Schuifspanning kan de productie van gekweekt vlees maken of breken. Waarom? Omdat de gebruikte cellen geen beschermende wanden hebben, waardoor ze vatbaar zijn voor schade door vloeistofkrachten in bioreactoren. Dit artikel duikt in hoe schuifspanning deze cellen beïnvloedt, de drempels die ze aankunnen, en manieren om systemen te ontwerpen die hen beschermen.
Belangrijke inzichten:
- Schuifspanning ontstaat door vloeistofbeweging en kan kwetsbare dierlijke cellen beschadigen, wat leidt tot membraanschade, loslating of dood.
- De meeste zoogdiercellen verdragen 0,3–1,7 Pascal, maar zelfs lagere niveaus kunnen stressreacties activeren.
- Ontwerpkeuzes zoals het type roerwerk, beluchtingsmethoden en de geometrie van de bioreactor hebben direct invloed op schuifkrachten.
- Strategieën om schade te minimaliseren zijn onder andere het gebruik van zachtere bioreactorontwerpen (e.g. , airlift- of schommelsystemen), het optimaliseren van roersnelheden, en het toevoegen van beschermende middelen zoals Pluronic F68.
Voor gekweekt vlees is het beheren van deze balans cruciaal om ervoor te zorgen dat cellen groeien en differentiëren zonder schade, vooral naarmate de productie opschaalt. Laten we de wetenschap achter deze drempels en praktische oplossingen voor bioreactorontwerp verkennen.
110: Spinning Like Earth: Designing Low-Shear Bioreactors for Better Cell Culture with Olivier De...
Wat Beïnvloedt Schuifspanning in Bioreactoren
Het begrijpen van de factoren die schuifspanning in bioreactoren beïnvloeden, is cruciaal voor het optimaliseren van de omstandigheden, vooral wanneer delicate cellen betrokken zijn. Laten we duiken in de belangrijkste elementen die de intensiteit en distributie ervan vormgeven.
Bioreactorontwerp en Bedrijfsomstandigheden
Het ontwerp van een bioreactor speelt een grote rol bij het bepalen waar en hoe schuifspanning optreedt. Een belangrijke factor is het type roerwerk dat wordt gebruikt.Bijvoorbeeld, Rushton-turbines kunnen energiedissipatieniveaus creëren tot 280 keer hoger dan het gemiddelde van het vat, terwijl hoogrendement axiale stromingsimpellers zoals de HE3 niveaus produceren die dichter bij 180 keer de gemiddelde dissipatie liggen. [4]. Andere ontwerpelementen, zoals de diameter van de impeller, snelheid en positionering, beïnvloeden ook de energiedistributie.
Interessant genoeg, introduceert beluchting veel zwaardere krachten dan agitatie. Wanneer kleine belletjes (1–2 mm) barsten, geven ze energieniveaus vrij tussen 10⁷–10⁹ W/m³, wat meer dan 1.000 cellen in één keer kan doden [4]. Dit maakt het gedrag van belletjes een cruciale overweging, vooral in de productie van gekweekt vlees.
Schotten zijn een ander belangrijk ontwerpelement. Ze voorkomen de vorming van een vortex in de cultuur, die anders belletjes in de vloeistof zou trekken en het aantal barstgebeurtenissen aan het oppervlak zou verhogen [4]. Bovendien beïnvloeden de verhouding tussen de diameter van de waaier en het vat en de hoogte van de waaier vanaf de bodem hoe energie zich verspreidt door de bioreactor.
Ongelijke verdeling van schuifspanning
Schuifspanning is niet gelijkmatig verdeeld over de bioreactor. Onderzoek toont aan dat energiedissipatie de neiging heeft zich te concentreren rond specifieke zones, zoals het afvoergebied van de waaier, achterblijvende wervelingen en het vloeistofoppervlak waar bellen breken. Deze hotspots kunnen uitdagingen vormen tijdens opschaling.
Weiwei Hu van Biogen Idec benadrukt dit opschalingsprobleem:
De perceptie van 'schuifgevoeligheid' heeft historisch gezien een willekeurige bovengrens gesteld aan agitatie en beluchting in bioreactoroperaties; echter, naarmate de celdichtheden en productiviteiten blijven toenemen, kunnen massatransfervereisten die opgelegd door deze willekeurig lage limieten overschrijden [4].
