אם אתה משווה ערכי kLa מבלי להתאים את השיטה, המדיום, הטמפרטורה ותגובת הגשוש, אתה עלול לקבל החלטת הגדלה שגויה.
עבור מהנדסי ביופרוסס, מדעני תרביות תאים וצוותי מחקר ופיתוח של בשר מתורבת&, התשובה הקצרה היא פשוטה: שחרור גז סטטי הוא הטוב ביותר להערכת כלי, בעוד ששיטות חמצן דינמיות ואיזון גזים הן יותר שימושיות כאשר רוצים נתונים תהליכיים בתנאי מרק חיים. מספרי kLa מבוססי מים יכולים להטעות, עיכוב גשוש יכול לעוות קצבי העברה מהירים, ותוספי מדיה כמו Pluronic F-68 יכולים להפחית את kLa ב- 50% או יותר בכמה תצורות.
הנה המאמר במעבר אחד:
- kLa אינו יעד עצמאי. הייתי משתמש בו לצד P/V, מגבלות גזירה, זרימת גז וזמן ערבוב.
- הוצאת גז סטטית מספקת השוואת חומרה נקייה, אך היא מתעלמת מ-שלנו ואינה משקפת תרבות פעילה.
- שיטות דינמיות עוקבות אחר העברת חמצן במהלך התרבות וקרובות יותר למה שאתם מפעילים בקנה מידה גדול, אם כי הפסקה באוורור יכולה להלחיץ תאים.
- שיטות איזון חמצן משתמשות בנתוני גז כניסה ויציאה ומתאימות לכלים גדולים יותר, אך הן דורשות ניתוח גז מדויק.
- חמצון סולפיט ו-שיטות שלב לחץ מיועדות בעיקר לאפיון ציוד, לא למרק בשר מתורבת חי.
- זמן תגובת הגשש חשוב: גששי DO אופטיים מגיבים לעיתים קרובות ב-3-10 שניות, בעוד שגששים פולרוגרפיים מגיבים לעיתים קרובות ב- 8-30 שניות.
- טמפרטורה ומדיום חשובים: kLa שנמדד במים ב-20°C אינו מתאים בצורה נקייה למדיום תרבות ב-37°C.
- טווחים מדווחים טיפוסיים במאמר הם 50-200 h⁻¹ ב-2-10 L ו- 80-300 h⁻¹ ב- 50-500 L, אבל רק אם בסיס הבדיקה המלא תואם.
H.E.L מסביר | השגת העברת חמצן עקבית: השפעת kLa על הגדלת קנה מידה של תסיסה
sbb-itb-ffee270
השוואה מהירה
שיטות מדידת kLa להגדלת קנה מידה של ביוריאקטור: השוואה צד-לצד
| שיטה | הכי מתאים ל | חיסרון עיקרי | התאמת תהליך |
|---|---|---|---|
| שחרור גז סטטי | השוואת כלי וספרגר | אין דרישת חמצן של תאים חיים | נמוך עד בינוני |
| שיטה דינמית | עבודת הגדלת קנה מידה של תרבות פעילה | עצירת אוורור יכולה להפריע לתאים | גבוה |
| מאזן חמצן | ניטור בקנה מידה גדול יותר | דורש נתוני גז פליטה מדויקים | גבוה |
| חמצון סולפיט | בדיקות חומרה להעברה מקסימלית | לא כמו מדיה תהליכית | נמוך |
| שלב לחץ | איפיון כלי גדול | דורש התקנה מדורגת לחץ | בינוני |
אם הייתי קובע תוכנית הגדלה, במיוחד במעבר למערכות בקנה מידה ניסיוני, הייתי מתייחס לבחירת שיטה כחלק מבדיקת איכות הנתונים, ולא כמחשבה שנייה.
2. שיטות המדידה העיקריות של kLa המשמשות במחקרי ביוריאקטורים
הספרות נוטה לקבץ את מדידת kLa לשלוש משפחות שיטות עיקריות: שחרור גז סטטי, שיטות דינמיות ואיזון חמצן, ו-טכניקות כימיות או מבוססות לחץ. כל אחת מהן בוחנת את העברת החמצן מזווית מעט שונה. זה חשוב, כי השיטה עצמה יכולה לעצב איך נתוני ההגדלה נקראים.
