Monitorar células vivas em biorreatores é crucial para a produção de carne cultivada. A escalabilidade requer ferramentas precisas para rastrear a saúde e o crescimento das células em tempo real. Este artigo revisa métodos-chave, incluindo sensores de capacitância, espectroscopia Raman e fluorescência, destacando suas forças e limitações para aplicações industriais.
Principais Insights:
- Sensores de Capacitância: Medem continuamente a densidade de células viáveis. Eficaz para células aderentes, mas sensível a mudanças no tamanho das células.
- Espectroscopia Raman: Rastreia metabólitos como glicose e lactato. Ideal para ambientes aquosos, mas requer calibração complexa.
- Fluorescência: Monitora a atividade metabólica via sinais de NADH/NADPH. Rápido, mas afetado por sinais de fundo do meio.
Desafios:
- Testes tradicionais como o Azul de Tripano são destrutivos e lentos.
- Altas densidades celulares e meios complexos interferem com métodos ópticos.
- O acúmulo de sujeira nos sensores e a necessidade de calibração limitam a eficiência.
A escolha do método certo depende dos requisitos do processo, escala do biorreator e necessidades de esterilidade. Para operações em larga escala, a combinação de várias técnicas geralmente produz os melhores resultados.
Sensores Baseados em Capacitância para Densidade Celular Viável
Como Funciona a Espectroscopia Dielétrica
Sensores de capacitância, também conhecidos como sensores de impedância de radiofrequência, tratam as células vivas como se fossem pequenos capacitores esféricos. Quando um campo elétrico é aplicado a uma suspensão de células, íons no meio de cultura e dentro do citoplasma celular começam a se mover. Eles eventualmente encontram a membrana plasmática não condutora, causando polarização - uma separação de cargas através da membrana [5][6].
Aqui está a chave: apenas células com membranas intactas podem polarizar. Células mortas, que não possuem membranas intactas, não conseguem prender íons e, portanto, não contribuem para o sinal de capacitância [5][7]. John Carvell, Diretor de Vendas e Marketing da Aber Instruments Ltd., explica isso bem:
"A impedância de radiofrequência (RF)... é geralmente considerada o método mais robusto e confiável para monitorar concentrações de células vivas em cultura de células de mamíferos." [5]
A espectroscopia dielétrica se baseia nisso medindo as propriedades dielétricas (ou permissividade) da suspensão celular em várias frequências. Este processo gera uma curva de dispersão β, ilustrando como a capacidade das células de polarizar diminui à medida que a frequência do campo elétrico aumenta [6].Uma leitura de frequência única muitas vezes reflete o biovolume viável - o volume total ocupado por células vivas - em vez de apenas o número de células. Células maiores naturalmente contribuem mais para o sinal do que as menores [5][6].
Esses princípios formam a espinha dorsal da tecnologia de sensores de capacitância, tornando-a uma ferramenta valiosa em sistemas de biorreatores.
Uso de Sensores de Capacitância em Biorreatores de Carne Cultivada
Sensores de capacitância são compatíveis com sistemas de biorreatores de uso único e múltiplo. Para configurações de uso único, discos de sensores descartáveis podem ser soldados em sacos de filme flexível ou inseridos através de portas de tubo pré-instaladas [5][9]. Em sistemas de aço inoxidável, sondas reutilizáveis de 12 mm são conectadas via portas estéreis [9].
Um exemplo prático vem da Universidade de Aachen, onde pesquisadores usaram o sistema BioPAT ViaMass em um biorreator descartável de movimento oscilante de 20 litros para monitorar células CHO DG44. Eles alcançaram uma forte correlação (coeficiente de regressão de 0,95) entre as leituras de capacitância e o volume total de células [5]. Da mesma forma, a Xpand Biotechnology na Holanda empregou sensores de biomassa Aber em seu sistema de expansão celular Scinus para rastrear células-tronco mesenquimais (MSCs) cultivadas em microcarregadores a uma densidade de 60 g/L. Os sensores rastrearam efetivamente os perfis de crescimento em volumes que variam de 150 mL a 1 litro, com resultados alinhados de perto com medições de referência offline [5].
Para a produção de carne cultivada, os sensores de capacitância se destacam ao trabalhar com células aderentes em microcarregadores.Ao contrário dos métodos ópticos, que podem ter dificuldades com transportadores sólidos, os sensores de capacitância podem penetrar nessas estruturas. Essa capacidade os torna particularmente úteis para monitorar células dependentes de ancoragem, uma pedra angular da fabricação de carne cultivada [8].