Een voorbeeld hiervan is een studie uit 2021 door Junxuan Zhang en Xueliang Li van Jiangnan University, waarin een 250 mL spinnerfles werd vergeleken met een 20 m³ roertankreactor met behulp van computationele vloeistofdynamica. Ze observeerden dat zelfs bij de laagste roersnelheden de schuifkrachten in de grotere reactor sterk genoeg waren om cellen van microcarriers los te maken, waarbij beluchting nog meer stress veroorzaakte dan agitatie [3].
Cultuurformaat en Schuifgevoeligheid
Het cultuurformaat bepaalt ook hoe cellen schuifspanning ervaren. Cellen die op microcarriers worden gekweekt, zijn bijzonder kwetsbaar. Als intens mengen of botsingen tussen carriers ervoor zorgen dat cellen losraken, gaan die cellen effectief verloren [4]. Aan de andere kant hebben suspensieculturen van hybridomacellen veerkracht aangetoond, waarbij de levensvatbaarheid behouden blijft bij roersnelheden tot wel 1.500 RPM in bioreactoren met schotten zonder een lucht-vloeistof grensvlak [4].
Verschillende kweeksystemen gaan op verschillende manieren om met schuifkrachten. Fixed-bed bioreactoren minimaliseren schuifkrachten door cellen geïmmobiliseerd te houden op stationaire oppervlakken, terwijl gefluïdiseerde bedden matige tot hoge schuifkrachten introduceren door de beweging van microcarriers en opwaartse vloeistofstroom [2]. Sommige microcarriers, vooral poreuze, bieden interne oppervlakken die cellen kunnen beschermen tegen extreme krachten, waardoor ze betere bescherming bieden in vergelijking met vaste microcarriers [2]. Deze verschillen benadrukken de noodzaak om de levering van voedingsstoffen zorgvuldig in balans te brengen met het risico op celschade bij het ontwerpen van bioreactoren.
Afstroomspanning Drempels voor Verschillende Celtypen
Afstroomspanning Tolerantie Drempels voor Gekweekte Vlees Celtypen
Het beheren van afstroomspanning is cruciaal voor de productie van gekweekt vlees, aangezien ongelijke spanning schadelijk kan zijn voor cellen die geen sterke celwanden hebben. Het begrijpen van de specifieke spanningsniveaus die elk celtype kan verdragen, helpt bij het behouden van de gezondheid van cellen, het activeren van mechanosensitieve reacties of het bevorderen van differentiatie.
Drempelwaarden voor Veelvoorkomende Celtypen
De tolerantie voor afstroomspanning varieert aanzienlijk tussen celtypen, en het kennen van deze drempels is essentieel voor het verfijnen van bioreactorinstellingen.
Zo gedijen gekweekte vleesmyoblasten zoals de C2C12 lijn goed onder lage afstroomspanning. Cyclische spanning van ongeveer 1.68 mPa verbetert de vorming en fusie van myotubes [8] . Muisspier-afgeleide stamcellen (MDSC's) vertonen betere myogene differentiatie en uitgebreidere myotubevorming wanneer ze worden blootgesteld aan 16 mPa [8] . Naarmate myoblasten rijpen tot myotubes, kunnen ze hogere stressniveaus aan; gepulseerde stress tussen 400 mPa en 1,400 mPa activeert paden die de grootte van spiervezels reguleren, wat mogelijk leidt tot hypertrofie [8] .
Mesenchymale stamcellen (MSC's) reageren ook op unieke wijze. Bijvoorbeeld, canine MSC's die worden blootgesteld aan schuifspanning tussen 100 mPa en 1,500 mPa reguleren endotheliale markers zoals PECAM-1 en VE-cadherine omhoog terwijl ze gladde spiermarkers omlaag reguleren [10] .
Vergelijkingstabel voor afschuifspanningsdrempels
Hier is een snelle vergelijking van afschuifspanningsdrempels voor verschillende gekweekte vleesceltypen:
| Celtype | Afschuifspanningsdrempel (mPa) | Waargenomen effecten | Bron |
|---|---|---|---|
| Mammalencellen (Algemeen) | 300–1.700 | Basisbereik; niveaus boven dit kunnen leiden tot celschade of apoptose | [1] |
| C2C12 Myoblasten (Hechtend) | ~1.68 | Verbeterde levensvatbaarheid en verhoogde myotubevorming | [8] |
| Muis MDSCs (Hechtend) | ~16 | Verbeterde differentiatie en uitgebreide myotubevorming | [8] |
| C2C12 Myotubes (Hechtend) | 400–1,400 | Activatie van paden die de grootte van spiervezels reguleren (potentiële hypertrofie) | [8] |
| Canine MSCs | 100–1,500 | Opregulatie van endotheliale markers, verminderde gladde spiermarkers | [10] |
| Celoppervlaktesensoren (Integrines) | 100–1,000 | Activatie van mechanosensitieve ionkanalen en receptoren | [1] |
Voor context, het roeren van een cultuur bij 100–200 rpm in een standaard kolf genereert schuifspanningsniveaus van 300–660 mPa, terwijl orbitale schudders die draaien bij 20–60 rpm hogere krachten produceren variërend van 600 mPa tot 1,600 mPa [1]. Zachtere systemen zoals schommelende bioreactoren (±5° bij 1 Hz) creëren een spanning van ongeveer 90 mPa [9], en clinostaat bioreactoren werken rond 10 mPa, en blijven ruim onder de activeringsdrempel voor mechanosensitieve celoppervlaksensoren [1].