2.1 שחרור גז סטטי
שחרור גז סטטי מתחיל בהוצאת החמצן מהנוזל, לרוב עם חנקן. לאחר מכן מופעלת מחדש האוורור, ומעקב אחר התאוששות החמצן המומס (DO) מתבצע לאורך זמן. kLa מחושב מקצב העלייה של ה-DO.
מכיוון שאין צורך בתאים חיים או בחומרים מסוכנים, שיטה זו היא דרך פשוטה להעריך ביוריאקטור. הבעיה היא שהיא לא משקפת נשימת תאים או את השינויים בתכונות המרק במהלך גידול התרבות. התוצאות תלויות גם במדיום, בעיצוב האימפלר, בעיצוב הספארגר, בזרימת הגז, בטמפרטורה ובשימוש באנטיפואם. לדוגמה, במיכל ערבוב של 400 ליטר, הוספת Pluronic F-68 בריכוז של 0.02 גרם/ליטר יכולה להפחית את kLa בלפחות 50% בהשוואה לרפרנס ללא התוסף [2].
בעיה מעשית אחת היא דינמיקת הגשש. אם תגובת החיישן איטית מדי, ה-kLa הנמדד מוטה ויש צורך בתיקון [1].
2.2 שיטות דינמיות ושיטות איזון חמצן בתנאי תהליך
אם המטרה היא רלוונטיות לתהליך ולא מדד מים נקיים, שיטות דינמיות בדרך כלל מספקות יותר מידע. בגרסה הנפוצה ביותר, האוורור מופסק לזמן קצר כך שנשימת התאים מורידה את רמת החמצן המומס. לאחר מכן האוורור מוחזר והמעבר של ההתאוששות מנותח. זה הופך את המדידה לקרובה יותר למה שהמרק עושה במהלך ריצה בפועל.
שיטת איזון החמצן נוקטת בדרך שונה.במקום להפריע לאוורור, הוא מעריך kLa מ-OTR פחות OUR, בדרך כלל עם ניתוח גזים כמו ספקטרומטריית מסה [2]. זה לא פולשני ושימושי במיוחד בכלים גדולים יותר. אבל יש מחיר: אתה צריך תוכנת בקרת ביופרוסס וחומרת ניתוח גזים אמינים ונתוני OUR אמינים.
לעבודת בשר מתורבת, שיטות אלו שימושיות מכיוון שהן משקפות העברת חמצן תחת אותם תנאי מרק ותאים הנראים במהלך הגדלה. הפשרה היא די ברורה. בשיטה הדינמית, רמת החמצן המומס (DO) יורדת במהלך הפסקת האוורור, וזה יכול להלחיץ את התרבות אם ההפסקה נמשכת זמן רב מדי.
שיטות כימיות ושיטות שלב לחץ משמשות יותר לאפיון ציוד מאשר לקריאת תהליך חיה.
2.3 שיטות חמצון סולפיט ושלב לחץ
למדידת ביצועים לא ביולוגית, שתי שיטות אחרות מופיעות לעיתים קרובות.הם טובים לאפיון חומרה, אך הם לא מייצגים ישירות מרק בשר מתורבת חי.
חמצון סולפיט משתמש בנתרן סולפיט, מחומצן בנוכחות קטליזטור, לצרוך חמצן מומס בקצב שממנו ניתן לחשב kLa. הבעיה פשוטה: הנוזל אינו מייצג מדיה ביולוגית, ולכן התוצאה לא מתורגמת ישירות למרק בשר מתורבת [2].
שיטת שינוי הלחץ משנה את לחץ הכלי בצורה מדורגת כדי לשנות את ריכוז הרוויה של החמצן (C*) תחת חוק הנרי. זה יוצר כוח מניע להעברת מסה מבלי לשנות את מהירות הערבול או קצב זרימת הגז [2]. זה שימושי כאשר קל יותר לשלוט בלחץ מאשר בערבול או באוורור. עם זאת, זה דורש כלים מדורגים ללחץ ושינויים בלחץ מבוקרים בקפדנות, מה שמגביל את השימוש היומיומי. אף על פי כן, זה נשאר שיטת מחקר שימושית לאפיון ציוד.
