Criopreservação é o processo de congelar e armazenar células vivas a temperaturas ultra-baixas para manter sua viabilidade ao longo do tempo. Este método é crítico para a produção de carne cultivada, garantindo linhagens celulares consistentes e estáveis e protegendo contra perdas devido à contaminação ou falhas de equipamentos. As etapas principais incluem:
- Preparação: Colha células durante sua fase de crescimento, verifique a viabilidade (visando ≥90%) e prepare-as em meio de congelamento com crioprotetores como DMSO ou glicerol.
- Congelamento: Use uma taxa de resfriamento controlada (-1°C a -3°C por minuto) para evitar danos por cristais de gelo. Armazene as células em vapor de nitrogênio líquido (-135°C a -190°C) para preservação a longo prazo.
- Descongelamento: Descongele rapidamente as células em um banho-maria a 37°C para minimizar a toxicidade do crioprotetor, em seguida, transfira-as para meio de crescimento para recuperação.
- Controle de Qualidade: Rotule os frascos com precisão, monitore as condições de armazenamento e teste a viabilidade após o descongelamento para garantir a preservação bem-sucedida.
Protocolo Completo de Criopreservação para Linhagens Celulares: Processo de 4 Etapas da Preparação ao Armazenamento
Preparando Células para Criopreservação
Coleta de Células e Verificações de Viabilidade
Para garantir a melhor recuperação após o descongelamento, colete células durante sua fase de crescimento logarítmico (log). Para linhagens celulares aderentes, isso geralmente ocorre quando atingem 80–90% de confluência [2][3][6].
Verifique a viabilidade das células usando o método de exclusão de Azul de Trypan. Misture partes iguais (1:1) de 0,4% de Azul de Trypan com a suspensão celular e, em seguida, conte as células usando um hemocitômetro.Células viáveis excluirão o corante e aparecerão brilhantes sob o microscópio, enquanto células não viáveis mancharão de azul [4]. Idealmente, busque uma viabilidade de pelo menos 90% para as melhores taxas de recuperação, embora alguns protocolos possam aceitar um mínimo de 75% [1][2][3][5].
Antes da colheita, use um microscópio para verificar a contaminação bacteriana ou fúngica. Células de suspensão saudáveis devem aparecer brilhantes, redondas e refratárias sob um microscópio invertido de contraste de fase [2][3].
Uma vez que as células atendam aos padrões de viabilidade exigidos, prossiga para as etapas de pré-congelamento.
Preparações Pré-Congelamento
Para células aderentes, utilize métodos de dissociação suaves, como tripsina ou TrypLE Express, e limite o tempo de incubação para evitar danos às membranas celulares [5]. Prepare as células em uma concentração de 1 × 10⁶ a 1 × 10⁷ células/mL, dependendo da linhagem celular [1][6]. Ao alíquotar, assegure-se de que a suspensão celular seja misturada frequentemente para manter a distribuição uniforme entre os crioviais [5].
Mantenha o meio de congelamento refrigerado entre 2°C e 8°C durante a ressuspensão para reduzir a toxicidade do crioprotetor antes que o processo de congelamento comece [5]. Uma vez que as células estejam suspensas no meio de congelamento, avance rapidamente para o protocolo de congelamento [1].Sempre criopreserve as células na menor passagem possível para reduzir o risco de deriva genética ou mudanças morfológicas [5][7].
Selecionando Crioprotetores e Meios de Congelamento
Opções de Crioprotetores e Suas Funções
Dimetilsulfóxido (DMSO) é amplamente utilizado como crioprotetor, tipicamente em uma concentração de 10% [2]. Ele atua penetrando nas membranas celulares e reduzindo a formação de gelo durante o congelamento. No entanto, o DMSO pode ser tóxico para as células à temperatura ambiente, portanto, o descongelamento rápido é essencial para minimizar a exposição e diluí-lo rapidamente [1].
Glicerol serve como uma alternativa útil para linhagens celulares sensíveis ao DMSO, geralmente utilizado em concentrações variando de 5% a 15% [8].É particularmente eficaz para tipos celulares onde o DMSO pode causar diferenciação indesejada [3], e tende a ter menor toxicidade em comparação ao DMSO.
Em aplicações de carne cultivada, os protocolos tradicionais de congelamento geralmente utilizam uma mistura de 90% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 10% de DMSO [1]. No entanto, a dependência de componentes de origem animal limita esses métodos em termos de escalabilidade e aprovação regulatória [9]. Para abordar essas questões, meios quimicamente definidos - como Synth-a-Freeze ou Recovery Cell Culture Medium - oferecem uma alternativa livre de componentes animais. Esses meios mantêm alta viabilidade celular pós-descongelamento, superando os desafios associados a componentes de origem animal [9].
