냉동 보존은 생명 세포를 초저온에서 동결 및 저장하여 시간이 지나도 생존 가능성을 유지하는 과정입니다. 이 방법은 재배된 고기 생산에 필수적이며, 일관되고 안정적인 세포주를 보장하고 오염이나 장비 고장으로 인한 손실을 방지합니다. 주요 단계는 다음과 같습니다:
- 준비: 성장 단계에서 세포를 수확하고 생존 가능성을 확인합니다(≥90% 목표), 그리고 DMSO 또는 글리세롤과 같은 냉동 보호제를 포함한 냉동 매체에 준비합니다.
- 동결: 얼음 결정 손상을 방지하기 위해 제어된 냉각 속도(-1°C에서 -3°C 분당)를 사용합니다. 장기 보존을 위해 세포를 액체 질소 증기(-135°C에서 -190°C)에서 저장합니다.
- 해동: 냉동 보호제의 독성을 최소화하기 위해 37°C의 물 목욕에서 세포를 빠르게 해동한 후, 회복을 위해 성장 매체로 옮깁니다.
- 품질 관리: 바이알에 정확하게 라벨을 붙이고, 저장 조건을 모니터링하며, 해동 후 생존 가능성을 테스트하여 성공적인 보존을 보장합니다.
세포주를 위한 완전한 동결 보존 프로토콜: 준비에서 저장까지의 4단계 프로세스
동결 보존을 위한 세포 준비
세포 수확 및 생존 가능성 검사
해동 후 최상의 회복을 보장하기 위해, 세포가 로그(log) 성장 단계에 있을 때 수확합니다. 부착 세포주인 경우, 일반적으로 80–90%의 밀도에 도달했을 때입니다.[2][3][6].
Trypan Blue 배제 방법을 사용하여 세포의 생존 가능성을 확인합니다. 0.4% Trypan Blue와 세포 현탁액을 1:1 비율로 혼합한 후, 혈구계산기를 사용하여 세포를 계산합니다.생존 가능한 세포는 염료를 배제하고 현미경 아래에서 밝게 나타나며, 비생존 세포는 파란색으로 염색됩니다 [4]. 이상적으로는 최상의 회수율을 위해 최소 90%의 생존율을 목표로 하되, 일부 프로토콜에서는 최소 75%를 허용할 수 있습니다 [1][2][3][5].
수확하기 전에 현미경을 사용하여 박테리아 또는 곰팡이 오염 여부를 확인하십시오. 건강한 현탁 세포는 역상 대조 현미경 아래에서 밝고 둥글며 굴절성이 있어야 합니다 [2][3].
세포가 요구되는 생존율 기준을 충족하면, 냉동 전 단계로 진행하십시오.
냉동 전 준비
부착 세포의 경우, 트립신 또는 TrypLE Express와 같은 부드러운 분리 방법을 사용하고, 세포막 손상을 피하기 위해 배양 시간을 제한하십시오 [5]. 세포주는 세포주에 따라 1 × 10⁶에서 1 × 10⁷ 세포/mL의 농도로 준비하십시오 [1][6]. 알리콧을 할 때, 세포 현탁액이 균일하게 분포되도록 자주 혼합하십시오 [5].
냉동 과정이 시작되기 전에 냉동 보호제의 독성을 줄이기 위해 재현탁하는 동안 냉동 매체를 2°C에서 8°C 사이로 유지하십시오 [5]. 세포가 냉동 매체에 현탁되면, 신속하게 냉동 프로토콜로 진행하십시오 [1].세포는 유전적 변이 또는 형태학적 변화의 위험을 줄이기 위해 가능한 낮은 패시지 번호에서 항상 냉동 보존해야 합니다.[5][7].
냉동 보호제 및 냉동 매체 선택
냉동 보호제 옵션 및 그 기능
디메틸 설폭사이드 (DMSO)는 일반적으로 10% 농도로 사용되는 널리 사용되는 냉동 보호제입니다.[2]. DMSO는 세포막을 침투하여 냉동 중 얼음 형성을 줄이는 방식으로 작용합니다. 그러나 DMSO는 실온에서 세포에 독성이 있을 수 있으므로, 노출을 최소화하고 빠르게 희석하기 위해 신속한 해동이 필수적입니다.[1].