Deze drempels dienen als richtlijn voor het aanpassen van bioreactoromstandigheden, wat helpt om optimale omgevingen te behouden tijdens opschaling en celgroeifasen.
sbb-itb-ffee270
Hoe Schade door Schuifspanning te Verminderen
Het minimaliseren van schade door schuifspanning in de productie van gekweekt vlees draait om het bereiken van een delicate balans. Het doel is om efficiënte menging en zuurstoftoevoer te garanderen, terwijl gevoelige cellen worden beschermd tegen mechanische schade. Dit omvat een combinatie van slim bioreactorontwerp en doordachte operationele strategieën.
Wijzigingen in Bioreactorontwerp
Het gebruik van CFD (Computational Fluid Dynamics) modellering is een belangrijke stap in het optimaliseren van de prestaties van bioreactoren. Moderne CFD-technieken omvatten nu meerfasenstromingssimulaties, die rekening houden met de interacties tussen cellen en microcarriers. Dit resulteert in nauwkeurigere beoordelingen van schuifspanning en de mogelijke schade ervan [5].
Het type bioreactor speelt een belangrijke rol bij het bepalen van de niveaus van schuifspanning. Hoewel geroerde tankreactoren nog steeds veel worden gebruikt, kunnen alternatieve ontwerpen zachtere omstandigheden bieden:
- Airlift-bioreactoren: Deze elimineren mechanische roerwerken en gebruiken in plaats daarvan gasgeïnduceerde circulatie om mechanische schuifspanning te verminderen [5].
- Wave- of schommelbioreactoren: Door te vertrouwen op oppervlaktebeweging in plaats van roerwerken, zijn deze ideaal voor culturen met lage tot middelhoge dichtheid die zachte menging vereisen [5].
- Verticale-wielbioreactoren: Bijzonder effectief voor op aggregaten gebaseerde culturen, deze hebben succes getoond in het behouden van celviabiliteit tijdens de expansie van menselijke iPSC-aggregaten [11].
Een andere belangrijke factor is het niet-Newtoniaanse gedrag van celsuspensies. Bijvoorbeeld, suspensies die serum bevatten vertonen shear-thinning eigenschappen, die traditionele modellen vaak niet kunnen vastleggen. Het gebruik van geavanceerde modellen, zoals het Sisko-model, biedt nauwkeurigere voorspellingen van schuifspanning, wat helpt om mechanische krachten fijn af te stemmen en drempels te vermijden die genetische expressie zouden kunnen veranderen [6].
Celzaaien en Agitatiemethoden
Operationele strategieën spelen ook een grote rol bij het verminderen van schade door schuifspanning. Bijvoorbeeld, intermitterende agitatie tijdens de vroege stadia van celhechting kan de blootstelling aan schuifspanning beperken terwijl toch wordt gezorgd voor een effectieve verdeling van voedingsstoffen. Het aanpassen van agitatie vereist zorgvuldige overweging van factoren zoals serumgehalte, celdichtheid en de leeftijd van de cultuur [6].
Bij het bepalen van agitatiesnelheden kan CFD-modellering helpen om de ideale balans te vinden - voldoende zuurstofoverdracht zonder mechanische schade te veroorzaken. Gesegmenteerde simulaties kunnen de verdeling van schuifspanning verder verfijnen, waardoor het proces efficiënter wordt [5].
Impact op Bioreactorontwerp en Opschaling
Bij het opschalen van bioreactoren voor de productie van gekweekt vlees is het begrijpen en toepassen van schuifspanningdrempels cruciaal. Deze drempels beïnvloeden beslissingen over de snelheid van de roerder, het ontwerp van de sparger en andere parameters om de levensvatbaarheid van cellen te waarborgen naarmate de productievolumes toenemen.