Forças e Fraquezas dos Sensores de Capacitância
Os sensores de capacitância oferecem dados contínuos e em tempo real sem os riscos de contaminação ou atrasos associados à amostragem manual. Atualmente, eles são as únicas ferramentas online disponíveis comercialmente para avaliar a viabilidade celular em bioprocessos industriais [7]. Enquanto métodos offline tradicionais, como ensaios de azul de tripano, têm um erro relativo de cerca de 10%, a varredura de frequência de capacitância pode reduzir esse erro para entre 5,5% e 11% [6].
Dito isso, esses sensores têm suas limitações.Medições de frequência única não conseguem diferenciar entre um aumento no número de células e um aumento no tamanho das células. Por exemplo, se as células crescerem significativamente em diâmetro durante uma execução - seja devido ao estresse ou à fase de morte - o sinal pode representar erroneamente a contagem real de células, a menos que a varredura de multifrequência seja usada [6]. Além disso, mudanças no meio de suspensão, como adições de alimentação ou diluições, podem causar "quedas" temporárias nos dados que não refletem mudanças reais na biomassa [5]. Em biorreatores de movimento oscilante, o sensor pode momentaneamente encontrar o espaço de cabeça gasoso, exigindo algoritmos de filtro avançados para evitar interferência no sinal [5].
Esses fatores são cruciais ao ajustar o monitoramento de células vivas para a produção de carne cultivada.
Métodos de Espectroscopia para Análise de Células Vivas
Espectroscopia Raman e NIR
A espectroscopia Raman utiliza espalhamento de luz inelástica de um laser de 785 nm para gerar uma impressão digital molecular, permitindo a medição simultânea de metabólitos como glicose, lactato, glutamina e amônio. Por outro lado, a espectroscopia NIR (800–2.500 nm) detecta absorções ópticas de sobretons e bandas de combinação [10][12][13][14]. A sensibilidade mínima do Raman à água o torna ideal para ambientes aquosos como culturas celulares, enquanto a alta sensibilidade à água do NIR - devido ao forte sinal de estiramento O–H - pode obscurecer dados bioquímicos críticos [10][12][14].
Em março de 2017, Lonza Biologics comparou NIR, Raman e fluorescência 2D em biorreatores em miniatura de 15 mL (sistema ambr™). Eles descobriram que Raman era o mais confiável para medir lactato e glicose, enquanto NIR teve melhor desempenho na previsão dos níveis de glutamina e íon amônio [10][11].
Em abril de 2022, pesquisadores da Sartorius Stedim Biotech integraram uma célula de fluxo Raman em linha na corrente de colheita sem células de um processo de perfusão de células CHO. Usando um espectrômetro Raman HyperFluxPRO com um laser de 785 nm, eles conseguiram controle automatizado de feedback de glicose, mantendo concentrações em 4 g/L e 1,5 g/L com uma variabilidade de ±0,4 g/L ao longo de vários dias [13]. J.Lemke da Sartorius Stedim Biotech observou:
"Os resultados demonstram o alto potencial da espectroscopia Raman para monitoramento e controle avançado de processos de um processo de perfusão com um biorreator e método de medição independente de escala." [13]
Em maio de 2011, a Bristol-Myers Squibb usou uma sonda Raman em linha em biorreatores de 500 litros para monitorar múltiplos parâmetros, incluindo glutamina, glutamato, glicose, lactato, amônio, densidade celular viável (VCD) e densidade celular total (TCD). Os espectros foram coletados a cada duas horas com um instrumento RamanRXN3 da Kaiser Optical Systems, demonstrando a capacidade do Raman de rastrear aumentos de nutrientes e diminuições de metabólitos durante adições de alimentação na fabricação em larga escala [14].
Enquanto a espectroscopia Raman e NIR fornecem insights químicos detalhados, os métodos de fluorescência e UV-Vis oferecem perspectivas complementares sobre o metabolismo celular e a biomassa.
Espectroscopia de Fluorescência e UV-Vis
A espectroscopia UV-Vis mede a absorção ou dispersão de luz para estimar a biomassa total [16]. Este método simples e amplamente utilizado, no entanto, tem dificuldade em diferenciar entre células viáveis e mortas e se torna menos preciso em densidades celulares mais altas [16].