3. חוזקות, מגבלות והשוואה בין שיטות
ערכי kLa שפורסמו ניתנים להשוואה רק כאשר הגדרת הבדיקה וההנחות הבסיסיות זהות. אפילו טמפרטורה יכולה לשנות את התוצאה בכמות משמעותית. ואם מאמר אחד מתקן את זמן התגובה של חיישן החמצן המומס בעוד שאחר לא, אין להתייחס לערכים אלה כשווי ערך, גם כאשר שאר ההגדרה נראית זהה.
הפער הזה חשוב ביותר כאשר אתה מחליט מהו המספר עבור. האם זהו מדד חומרה? או שזהו מדד תהליכי שמשקף מה קורה בתרבות?
3.1 היכן שהשיטה הסטטית של גזים החוצה נשארת כשיטת הייחוס
השיטה הסטטית של גזים החוצה עדיין נחשבת לשיטה המועדפת להשוואת חומרה. אם המטרה היא להשוות עיצובים של מפזרים, גיאומטריות של מערבלים, או תצורות כלים בתנאים מבוקרים, היא עושה את העבודה היטב.זה פשוט, ניתן לשחזור, ולא דורש תאים חיים.
החיסרון ברור באותה מידה: kLa שנמדד במים הוא מנבא גרוע להעברת חמצן במדיה של בשר מתורבת. ערך ממים מזוקקים אומר לך משהו שימושי על הכלי עצמו, אבל הרבה פחות על הביצועים כאשר מדיה אמיתית נמצאת בשימוש.
זה המקום שבו שיטות דינמיות מתחילות להיות חשובות יותר. ברגע שהעבודה עוברת מאפיון הכלי לתרבות חיה, הרלוונטיות של התהליך מתחילה לעלות על השליטה במערכת נקייה.
3.2 היכן ששיטות דינמיות ופרופיל חמצן מומס מוסיפות רלוונטיות לתהליך
שיטות דינמיות קרובות יותר לתנאי תהליך אמיתיים מכיוון שהן מודדות העברת חמצן במהלך תרבות פעילה. זה אומר שהן לוכדות גם את דרישת החמצן וגם את התכונות האמיתיות של המרק. עבור עבודת הגדלה, זה הופך את התוצאה לשימושית הרבה יותר מאשר הערכה במים נקיים.
שיטת איזון החמצן מוסיפה קריאה רציפה ולא פולשנית בתנאי הפעלה, אם כי היא תלויה בניתוח גזי פליטה מדויק ובפעולה יציבה [2].
ההבדלים קלים יותר לזיהוי כאשר השיטות מוצגות זו לצד זו.
3.3 טבלת השוואה: שיטה המתאימה להגדלת היקף ייצור בשר מתורבת
| שיטה | עקרון | נתונים נדרשים | הנחות עיקריות | חוזקות | מגבלות | שימוש מיטבי |
|---|---|---|---|---|---|---|
| גזים סטטיים | עליית DO לאחר הפשטת N₂ בנוזל ללא תאים | מהלך זמן DO, זמן תגובת חיישן | נוזל מעורב היטב; ללא OUR | פשוט; ניתן לשחזור; אין צורך בתאים | מתעלם מ-OUR; רגיש להרכב המדיה ולעיכוב החיישן | איפיון כלי ראשוני; השוואת חומרה |
| שיטה דינמית | התאוששות DO במהלך תרבות פעילה לאחר עצירת אוורור קצרה | מהלך זמן DO, הערכת OUR | תרבות במצב כמעט יציב; יישום תיקון חיישן | משקף את תנאי המרק והתאים בפועל | הפסקת אוורור יכולה להלחיץ את התרבות; רגיש לעיכוב חיישן | אופטימיזציה של תהליך והגדלה במהלך צמיחה פעילה |
| איזון חמצן (ניתוח שלב גז) | מאזן מסה של O₂ בין גז כניסה לגז יציאה | קצבי זרימת גז מדויקים וריכוזי O₂ | פעולה יציבה | לא פולשני; רציף; ללא הפרעה לתרבות | דורש ניתוח גז פליטה מדויק מאוד | ניטור ייצור בקנה מידה גדול |
| חמצון סולפיט | חמצון כימי של נתרן סולפיט צורך O₂ | קצב צריכת סולפיט | קצב תגובה מוגבל על ידי העברת מסה | שימושי לקיבולת OTR מקסימלית | לא מייצג מדיה ביולוגית; יכול להעריך יתר על המידה kLa | ציוד לבדיקת ביצועים בלבד; לא לעבודה עם תרביות חיות |
| שיטת לחץ דינמית (DPM) | שינוי לחץ כדי לשנות את מסיסות החמצן | מהלך זמן של לחץ ו-DO | הלחץ מתאזן מהר יותר מהרכב הגז | נמנע מפיגור שלב גז; מתאים לכלים גדולים | דורש כלי מדורג לחץ ובקרה מדויקת על הלחץ | אפיון בקנה מידה גדול |
בחירות שיטה אלו משפיעות על האופן שבו יש להפוך נתוני kLa ליעדי הגדלה ובחירת ציוד.