글리세롤은 DMSO에 민감한 세포주에 유용한 대안으로 작용하며, 일반적으로 5%에서 15% 농도로 사용됩니다.[8].DMSO가 원치 않는 분화를 유발할 수 있는 세포 유형에 특히 효과적이며, DMSO에 비해 독성이 낮은 경향이 있습니다.[3]
재배육 응용 분야에서 전통적인 냉동 프로토콜은 종종 90% 태아 소 혈청(FBS)과 10% DMSO의 혼합물을 사용합니다 [1]. 그러나 동물 유래 성분에 의존하는 것은 이러한 방법의 확장성과 규제 승인 측면에서 제한을 둡니다 [9]. 이러한 문제를 해결하기 위해 화학적으로 정의된 배지 - Synth-a-Freeze 또는 Recovery Cell Culture Medium과 같은 - 는 동물 성분이 없는 대안을 제공합니다. 이러한 배지는 동물 유래 성분과 관련된 문제를 극복하면서 높은 해동 후 세포 생존율을 유지합니다 [9].
냉동 매체 비교
여기 재배육 생산에 사용되는 다양한 냉동 매체의 장점과 한계에 대한 분석이 있습니다:
| 매체 | 장점 | 단점 | 재배육 적합성 |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO in FBS-DMEM | 확립된 프로토콜 [1] | 동물 유래 성분 포함; 배치 변동성 [9] | 제한된 확장성 |
| Synth-a-Freeze | 화학적으로 정의됨; 일관된 품질; 동물 성분 없음 [9] | 높은 초기 비용 [9] | 예 |
| 회복 세포 배양 매체 | 사용하기 쉽고; 빠른 회복을 위해 설계됨 [9] | 특정 세포주에 대한 최적화가 필요할 수 있음 | 예 |
| FBS에 10% 글리세롤 | DMSO에 민감한 세포를 위한 대안 [1] | 동물 유래 혈청에 의존함 [9] | 제한된 확장성 |
2023년 2월, 도쿄여자医科대학의 연구자들이 타카하시 히로노부의 주도로 올바른 동결 매체 선택의 중요성을 입증했습니다.상업적 옵션인 CELLBANKER 1 및 2를 사용하여, 그들은 1년 동안 –80°C에서 원주율 소 근육 세포를 성공적으로 동결 보존했습니다. 놀랍게도, 이 세포들은 해동 후에도 증식하고 수축성 근육 조직으로 분화할 수 있는 능력을 유지했으며, 사르코메어 구조가 intact했습니다 [10].
재배육 생산을 위해, 화학적으로 정의된 GMP 준수 배지가 점점 더 선호되고 있습니다. STEMCELL Technologies가 강조하듯이:
세포 및 유전자 치료와 같은 고도로 규제된 분야에서는, 제품이 품질 기준에 따라 일관되게 생산되고 관리되도록 보장하기 위해 GMP 제조, 완전히 정의된 동결 보존 배지를 사용하는 것이 권장됩니다 [9].
플랫폼은
냉동 보존 절차 및 냉각 속도
단계별 냉동 프로토콜
성공적인 냉동 보존의 핵심은 -1°C에서 -3°C까지의 일정한 냉각 속도를 유지하는 것입니다[2]. 이 점진적인 과정은 세포에서 물이 천천히 빠져나가도록 하여 세포막을 파열시킬 수 있는 손상된 세포 내 얼음 결정의 형성을 방지합니다[1].
먼저 세포를 150 x g로 5분간 원심분리합니다[3]. 원심분리한 후, 세포 펠렛을 10% DMSO가 포함된 차가운 냉동 매체에 2–4×10⁶ 세포/mL[3]의 농도로 재현탁합니다.DMSO 노출을 줄이기 위해 다음 단계인 동결로 신속하게 이동하십시오.
