıklar daha yumuşak zirveler olan 0.94 m/s[13]. üretir. Bunu dengelemek için, Pluronic F68 gibi katkı maddeleri hücrelerin kabarcık yüzeylerine yapışmasını önlemek için kullanılır.Ancak, etkinlikleri gaz yüzey alanına göre doğru konsantrasyonu korumaya bağlıdır[13].
Bu parametreler, daha büyük biyoreaktör sistemlerine geçişte önemlidir.
Ölçek Büyütme Sırasında Koşulların Korunması
250 mL'lik bir spinner şişesinden 20 m³'lik karıştırmalı tank reaktörüne ölçek büyütmek benzersiz zorluklar getirir. Küçük ölçekli sistemlerdeki hidrodinamik koşullar doğrudan endüstriyel hacimlere çevrilemez. Büyük reaktörleri minimum karıştırma hızlarında çalıştırmak bile, hücrelerin mikrokapsüllerden ayrılmasına neden olacak kadar güçlü kesme kuvvetleri oluşturabilir[3].
"Njs'ye yakın bir karıştırma hızında çalıştırıldığında bile, yalnızca pervanelerin uyguladığı kesme kuvveti hücrelerin mikrokapsüllerden ayrılmasına neden olabilirken, sparging yoluyla daha fazla hidrodinamik stres eklenir." – Zhang et al. [3]
Ölçek büyütme sırasında tutarlı kesme koşullarını korumak için bir yaklaşım, çark ucu hızını sabit tutmaktır. Ancak, bu daha uzun karıştırma sürelerine ve besin ve oksijen gradyanlarının oluşumuna yol açabilir, bu da hücre büyümesini ve performansını olumsuz etkileyebilir[3]. Ölçek büyütme sırasında stres bölgelerini belirlemek ve reaktör tasarımını optimize etmek için Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) modellemesi gerekli hale gelir[5].
Kesme kuvvetine karşı çok hassas olan hücre hatları için alternatif reaktör tasarımları genellikle daha uygundur. Mekanik karıştırıcıları ortadan kaldıran hava kaldırmalı reaktörler, 300.000 L'ye kadar hacimler için başarıyla modellenmiş ve teorik hücre yoğunlukları 2 × 10⁸ hücre/mL elde edilmiştir[7]. Benzer şekilde, sallanan biyoreaktörler, kesme kuvvetini en aza indirmek için nazik dalga hareketleri kullanarak, 500 L'ye kadar tohum trenleri için etkili hale getirir.[14][15].
Özet ve Tavsiyeler
Kültürlenmiş et üretiminde hücre canlılığını ve verimliliğini korumak için kesme gerilimini etkili bir şekilde yönetmek çok önemlidir. Araştırmalar, havalandırma sırasında kabarcık patlamasının mekanik karıştırmadan daha fazla zarar verici kuvvetler yarattığını göstermektedir. Örneğin, küçük kabarcıklar (1 mm) patlama sırasında 6.4 m/s akışkan hızları üretirken, daha büyük kabarcıklar (6 mm) 0.94 m/s daha yumuşak zirveler üretir.[13]. Bu kuvvetleri en aza indirmek için, tedarik ekipleri, darbeli havalandırmaya izin veren ve gaz-sıvı arayüzünü azaltan sinterlenmiş mikrospargerlerle (15-μm gözenek boyutu) donatılmış biyoreaktörlere odaklanmalıdır. Bu hususlar, biyoreaktör sistemlerini ölçeklendirmek için hayati öneme sahiptir.
Diğer önemli bir faktör, karıştırma nedeniyle oluşan hasarı azaltmaya yardımcı olabilecek eddy ölçeği ile hücre çapı oranıdır (η/d_c). Ağustos 2017'de Biyoproses Mühendisliği ve Farmasötik Teknoloji Enstitüsü tarafından yapılan bir çalışma bunu vurgulamaktadır. Sf21 böcek hücreleri ile 3-L Applikon cam biyoreaktör kullanarak, 205 rpm'de altı kanatlı Rushton çarkının, 199 μm kabarcıklarla birlikte, 12.75 μg/mL GFP protein verimi ürettiğini gösterdiler. Buna karşılık, 171 rpm'de daha yüksek bir spesifik gaz yüzey alanı olan 18.0 m²/m³ üreten eğik kanatlı çark, sadece 4.0 μg/mL verim sağladı [13]. Bu, toplam gaz yüzey alanının karıştırma hızından daha etkili olduğunu göstermektedir.