4. שימוש בנתוני kLa בהגדלת קנה מידה ובחירת ציוד
4.1 קביעת יעדי הגדלת קנה מידה ממעבדה לקנה מידה פיילוט
לאחר שמדדתם kLa, המשימה הבאה היא להפוך את המספר הזה למגבלות תפעול עבור ערבוב, זרימת גז וערבול. יש להתייחס ל-kLa כאל מגבלה אחת, ולא כל ההחלטה. הוא צריך להיות גבוה מספיק כדי לעמוד בדרישת החמצן, אך לא כל כך גבוה שהתהליך ייכנס למשטר גזירה שהתאים שלכם לא יסבלו.
האיזון הזה חשוב בבשר מתורבת. שמירה על kLa קבוע בקנה מידה גדול יותר יכולה לדחוף אתכם למהירויות קצה של מערבל גבוהות יותר, ועם זאת, לגזירה גבוהה יותר [4]. בתרבית תאים יונקים, מהירויות קצה של מערבל של 0.1-0.5 m/s משמשות לעיתים קרובות לאיזון העברת חמצן מול לחץ גזירה [5]. אז בפועל, kLa נמצא בתוך חלון פעולה רחב יותר שכולל גם הספק קלט ליחידת נפח (P/V), מהירות גז שטחית ו-זמן ערבוב [4][5] .
מדד שימושי עוזר כאן. ב-2-10 L ריאקטור מעורבל בקנה מידה מעבדתי, kLa נופל לעיתים קרובות בטווח של 50-200 h⁻¹. בכלי בקנה מידה פיילוט של 50-500 L, טווח טיפוסי הוא 80-300 h⁻¹ [4] . השלב המרכזי הוא למצוא את החפיפה שכל הכלים יכולים להגיע אליה. זה מה שהופך יעד הגדלה מרעיון נחמד על הנייר למשהו שניתן להפעיל.
4.2 בחירת חיישנים וחומרה לעבודה אמינה עם kLa
נתוני הגדלה טובים מתחילים עם מכשירים וחומרת גז שלא מעוותים את התוצאה.
זמן תגובת החיישן משפיע ישירות על דיוק ה-kLa.במערכות עם kLa גבוה, השתמש ב-חיישני DO עם תגובה מהירה. חיישנים פולרוגרפיים איטיים זקוקים לתיקון ויכולים לקרוא kLa נמוך מדי. לחיישנים פולרוגרפיים יש בדרך כלל זמני תגובה של 8-30 שניות, בעוד שחיישנים מבוססי פלואורסצנציה אופטית מגיבים ב-3-10 שניות [4]. כלל טוב הוא שזמן התגובה של החיישן צריך להיות פחות מעשירית מקבוע הזמן של העברת המסה (1/kLa) [1] . אם אינך יכול לעמוד בתנאי זה, חיישנים אופטיים הם בדרך כלל האפשרות הבטוחה יותר.
העברת גז חשובה באותה מידה. בקרי זרימה תרמיים עוזרים לשמור על יציבות זרימת הגז, מה שהופך את המדידות לחוזרות יותר. בחירת מפזר משפיעה גם ישירות על ה-kLa שניתן להשיג [2][3]. בועות קטנות יותר מספקות שטח פנים גדול יותר בין גז לנוזל, אבל יש כאן מלכוד: תוספי מדיה יכולים להפחית את kLa בצורה חדה [2].