A fluorometria, que é mais sensível do que o UV-Vis, foca em marcadores intracelulares específicos como NADH e NADPH, indicadores de atividade metabólica. A fluorometria in situ usa luz ultravioleta de 366 nm para excitar NADH/NADPH, que então fluoresce em torno de 460 nm [16].Veer Pramod Perwez explica:
"A única estratégia de monitoramento contínuo desenvolvida até agora que fornece informações sobre o estado bioquímico ou metabólico da população celular é a fluorometria in situ." [16]
Na produção de carne cultivada, onde dados em tempo real são essenciais, a fluorescência oferece feedback rápido sobre mudanças metabólicas, enquanto o UV-Vis oferece uma maneira econômica de estimar a biomassa. A fluorescência pode rastrear mudanças metabólicas e detectar a depleção de substrato em tempo real, monitorando os níveis de NADH. Por exemplo, em um estudo, a fluorescência 2D mediu concentrações de amônio com um RMSECV de 0,031 g/L, superando tanto o Raman quanto o NIR em configurações de biorreatores em miniatura [11]. Além disso, plataformas microfluídicas automatizadas podem combinar microscopia de campo claro (para medir a concentração total de células) com detecção de fluorescência usando iodeto de propídio, determinando a viabilidade celular em apenas 10.3 minutos [15].
Comparando Diferentes Métodos de Espectroscopia
Ao comparar essas técnicas, cada uma possui pontos fortes distintos para o monitoramento de biorreatores. Raman se destaca por sua capacidade de prever glicose, lactato e títulos de anticorpos, graças à sua impressão digital molecular e baixa interferência da água [10][11]. NIR, apesar de sua sensibilidade à água, é mais eficaz para monitorar glutamina e amônio [10][12]. A fluorescência fornece insights detalhados sobre a atividade metabólica e viabilidade, enquanto o UV-Vis continua sendo uma escolha simples e econômica para estimar a biomassa total [16].
A análise multivariada melhora a interpretação de espectros complexos, permitindo o monitoramento simultâneo de múltiplos analitos [10][13][14]. Para a produção de carne cultivada, a seleção do método de espectroscopia adequado depende dos metabólitos a serem monitorados, da escala do biorreator e se são utilizados sistemas de uso único ou múltiplo. Essas técnicas coletivamente permitem o monitoramento preciso de células, com a compatibilidade do Raman com ambientes aquosos e suas capacidades de multi-analito tornando-o particularmente atraente para operações em larga escala [13][14].
Cultura de Células de Mamíferos - Raman como Meio de Monitoramento &e Controle de Bioprocessos Upstream
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Métodos Avançados para Fisiologia e Viabilidade Celular
Além da espectroscopia, técnicas de ponta oferecem insights mais profundos sobre a fisiologia e viabilidade celular.
FTIR para Monitoramento de Viabilidade Celular e Apoptose
A espectroscopia FTIR utiliza vibrações moleculares em proteínas, lipídios e carboidratos para detectar estresse nutricional e apoptose precoce, ambos marcadores críticos de declínio da saúde celular em biorreatores de carne cultivada.
Uma abordagem, ATR-FTIR (Reflexão Total Atenuada), analisa a variabilidade espectral em regiões de alto número de onda para diferenciar entre células saudáveis e deficientes em nutrientes. Em maio de 2024, pesquisadores da Dxcover Ltd.empregou uma plataforma ATR-FTIR equipada com elementos de reflexão interna descartáveis (IREs) para monitorar a saúde das células CHO. Usando Análise de Componentes Principais (PCA), eles conseguiram distinguir com sucesso células saudáveis de células deficientes em nutrientes no espaço PC. A plataforma alcançou valores R² de múltiplas saídas impressionantes próximos a 0,98 para glicose e ácido lático, oferecendo insights em tempo real sobre a viabilidade celular [17]. Como o acúmulo de ácido lático pode levar à morte celular, esse monitoramento em tempo real permite intervenções oportunas para sustentar a saúde celular.
Sistemas FTIR modernos são projetados com IREs descartáveis ou sondas submersas para integração direta em ambientes de biorreatores. Esta configuração não apenas fornece dados em tempo real, mas também reduz os riscos de contaminação [17].Conforme destacado em Frontiers in Bioengineering and Biotechnology:
"As tecnologias baseadas em espectroscopia são bem adequadas como abordagens PAT, pois são não destrutivas e requerem preparação mínima de amostras." [17]
Expandindo essas capacidades, a varredura de capacitância multifrequencial aborda as limitações dos métodos de frequência única.