Comparação de Meios de Congelamento
Aqui está uma análise das vantagens e limitações de vários meios de congelamento utilizados na produção de carne cultivada:
| Meio | Prós | Contras | Compatibilidade com Carne Cultivada |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO em FBS-DMEM | Protocolos estabelecidos [1] | Contém componentes de origem animal; variabilidade entre lotes [9] | Escalabilidade limitada |
| Synth-a-Freeze | Quimicamente definido; qualidade consistente; livre de componentes animais [9] | Custo inicial mais alto [9] | Sim |
| Meio de Cultura Celular de Recuperação | Fácil de usar; projetado para recuperação rápida [9] | Pode precisar de otimização para linhagens celulares específicas | Sim |
| 10% Glicerol em FBS | Alternativa para células sensíveis ao DMSO [1] | Baseia-se em soro de origem animal [9] | Escalabilidade limitada |
Em fevereiro de 2023, pesquisadores da Universidade Médica de Mulheres de Tóquio, liderados por Hironobu Takahashi, demonstraram a importância de escolher o meio de congelamento adequado.Usando opções comerciais como CELLBANKER 1 e 2, eles conseguiram criopreservar células miogênicas bovinas primárias a –80°C por até um ano. Notavelmente, essas células mantiveram sua capacidade de proliferar e diferenciar-se em tecido muscular contrátil com estruturas de sarcômero intactas após o descongelamento [10].
Para a produção de carne cultivada, meios quimicamente definidos e compatíveis com GMP estão se tornando cada vez mais favorecidos. Como STEMCELL Technologies destaca:
Em campos altamente regulamentados, como terapia celular e gênica, é recomendado usar um meio de criopreservação totalmente definido e fabricado sob GMP para garantir que os produtos sejam consistentemente produzidos e controlados de acordo com os padrões de qualidade [9].
Plataformas como
Procedimento de Criopreservação e Taxas de Resfriamento
Protocolo de Congelamento Passo a Passo
A chave para uma criopreservação bem-sucedida está em manter uma taxa de resfriamento constante de -1°C a -3°C por minuto[2]. Esse processo gradual permite que a água saia das células lentamente, prevenindo a formação de cristais de gelo intracelular prejudiciais que poderiam romper as membranas celulares[1].
Comece centrifugando as células a 150 x g por 5 minutos[3]. Uma vez centrifugadas, ressuspenda o pellet celular em um meio de congelamento frio contendo 10% DMSO a uma concentração de 2–4×10⁶ células/mL[3].Para reduzir a exposição ao DMSO, mova-se rapidamente para a próxima etapa - congelamento.
Distribua a suspensão celular em frascos criogênicos pré-rotulados. Cada frasco deve indicar claramente detalhes essenciais, como o nome da linha celular, número de passagem, número do lote, concentração celular e a data de congelamento[3]. Com os frascos preparados, é hora de selecionar e utilizar o equipamento de resfriamento apropriado.
Equipamento e Técnicas de Resfriamento
Coloque os frascos imediatamente em um dispositivo de resfriamento de taxa controlada. Contêineres de congelamento passivos, como o Nalgene "Mr Frosty" (que utiliza isopropanol) ou o Corning "CoolCell", são escolhas populares. Essas ferramentas podem alcançar uma taxa de resfriamento de aproximadamente 1°C por minuto quando colocadas em um freezer a -80°C[2].
Para operações em larga escala onde a consistência é crítica, um freezer programável com controle de taxa é a melhor opção. Como afirmado por Sigma-Aldrich:
ECACC utiliza rotineiramente um freezer programável com controle de taxa. Esta é a maneira mais confiável e reprodutível de congelar células[3].
Após cerca de 24 horas a -80°C, transfira os frascos para a fase vapor do nitrogênio líquido, onde as temperaturas variam entre -135°C e -190°C, para armazenamento a longo prazo[4]. Evite armazenar células a -80°C por mais de uma semana, pois isso pode comprometer sua viabilidade. Temperaturas abaixo de -135°C são essenciais para preservação indefinida[2]. Usar a fase vapor em vez da fase líquida reduz o risco de contaminação cruzada enquanto mantém temperaturas suficientemente baixas.