세포 현탁액을 미리 라벨이 붙은 극저온 바이알에 분배하십시오. 각 바이알에는 세포주 이름, 패시지 번호, 로트 번호, 세포 농도 및 동결 날짜와 같은 필수 세부 정보가 명확하게 표시되어야 합니다.[3]. 바이알이 준비되면 적절한 냉각 장비를 선택하고 활용할 시간입니다.
냉각 장비 및 기술
바이알을 즉시 제어 속도 냉각 장치에 넣으십시오. 이소프로판올을 사용하는 Nalgene "Mr Frosty" 또는 Corning "CoolCell"와 같은 수동 동결 용기는 인기 있는 선택입니다. 이러한 도구는 -80°C 냉동고에 놓았을 때 약 1°C per minute의 냉각 속도를 달성할 수 있습니다.[2]
일관성이 중요한 대규모 작업의 경우, 프로그래머블 속도 제어 냉동고가 최선의 선택입니다. Sigma-Aldrich에 따르면:
ECACC는 정기적으로 프로그래머블 속도 제어 냉동고를 사용합니다. 이는 세포를 동결하는 가장 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법입니다[3].
약 24시간 동안 -80°C에서 보관한 후, 바이알을 액체 질소의 증기 단계로 옮깁니다. 이곳의 온도는 -135°C에서 -190°C 사이로, 장기 보관을 위해 적합합니다[4]. 세포의 생존 가능성을 저해할 수 있으므로 -80°C에서 일주일 이상 보관하는 것은 피해야 합니다. -135°C 이하의 온도는 무기한 보존을 위해 필수적입니다[2]. 액체 단계 대신 증기 단계를 사용하면 충분히 낮은 온도를 유지하면서 교차 오염의 위험을 줄일 수 있습니다.
해동 및 회복 프로토콜
해동 과정
세포를 빠르게 해동하는 것은 독성 냉동 보호제 노출을 제한하고 얼음 결정이 손상을 일으키는 것을 방지하는 데 중요합니다. 안전을 위해 전체 얼굴 보호대와 절연 장갑을 착용해야 합니다. 먼저, 액체 질소에서 크라이오바이알을 제거하고 캡을 약간 느슨하게 하여 쌓인 압력을 방출합니다. 그런 다음, 캡을 다시 조여줍니다.
바이알을 37°C 수조에 넣고 캡이 수면 위에 있도록 합니다. 1-2분 동안 해동하거나 몇 개의 얼음 결정만 남을 때까지 해동합니다. 해동이 완료되면, 바이알의 외부를 70% 알코올로 닦아 무균 상태를 유지합니다.
바이알의 내용을 5-10 mL의 미리 가열된 배양 배지에 있는 튜브로 옮깁니다. 삼투압 충격을 줄이기 위해 배지를 천천히 추가합니다. 현탁 세포주를 다루고 있다면, 세포 현탁액을 즉시 4°C에서 300 × g로 5분간 원심분리합니다.이 단계는 세포를 펠렛화하고 크라이오 보호제를 제거하는 데 도움이 됩니다. 원심분리 후, 세포를 신선한 배지에 재현탁합니다. 부착 세포의 경우, 원심분리는 일반적으로 필요하지 않습니다. 대신, 세포를 적절한 배양 용기에 직접 접종하고 첫 번째 배지 교체 시 잔여 DMSO를 제거합니다. 일반적으로 24시간 후에 진행됩니다.
냉동 해제 후 평가
냉동 해제 직후, 회복이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위해 세포 생존율을 확인합니다. 이 평가를 위해 Trypan Blue 배제 방법을 사용합니다. 이상적으로 세포 생존율은 90%를 초과해야 하지만, 최소 75%는 허용됩니다. 24시간 후, 위상차 현미경으로 세포를 검사하여 부착을 확인하고, 세포 밀도를 평가하며, 오염의 징후가 있는지 확인합니다.