Varredura de Capacitância Multifrequencial
Embora os sensores de capacitância de frequência única sejam úteis para medir o volume celular viável (VCV), eles têm dificuldade em distinguir entre mudanças no tamanho e na contagem de células. Essa limitação se torna especialmente problemática durante a apoptose, quando os diâmetros das células frequentemente aumentam [18].O escaneamento de capacitância de multi-frequência resolve este problema medindo a permissividade em uma faixa de 50–20.000 kHz, capturando a curva de dispersão β para avaliar com precisão as concentrações de células viáveis, independentemente das variações de tamanho[18].
Em outubro de 2019, pesquisadores da Sartorius Stedim Biotech utilizaram uma sonda FUTURA pico da Aber Instruments para monitorar células DG44 CHO em biorreatores de 250 mL. Aplicando modelagem de Mínimos Quadrados Parciais Ortogonais (OPLS) a 25 frequências discretas, eles reduziram os erros de previsão de VCC para apenas 5,5% a 11%, uma melhoria significativa em relação às taxas de erro de 16% a 23% observadas com medições de frequência única[18]. O modelo acompanhou efetivamente concentrações de células superiores a 10 milhões de células/mL e identificou rapidamente desvios causados por diluição e mudanças de alimentação, com margens de erro de 6,7% a 13.2% [18].
A frequência característica (fC), que indica o ponto onde a polarização celular está metade completa, muda com base no tamanho e na polarizabilidade da célula. Isso fornece um marcador adicional para mudanças fisiológicas, particularmente durante a fase de morte celular, quando a morfologia passa por transformações notáveis [18]. Como Analytical and Bioanalytical Chemistry explica:
"As influências do VCC e do diâmetro celular no sinal de permissividade não são distinguíveis com uma medição de frequência." [18]
Comparando Métodos Analíticos para Monitoramento de Células Vivas
Comparação de Métodos Analíticos para Monitoramento de Células Vivas em Biorreatores
Esta seção examina mais de perto os principais métodos analíticos usados para monitoramento de células vivas em biorreatores de carne cultivada, com base nas técnicas avançadas discutidas anteriormente.
Selecionar o melhor método envolve equilibrar precisão, velocidade e praticidade. Cada técnica oferece pontos fortes distintos, seja no rastreamento da densidade celular viável, no monitoramento da atividade metabólica ou na manutenção da esterilidade em sistemas de uso único.
Sensores baseados em capacitância são atualmente a única opção disponível comercialmente para monitoramento de viabilidade [7].Esses sensores medem o volume celular viável detectando a polarização de células com membranas intactas em um campo elétrico alternado. Enquanto sistemas de frequência única podem ter dificuldades com precisão quando os tamanhos das células variam, a varredura multifrequencial melhora significativamente a precisão, alcançando margens de erro de 5,5%–11% [18].
Métodos espectroscópicos - como espectroscopia Raman, NIR e de fluorescência - oferecem uma visão mais abrangente da atividade metabólica, rastreando múltiplos parâmetros juntamente com a biomassa. Esses métodos são não invasivos, tornando-os ideais para biorreatores de uso único, onde a esterilidade é crítica. No entanto, eles apresentam desafios: sistemas espectroscópicos requerem extensa calibração com modelos quimiométricos e frequentemente envolvem custos iniciais mais altos em comparação com sondas de capacitância.
Espectroscopia FTIR é particularmente eficaz na detecção de sinais precoces de apoptose e estresse nutricional através da análise de vibração molecular. No entanto, sua forte absorção de água limita sua utilidade para monitoramento contínuo em linha em ambientes aquosos [7]. Em vez disso, FTIR funciona melhor como um método at-line, especialmente quando combinado com análise multivariada para rastreamento em tempo real de metabólitos.