5. נקודות מפתח לפירוש מדידות kLa
ביחד, השיטה שתבחר צריכה להתאים לשאלת ההגדלה שאתה מנסה לענות עליה. בפועל, זה אומר להיות ברור אם אתה צריך אפיון חומרה או נתוני הגדלה ממוקדי תהליך.
ערך kLa שנמדד במים ב-20°C לא יכול להיות מועבר ישירות למדיה תרבותית ב-37°C. תיקון הטמפרטורה לבדו יוצר הבדל של כ-45% [4]. ו-kLa הוא לא משהו שניתן לחזות רק עם תיאוריה. כל ביוריאקטור צריך את kLa הנמדד שלו [1] .
זה חשוב עוד יותר כשעוברים מ-ספסל לקנה מידה פיילוט . גזים סטטיים במאגר תואם מלח כמו PBS נותנים לך מדד ציוד נקי. אך כאשר הסקאלה גדלה, מדידות דינמיות במדיום התרבות בפועל מספרות לך יותר על מה שהתהליך יעשה בפועל, מכיוון שתוספי מדיה יכולים לשנות את kLa במידה רבה [4]. אם אתה מסתמך על ערכים מבוססי מים, אתה עלול לסיים עם הגדרת יתר של קיבולת העברת חמצן בסקאלה.
הבדיקה האחרונה היא האם ה-kLa נמצא בתוך חלון הפעולה המלא. התייחס ל-kLa כאילוץ תהליך אחד, לא כיעד בפני עצמו. השתמש בו לצד P/V ו-מגבלות גזירה כאשר אתה בוחר את מערכת הביוראקטור הטובה ביותר ואסטרטגיית הערבול [4] .
שאלות נפוצות
איזו שיטת kLa עלי להשתמש לצורך הגדלה?
שיטת הוצאת גזים דינמית היא הדרך הנפוצה ביותר לקבוע kLa בביו-ריאקטורים עם מערבלים, וזוהי השיטה שרוב הצוותים ממליצים עליה בפועל. היא די מהירה, והיא נמנעת מהצורך בכימיקלים מסוכנים או אורגניזמים חיים.
לצורך הגדלת בשר מתורבת, עדיף למדוד ללא תאים כדי שחילוף החומרים של התאים לא יעוות את התוצאה. השתמש ב-תמיסת PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להתאים טוב יותר למדיום התהליך. ואם לפרוב חמצן מומס יש זמן תגובה איטי, יש ליישם תיקון. אם לא תעשה זאת, אתה עלול להמעיט בערך kLa .
מדוע ערכי kLa מבוססי מים לעיתים קרובות מטעים?
ערכי kLa מבוססי מים יכולים להטעות מכיוון שהם לא משקפים את ההתנהגות ה-פיזיקוכימית של מדיום תרבית תאים בפועל. מדיה אמיתית אינה רק מים עם חומרים מזינים מעורבבים. ריכוז המלח, הצמיגות, מתח הפנים והאנטי-קצף כולם משפיעים על העברת המסה של החמצן בדרכים שמבחני מים לא יראו.
הפער הזה חשוב. אם מתעלמים מהשפעות המדיה, הערכות אספקת החמצן שלך יכולות להתרחק ממה שהביוריאקטור עושה בפועל. דוגמה טובה היא אנטי-קצף: הוא יכול להגדיל את התלכדות הבועות, לצמצם את שטח הפנים ולהפחית את kLa עד 50%. בייצור בשר מתורבת, זה לא פרט קטן. זה יכול לשנות האם לתהליך יש מספיק מרווח להעברת חמצן או שהוא פועל קרוב יותר למגבלתו.
כיצד משפיעים עיכוב הגשש ותוספי המדיה על kLa?
עיכוב הגשש יכול לעוות מדידות kLa . אם חיישן החמצן המומס מגיב לאט מדי יחסית לקצב העברת החמצן, התוצאה יכולה להיות שגויה וייתכן שתצטרך תיקון לא לינארי.
תוספי מדיה יכולים גם לשנות את העברת החמצן בדרכים שחשובות.אלקטרוליטים ומלחים יכולים לדכא התמזגות בועות. Pluronic F68 עשוי להקטין את גודל הבועות. אנטיפומים לעיתים קרובות מגבירים התמזגות בועות, מה שמקטין את השטח הבין-פני האפקטיבי ומוריד את kLa .