정상적인 증식을 보장하고 세포가 예상되는 특성을 유지하는지 확인하기 위해 1-3 passages 동안 세포를 계속 모니터링합니다.세포주가 더 천천히 회복되는 경우, 초기 태아 송아지 혈청 농도를 약 20% v/v로 증가시켜 생존율을 향상시킬 수 있습니다.
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저장 및 장기 생존성
저장 조건 및 기간
세포주 생존성을 장기적으로 유지하기 위해서는 -135°C 이하의 온도에서 보관하는 것이 필수적입니다.[7][2]. 이는 세포가 무기한 보존될 수 있도록 보장합니다.
재배된 육류 세포주를 저장하는 데 선호되는 방법은 증기상 액체 질소입니다. 이 기술은 -135°C에서 -190°C 사이의 온도를 유지하여 장기 보존에 이상적이며 액체상 저장에 비해 안전성을 높입니다.
세포를 -80°C에서 저장해야 하는 경우, 이를 24시간에서 1주일로 제한하십시오. 이 기간을 초과하면 세포 생존성이 감소할 수 있습니다.이 온도에서 임시 보관을 위해 가능한 한 빨리 세포를 액체 질소 보관으로 옮기십시오.
안전한 보관을 위해 내부 나사산과 O-링이 있는 표준 멸균 극저온 바이알(1–2 mL)을 사용하십시오.[4][5]. 항상 밀봉된 크라이오바이알을 질소의 액체 상태가 아닌 기체 상태에 두어 해동 중 바이알 폭발 위험을 줄이십시오.[5]. 또한, 대량 액체 질소 용기는 안전 버퍼를 유지하기 위해 최소한 절반 이상 채워져 있어야 합니다.
마지막으로, 세포의 장기 생존 가능성을 보장하기 위해 엄격한 품질 관리 조치가 중요합니다.
품질 관리 점검
저장된 세포주 신뢰성을 보장하기 위해 엄격한 품질 관리 프로토콜을 따르십시오. 먼저, 액체 질소에 저항하는 라벨로 각 바이알을 정확하게 라벨링하십시오.세포주 정체성, 로트 번호, 패시지 번호 및 동결 날짜와 같은 필수 세부정보를 포함하십시오. 각 바이알의 정확한 위치를 기록하기 위해 전자 데이터베이스를 유지하여 저장 용기가 열려 있어야 하는 시간을 줄입니다. [7][2].
전체 배치를 장기 저장에 맡기기 전에 단기 가스 상 저장 후 하나의 바이알의 생존 가능성을 테스트하십시오. 이 단계는 동결 과정이 성공적이었음을 확인하고 잠재적인 문제를 식별하는 데 도움이 됩니다. [4][7][2]. 매우 귀중한 세포 주식의 경우, 장비 고장이나 지역 재해에 대비하여 이중 복사본을 보조 위치에 저장하는 것이 현명합니다. [7][2].
모든 저장 용기에 온도 모니터링 시스템과 액체 질소 수준이 낮을 때 감지할 수 있는 경고 장치를 장착하십시오 [7]. 또한, 저장 구역에 산소 경고 장치를 설치하여 18% 산소(v/v)에서 작동하도록 설정하여 액체 질소와 함께 작업하는 인원의 질식 위험을 최소화하십시오 [7][2].
포유류 세포주 냉동 보존 비디오 프로토콜
결론 및 주요 요점
재배육 생산에서 효과적인 냉동 보존을 위한 필수 단계 및 권장 사항을 간략히 정리하겠습니다:
- 세포 수확: 세포가 로그 성장 단계에 있을 때 수확하여 생존율이 90%를 초과하도록 합니다. 10% DMSO를 냉동 보호제로 사용하되, 더 섬세한 세포주에는 글리세롤을 대안으로 사용할 수 있습니다 [11][1].