Pluronic F68 (0.5–3 g/L) gibi koruyucu ajanlar, kabarcıkların etrafında 16–40 μm koruyucu bir tabaka oluşturarak hücrelerin yapışmasını önleyebilir [13] . Ancak, Tobias Weidner ve meslektaşlarının gözlemlediği gibi:
[Toplam gaz] yüzey alanı belirli bir eşiği aşarsa, Pluronic konsantrasyonu hücre koruması için artık yeterli değildir [13].
Bu, mühendislerin ölçek büyütme sırasında hücrelerin korunmasını sağlamak için gaz yüzey alanını Pluronic F68 konsantrasyonu ile dikkatlice izlemeleri gerektiği anlamına gelir.
Hassas hücre hatları için alternatif reaktör tasarımları çözümler sunabilir. Örneğin, hava kaldırmalı reaktörler mekanik karıştırıcıları ortadan kaldırarak daha nazik bir karıştırma ortamı yaratır [7]. Sabit yataklı biyoreaktörler, 10⁻³ ila 10⁻² Pa arasında değişen ultra düşük duvar kayma gerilimlerini koruyabilen başka bir seçenektir [17]. Özelleşmiş düşük kayma sistemlerini araştıran ekipler için,
Ayrıca, sığır miyoblastlarını 25 popülasyon çoğalmasının altında tutmak, farklılaşma kapasitelerini korumak için esastır [16]. Bu eşiğin aşılması, her geçişte füzyon indeksinde yaklaşık %6.81'lik bir azalmaya yol açabilir [16], hücrelerin kas lifleri oluşturma yeteneğini azaltır. Bunu ele almak için, proses mühendisleri laboratuvardan endüstriyel sistemlere ölçek büyütmeden önce yüksek kayma bölgelerini belirlemek için Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) modellemesini kullanmalıdır. Bu yaklaşım, ölçek büyütme sırasında daha sorunsuz geçişler ve daha iyi sonuçlar sağlar.
SSS
Biyoreaktörümde kayma gerilimini nasıl ölçerim?
Biyoreaktörlerde kayma gerilimi genellikle Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) gibi hesaplamalı modelleme teknikleri kullanılarak değerlendirilir. Bu yöntemler, akış desenlerinin analizine ve biyoreaktör içindeki kayma bölgelerinin tanımlanmasına olanak tanır. Ayrıca, küçük ölçekli kayma test araçları, belirli hücre hatlarının ne kadar hassas olduğunu karakterize etmek ve çeşitli süreç koşullarını değerlendirmek için değerlidir. Sürekli izleme için, kayma gerilimi, akışkan hızı ve viskozitesi hesaplanarak belirlenebilir. Bu yaklaşım, özellikle mikroakışkan sistemlerde veya çevrimiçi kayma gerilimi hesaplayıcıları kullanılarak etkilidir.
Hangi havalandırma yöntemi kabarcık patlama hasarını en aza indirir?
Kabarcık patlama hasarını en aza indirmek büyük ölçüde daha küçük kabarcıklar kullanmaya dayanır. Bu kabarcıklar, hacimden hacime karşılaştırıldığında daha az hücre hasarına neden olur.Kesin teknikler belirtilmemiş olsa da, baloncuk boyutunu ve davranışını yönetmek - boyutlarını düzenlemek gibi - patlamanın zararlı etkilerini azaltmada önemli bir rol oynar.
Kesme kuvvetini azaltmak için ölçek büyütürken neyi sabit tutmalıyım?
Yetiştirilen et biyoreaktörlerinin boyutunu artırırken, hücrelere zarar vermemek için kesme gerilimini yaklaşık 3 Pa'nın altında tutmak çok önemlidir. Karıştırma, akış desenleri, ve havalandırma gibi faktörlere dikkat ederek operasyon boyunca kesme seviyelerinin tutarlı kalmasını sağlayın.