Protocolos de Descongelamento e Recuperação
Processo de Descongelamento
Descongelar as células rapidamente é crucial para limitar a exposição ao crioprotetor tóxico e prevenir danos causados por cristais de gelo. Certifique-se de usar um visor facial completo e luvas isolantes para segurança. Comece removendo o criovial do nitrogênio líquido e afrouxando ligeiramente a tampa para liberar qualquer pressão acumulada. Em seguida, aperte novamente a tampa.
Coloque o frasco em um banho-maria a 37°C, garantindo que a tampa permaneça acima da linha da água. Deixe descongelar por 1–2 minutos, ou até que restem apenas alguns cristais de gelo. Uma vez descongelado, limpe o exterior do frasco com álcool a 70% para manter a esterilidade.
Transfira o conteúdo do frasco para um tubo contendo 5–10 mL de meio de crescimento pré-aquecido. Adicione o meio lentamente para ajudar a reduzir o choque osmótico. Se você estiver trabalhando com linhagens celulares em suspensão, centrifugue a suspensão celular imediatamente a 300 × g por 5 minutos a 4°C.Esta etapa ajuda a pelotear as células e remove o crioprotetor. Após a centrifugação, ressuspenda as células em meio fresco. Para células aderentes, a centrifugação geralmente não é necessária. Em vez disso, semeie diretamente as células em um recipiente de cultura adequado e remova qualquer DMSO residual durante a primeira troca de meio, normalmente após 24 horas.
Avaliações Pós-descongelamento
Logo após o descongelamento, verifique a viabilidade celular para garantir que a recuperação foi bem-sucedida. Utilize o método de exclusão de Azul de Trypan para esta avaliação. Idealmente, a viabilidade celular deve exceder 90% [11], mas um mínimo de 75% é aceitável. Após 24 horas, inspecione as células sob um microscópio de contraste de fase para confirmar a adesão, avaliar a densidade celular e verificar sinais de contaminação.
Continue monitorando as células através dos passagens 1–3 para garantir a proliferação normal e que elas mantenham suas características esperadas. Para linhagens celulares que se recuperam mais lentamente, você pode melhorar a sobrevivência aumentando a concentração inicial de soro bovino fetal para cerca de 20% v/v.
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Armazenamento e Viabilidade a Longo Prazo
Condições e Duração de Armazenamento
Para manter a viabilidade da linhagem celular a longo prazo, é essencial armazená-las a temperaturas abaixo de -135°C [7][2]. Isso garante que permaneçam preservadas indefinidamente.
O método preferido para armazenar linhagens celulares de carne cultivada é o nitrogênio líquido em fase vapor. Essa técnica mantém as temperaturas entre -135°C e -190°C, tornando-a ideal para preservação a longo prazo, ao mesmo tempo em que oferece maior segurança em comparação com o armazenamento em fase líquida.
Se você precisar armazenar células a -80°C, limite isso a um período de 24 horas a uma semana. Além disso, a viabilidade celular pode diminuir.Para armazenamento temporário a esta temperatura, transfira as células para armazenamento em nitrogênio líquido o mais rápido possível.
Use frascos criogênicos estéreis padrão (1–2 mL) com rosca interna e um anel O para armazenamento seguro [4][5]. Sempre coloque os frascos criogênicos selados na fase gasosa em vez da fase líquida do nitrogênio para reduzir o risco de explosões dos frascos durante o descongelamento [5]. Além disso, certifique-se de que os recipientes de nitrogênio líquido em grande quantidade sejam mantidos pelo menos meio cheios para manter uma margem de segurança.
Por fim, medidas rigorosas de controle de qualidade são críticas para garantir a viabilidade a longo prazo das células.
Verificações de Controle de Qualidade
Para garantir a confiabilidade das linhagens celulares armazenadas, siga protocolos rigorosos de controle de qualidade. Comece rotulando com precisão cada frasco com rótulos resistentes ao nitrogênio líquido.Inclua detalhes essenciais, como a identidade da linha celular, número do lote, número de passagem e data de congelamento. Mantenha um banco de dados eletrônico para registrar a localização exata de cada frasco, o que reduz o tempo que os recipientes de armazenamento precisam permanecer abertos [7][2].
Antes de comprometer lotes inteiros para armazenamento a longo prazo, teste a viabilidade de um frasco após armazenamento em fase gasosa de curto prazo. Esta etapa ajuda a confirmar que o processo de congelamento foi bem-sucedido e identifica quaisquer problemas potenciais [4][7][2]. Para estoques celulares altamente valiosos, é prudente armazenar duplicatas em um local secundário para proteger contra falhas de equipamentos ou desastres locais [7][2].