- 냉각 및 저장: 세포의 무결성을 보호하기 위해 제어된 냉각 속도를 유지하고 바이알을 기체상 액체 질소 저장소로 신속하게 이동시킵니다.[11]
Roka Kakehi 외의 연구는 동결 보존에서 정밀도의 중요성을 강조합니다.[10]:
"동결 보존을 사용하여 신뢰할 수 있고 일관된 세포 공급원을 확보하면, 우리는 배양육 생산을 위한 유망한 세포의 안정적인 공급을 증가시킬 수 있습니다." - Roka Kakehi 외, 도쿄 여성 의과대학
- 해동 과정: 세포를 37°C의 물 목욕에서 약 2분 동안 해동하며, 얼음의 80%가 녹을 때까지 중단합니다. 이는 DMSO 독성을 줄이고 세포 회복을 개선합니다.[1]. 성공을 보장하고 향후 절차를 조정하기 위해 해동 후 생존성 검사를 후속으로 진행합니다.
이 방법들은 엄격한 품질 관리 관행과 함께 작동합니다. 항상 바이알에 정확하게 라벨을 붙이고, 정리된 기록을 유지하며, 장기 저장 전에 철저한 검사를 시행하십시오 [11]. 전문적인 동결 보존 요구를 위해,
자주 묻는 질문들
재배육 생산에서 세포주를 동결 보존하기 위해 화학적으로 정의된 배지를 사용하는 장점은 무엇인가요?
화학적으로 정의된 배지는 재배육 생산을 위한 세포주를 동결 보존할 때 여러 가지 이점을 제공합니다. 동물 유래 혈청과 같은 정의되지 않은 성분을 제거함으로써 일관되고 예측 가능한 결과를 보장합니다 - 이는 세포주의 장기적인 신뢰성을 유지하는 데 중요한 요소입니다.
또 다른 주요 이점은 오염 및 변동성의 위험이 줄어든다는 것입니다. 이는 더 높은 품질 및 안전 기준을 지원할 뿐만 아니라, 배양육 산업에서 규제 요구 사항과 소비자 기대를 충족하는 데 필요한 정밀성과 확장성과 완벽하게 일치합니다.
냉동 및 해동 과정에서 세포 생존에 미치는 냉동 보호제의 선택은 어떤 영향을 미칩니까?
냉동 보호제의 선택은 냉동 및 해동 과정에서 세포 건강을 보존하는 데 중요한 요소입니다. 널리 사용되는 두 가지 옵션은 디메틸 설폭사이드 (DMSO)와 글리세롤로, 각각 고유한 특성을 가지고 있습니다. DMSO는 세포에 빠르게 침투하고 강력한 보호를 제공하는 능력으로 알려져 있습니다. 그러나 고농도 또는 장기간 노출 시 독성이 발생할 수 있어 세포 생존율을 낮출 수 있는 단점이 있습니다.
반면, 글리세롤은 독성이 덜하고 직접 적용할 수 있습니다.그 단점은 세포 침투 속도가 느려서 DMSO에 비해 즉각적인 보호가 덜할 수 있다는 점입니다.
올바른 균형을 이루는 것이 중요합니다. 냉동 보호제의 농도와 노출 시간을 적절히 조정하면 세포를 보호하면서 독성 위험을 최소화할 수 있습니다. 또한, 냉각 속도와 저장 조건에 대한 모범 사례를 준수하는 것이 해동 후 가능한 최고의 회복률을 보장하는 데 필수적입니다.
냉동 보존 중 냉각 속도를 조절하는 것이 왜 중요한가요?
일반적으로 –1°C에서 –3°C per minute 사이의 일정한 냉각 속도를 유지하는 것이 세포의 생존 가능성을 유지하는 데 핵심입니다. 점진적으로 냉각하면 세포가 통제된 속도로 탈수되어 해로운 얼음 결정이 형성될 가능성을 줄여 세포막이 찢어지거나 손상되는 것을 방지할 수 있습니다.
이러한 측정된 접근 방식은 세포의 구조를 보호하여 해동 후 생존율과 기능성을 높입니다.세포주를 성공적으로 장기 보관하고 회수하기 위해서는 정확한 냉각 프로토콜을 따르는 것이 필수적입니다.