Instellen van Bioreactor Bedrijfsparameters
Schuifspanningdrempels spelen een sleutelrol bij het definiëren van operationele limieten. Bijvoorbeeld, hematopoëtische stamcellen (HSC's) hebben een drempel van ongeveer 0.092 Pa[12]. Onder dit niveau blijven - zoals werken op 50 rpm, wat ongeveer 0.068 Pa genereert - ondersteunt gezonde celuitbreiding, met een 27.4‐voudige toename. Echter, het verhogen van de agitatie naar 100 rpm verhoogt de schuifspanning tot ongeveer 0.192 Pa, wat resulteert in een 72% apoptosepercentage en beperkt de uitbreiding tot 24.5‐voudig[12].
"De drempel schuifspanning voor de proliferatie en functie van HSC's is gerapporteerd als 0,092 Pa." – Hosseinizand et al. [12]
Schade door schuifspanning treedt op wanneer turbulente wervelingen kleiner worden dan ongeveer tweederde van de diameter van een cel of aggregaat[12][13]. Bij 50 rpm meten wervelingen ongeveer 280 µm, wat veilig is voor cellen. Maar bij 100 rpm krimpen wervelingen tot 166 µm, wat het risico op mechanische schade vergroot.
Sparging introduceert extra hydrodynamische stress. Kleine bellen (1 mm diameter) genereren lokale vloeistofsnelheden van ongeveer 6,4 m/s tijdens het barsten, terwijl grotere bellen van 6 mm zachtere pieken van 0,94 m/s[13]. Om dit tegen te gaan, worden additieven zoals Pluronic F68 gebruikt om te voorkomen dat cellen aan het oppervlak van bellen blijven plakken.Echter, hun effectiviteit hangt af van het handhaven van de juiste concentratie ten opzichte van het gasoppervlak [13].
Deze parameters zijn essentieel bij de overgang naar grotere bioreactorsystemen.
Het handhaven van condities tijdens opschaling
Opschalen van een 250 mL spinnerfles naar een 20 m³ roertankreactor brengt unieke uitdagingen met zich mee. Hydrodynamische condities in kleinschalige systemen vertalen zich niet direct naar industriële volumes. Zelfs het bedienen van grote reactoren bij minimale roersnelheden kan resulteren in schuifkrachten die sterk genoeg zijn om cellen van microcarriers los te maken[3].
"Zelfs wanneer ze worden bediend bij een roersnelheid dicht bij de Njs, kan de schuifkracht die alleen door de roerwerken wordt uitgeoefend, celonthechting van microcarriers veroorzaken, terwijl nog meer hydrodynamische stress wordt geïntroduceerd via sparging." – Zhang et al.[3]
Om consistente schuifomstandigheden te behouden tijdens opschaling, is een benadering om de snelheid van de impellertip constant te houden. Dit kan echter leiden tot langere mengtijden en de vorming van nutriënten- en zuurstofgradiënten, wat de celgroei en prestaties negatief kan beïnvloeden[3]. Computational Fluid Dynamics (CFD) modellering wordt essentieel voor het identificeren van spanningszones en het optimaliseren van het reactorontwerp tijdens opschaling[5].
Voor cellijnen die zeer gevoelig zijn voor schuifkrachten, zijn alternatieve reactorontwerpen vaak geschikter. Airlift-reactoren, die mechanische roerwerken elimineren, zijn met succes gemodelleerd voor volumes tot 300.000 L, waarbij theoretische celdichtheden van 2 × 10⁸ cellen/mL[7]. Evenzo gebruiken schommelende bioreactoren zachte golfbewegingen om schuifspanning te minimaliseren, waardoor ze effectief zijn voor zaadtreinen tot 500 L[14][15]. Platforms zoals
Samenvatting en Aanbevelingen
Het effectief beheren van schuifspanning is cruciaal voor het behoud van celviabiliteit en productiviteit in de productie van gekweekt vlees. Onderzoek toont aan dat het barsten van bellen tijdens beluchting meer schadelijke krachten creëert dan mechanische roering. Bijvoorbeeld, kleine bellen (1 mm) genereren vloeistofsnelheden van 6,4 m/s bij het barsten, terwijl grotere bellen (6 mm) zachtere pieken van 0,94 m/s produceren [13]. Om deze krachten te minimaliseren, moeten inkoopteams zich richten op bioreactoren uitgerust met gesinterde microspargers (15-μm poriegrootte), die pulserende beluchting mogelijk maken en het gas-vloeistofgrensvlak verminderen. Deze overwegingen zijn van vitaal belang voor het opschalen van bioreactorsystemen.