Equipar todos os recipientes de armazenamento com sistemas de monitoramento de temperatura e alarmes para detectar níveis baixos de nitrogênio líquido [7]. Além disso, instalar alarmes de oxigênio nas áreas de armazenamento, configurados para disparar a 18% de oxigênio (v/v), para minimizar os riscos de asfixia para o pessoal que trabalha com nitrogênio líquido [7][2].
Protocolo em vídeo de criopreservação de linhagens celulares de mamíferos
Conclusão e Principais Conclusões
Aqui está um rápido resumo dos passos essenciais e recomendações para uma criopreservação eficaz na produção de carne cultivada:
- Coleta de Células: Coletar células durante sua fase de crescimento logarítmico, garantindo que a viabilidade exceda 90%. Usar 10% de DMSO como crioprotetor, embora o glicerol possa ser uma alternativa para linhagens celulares mais delicadas [11][1].
- Resfriamento e Armazenamento: Mantenha uma taxa de resfriamento controlada e transfira rapidamente os frascos para armazenamento em nitrogênio líquido na fase vapor para proteger a integridade celular [11]
Um estudo de Roka Kakehi et al. destaca a importância da precisão na criopreservação [10]:
"Garantir uma fonte confiável e consistente de células usando criopreservação nos permitirá aumentar o fornecimento estável de células promissoras para a produção de carne cultivada." - Roka Kakehi et al., Universidade Médica de Tóquio
- Processo de Descongelamento: Descongele as células em um banho-maria a 37°C por cerca de dois minutos, parando quando 80% do gelo tiver derretido. Isso reduz a toxicidade do DMSO e melhora a recuperação celular [1]. Siga com verificações de viabilidade pós-descongelamento para garantir o sucesso e ajustar procedimentos futuros.
Esses métodos trabalham em conjunto com práticas rigorosas de controle de qualidade. Sempre rotule os frascos com precisão, mantenha registros organizados e implemente verificações minuciosas antes do armazenamento a longo prazo [11]. Para necessidades especializadas de criopreservação, plataformas como
Perguntas Frequentes
Quais são as vantagens de usar meios quimicamente definidos para criopreservar linhagens celulares na produção de carne cultivada?
Meios quimicamente definidos trazem múltiplos benefícios quando se trata de criopreservar linhagens celulares para a produção de carne cultivada. Ao remover componentes indefinidos, como soro de origem animal, eles garantem resultados consistentes e previsíveis - um fator crucial para manter a confiabilidade a longo prazo das linhagens celulares.
Outra vantagem importante é o risco reduzido de contaminação e variabilidade. Isso não apenas apoia padrões de qualidade e segurança mais elevados, mas também se alinha perfeitamente com a precisão e escalabilidade necessárias para atender tanto às exigências regulatórias quanto às expectativas dos consumidores na indústria de carne cultivada.
Como a escolha do crioprotetor influencia a sobrevivência celular durante o congelamento e descongelamento?
A escolha do crioprotetor é um fator chave na preservação da saúde celular durante o congelamento e descongelamento. Duas opções amplamente utilizadas são dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol, cada uma com características distintas. O DMSO é conhecido por sua capacidade de penetrar nas células rapidamente e fornecer forte proteção. No entanto, vem com uma advertência: em altas concentrações ou com exposição prolongada, pode se tornar tóxico, potencialmente reduzindo a viabilidade celular.
O glicerol, em contraste, é menos tóxico e pode ser aplicado diretamente.Sua desvantagem reside em sua taxa mais lenta de penetração celular, o que pode resultar em proteção menos imediata em comparação com o DMSO.
Alcançar o equilíbrio certo é crucial. Ajustar corretamente a concentração e o tempo de exposição do crioprotetor ajuda a proteger as células enquanto minimiza o risco de toxicidade. Além disso, aderir às melhores práticas para taxas de resfriamento e condições de armazenamento é essencial para garantir as taxas de recuperação mais altas possíveis após o descongelamento.
Por que é importante controlar a taxa de resfriamento durante a criopreservação?
Manter uma taxa de resfriamento constante, geralmente entre –1°C e –3°C por minuto, é fundamental para manter as células viáveis. O resfriamento gradual permite que as células se desidratem em um ritmo controlado, reduzindo a chance de formação de cristais de gelo prejudiciais, que podem rasgar ou danificar as membranas celulares.
Essa abordagem medida protege a estrutura das células, aumentando sua sobrevivência e funcionalidade uma vez descongeladas.Seguir protocolos de resfriamento precisos é essencial para garantir o armazenamento e a recuperação bem-sucedidos de linhagens celulares.