Een andere belangrijke factor is de verhouding van wervelschaal tot celdiameter (η/d_c), die kan helpen schade door roeren te verminderen. Een studie uitgevoerd in augustus 2017 door het Institute of Bioprocess Engineering and Pharmaceutical Technology benadrukt dit. Met behulp van een 3-L Applikon glazen bioreactor met Sf21 insectencellen, toonden ze aan dat een zesbladige Rushton-impeller bij 205 rpm, gecombineerd met 199 μm bellen, een GFP-eiwitopbrengst van 12,75 μg/mL produceerde. Daarentegen leverde een schuinbladige impeller bij 171 rpm, die een hoger specifiek gasoppervlak van 18,0 m²/m³ genereerde, slechts 4,0 μg/mL [13]. Dit toont aan dat het totale gasoppervlak meer invloed heeft dan de roersnelheid.
Beschermende middelen zoals Pluronic F68 (0,5–3 g/L) kunnen een beschermende laag van 16–40 μm rond bellen vormen, waardoor cellen zich niet kunnen hechten [13]. Echter, zoals Tobias Weidner en collega's observeerden:
Als het [totale gas] oppervlak een bepaalde drempel overschrijdt, is de concentratie van Pluronic niet langer voldoende voor celbescherming [13].
Dit betekent dat ingenieurs het gasoppervlak zorgvuldig moeten monitoren in relatie tot de concentratie van Pluronic F68 tijdens opschaling om ervoor te zorgen dat cellen beschermd blijven.
Voor gevoelige cellijnen kunnen alternatieve reactorontwerpen oplossingen bieden. Airlift-reactoren, bijvoorbeeld, elimineren mechanische roerwerken, waardoor een zachtere mengomgeving ontstaat [7]. Vastbedbioreactoren zijn een andere optie, in staat om ultra-lage wandafschuifspanningen te handhaven variërend van 10⁻³ tot 10⁻² Pa [17]. Voor teams die gespecialiseerde lage-schuifsystemen verkennen, bieden leveranciers zoals
Bovendien is het essentieel om rundermyoblasten onder 25 populatiedubbelingen te houden om hun differentiatiecapaciteit te behouden [16]. Het overschrijden van deze drempel kan leiden tot een afname van de fusie-index met ongeveer 6,81% bij elke passage [16], waardoor het vermogen van de cellen om spiervezels te vormen wordt verminderd. Om dit aan te pakken, moeten procestechnologen gebruik maken van Computational Fluid Dynamics (CFD) modellering om hoge-schuifzones te identificeren voordat ze opschalen van laboratorium- naar industriële systemen. Deze aanpak zorgt voor soepelere overgangen en betere resultaten tijdens opschaling.
Veelgestelde Vragen
Hoe meet ik schuifspanning in mijn bioreactor?
Schuifspanning in bioreactoren wordt vaak beoordeeld met behulp van computational modelling technieken zoals Computational Fluid Dynamics (CFD). Deze methoden maken het mogelijk om stromingspatronen te analyseren en schuifzones binnen de bioreactor te identificeren. Bovendien zijn kleinschalige schuiftesttools waardevol voor het karakteriseren van hoe gevoelig specifieke cellijnen zijn en voor het evalueren van verschillende procesomstandigheden. Voor continue monitoring kan schuifspanning worden bepaald door de vloeistofsnelheid en viscositeit te berekenen. Deze benadering is bijzonder effectief in microfluïdische systemen of door gebruik te maken van online schuifspanning calculators.
Welke beluchtingsmethode minimaliseert schade door het barsten van bellen?
Het minimaliseren van schade door het barsten van bellen hangt sterk af van het gebruik van kleinere bellen. Deze bellen veroorzaken minder celschade wanneer ze worden vergeleken op basis van volume-tot-volume.Hoewel exacte technieken niet worden beschreven, speelt het beheren van de grootte en het gedrag van bellen - zoals het reguleren van hun grootte - een cruciale rol bij het verminderen van de schadelijke effecten van barsten.
Wat moet ik constant houden bij het opschalen om de schuifspanning te verminderen?
Bij het vergroten van de grootte van bioreactoren voor gekweekt vlees is het cruciaal om de schuifspanning onder ongeveer 3 Pa te houden om schade aan de cellen te voorkomen. Besteed speciale aandacht aan factoren zoals agitatie, stroompatronen, en aeratie om ervoor te zorgen dat de schuifniveaus consistent blijven gedurende de hele operatie.