Tabela de Comparação de Métodos Analíticos
| Método | Capacidade em Tempo Real | Compatibilidade com Biorreator | Necessidade de Calibração | Principais Limitações |
|---|---|---|---|---|
| Sensores de Capacitância | Sim (In-line/On-line) | Alta (Agitado, Rocking, SUBs) | Baixa a Moderada | Sensível a bolhas de gás e mudanças no tamanho/morfologia das células |
| Espectroscopia Raman | Sim (In-line) | Moderada (Requer porta de sonda) | Alta (Quimiometria) | Alto custo de equipamento; interpretação de dados complexa |
| Espectroscopia NIR | Sim (In-line/At-line) | Alta | Alta (Multivariada) | Sensibilidade à interferência da água e mudanças de mídia |
| Fluorescência | Sim (Em linha) | Alta | Moderada | Fluorescência de fundo da mídia; fotodegradação |
| FTIR | Sim (Na linha) | Moderada | Alta | Forte absorção de água limita o uso em linha em meios aquosos |
Para a produção de carne cultivada, onde precisão e confiabilidade são inegociáveis, alinhar métodos analíticos aos requisitos específicos do processo é fundamental para alcançar o desempenho ideal do biorreator.Plataformas como
Conclusão e Recomendações
Selecionar o método analítico correto envolve equilibrar os requisitos do processo com fatores como escala, custo e exigências regulatórias. Sua escolha dependerá de considerações-chave, como se suas células são aderentes ou adaptadas à suspensão, com que frequência o monitoramento é necessário e quanta invasividade pode ser tolerada enquanto se garante que a esterilidade permaneça intacta [1]. Com as demandas substanciais de células na produção de carne cultivada [1], a precisão no monitoramento é inegociável.
Fatores Chave para Escolher Métodos Analíticos
O monitoramento em tempo real deve ser uma prioridade máxima.Sistemas online permitem a coleta de dados in situ sem remover amostras, tornando-os mais eficientes e menos propensos a erros em comparação com métodos offline, que são intensivos em mão de obra e apresentam risco de contaminação [3][1]. Para biorreatores de grande escala - até 2.000 litros ou mais - técnicas não invasivas como espectroscopia Raman ou NIR são especialmente úteis. Esses métodos são livres de reagentes e podem rastrear múltiplos parâmetros, como glicose, lactato e aminoácidos, simultaneamente [1][3]. Essa capacidade multivariada não só reduz os custos de monitoramento, mas também mantém o ambiente estéril e de qualidade alimentar necessário para a conformidade regulatória [19].
Sensibilidade e faixa dinâmica são igualmente importantes ao analisar meios biológicos complexos.Ensaios baseados em luminescência geralmente oferecem maior sensibilidade do que métodos de fluorescência ou absorbância [2]. Enquanto isso, técnicas espectroscópicas avançadas geram conjuntos de dados complexos que frequentemente requerem ferramentas de aprendizado de máquina ou quimiometria para análise adequada [3][1]. Para uma solução mais simples, sensores baseados em capacitância são eficazes para monitorar a viabilidade celular.
Escalabilidade e conformidade regulatória são essenciais para a produção comercial. Sensores nesses ambientes devem suportar esterilização em alta temperatura, minimizar a lixiviação e operar por períodos prolongados sem necessidade de recalibração. Sistemas automatizados de rastreamento baseados em imagem também podem fornecer documentação com carimbo de data/hora, pronta para auditoria, o que é crucial para submissões regulatórias a órgãos como o FDA e a EMA [4].Esses requisitos destacam a importância de obter o equipamento certo de fornecedores especializados.
Otimização da Aquisição de Equipamentos com Cellbase
Dadas as complexidades técnicas e regulatórias, encontrar o equipamento analítico certo é fundamental. Plataformas de laboratório gerais muitas vezes carecem da expertise adaptada à indústria de carne cultivada.
Perguntas Frequentes
Quais são os benefícios de usar sensores de capacitância em biorreatores para a produção de carne cultivada?
Sensores de capacitância fornecem uma maneira em tempo real e não intrusiva de medir a biomassa celular viável em biorreatores. Eles entregam dados precisos e confiáveis sem interromper o processo, tornando-os uma e
Esses sensores funcionam perfeitamente em sistemas de todos os tamanhos, desde pequenas configurações até grandes biorreatores industriais de uso único. Essa flexibilidade melhora a gestão de processos, minimiza a dependência de amostragens offline e simplifica os fluxos de trabalho de produção.Ao oferecer insights detalhados sobre a atividade celular, os sensores de capacitância desempenham um papel fundamental no refinamento de bioprocessos, especialmente para a produção de carne cultivada.
Quais são as vantagens da espectroscopia Raman para monitorar metabólitos celulares em biorreatores?
A espectroscopia Raman permite o monitoramento em tempo real e não invasivo de metabólitos celulares cruciais diretamente dentro dos biorreatores. Essa abordagem elimina a necessidade de retirar amostras, reduzindo significativamente o risco de contaminação. Ela pode medir simultaneamente uma variedade de compostos, como glicose, lactato, amônio e títulos de produtos, tornando-se uma ferramenta eficiente para processos prolongados, como corridas de perfusão.
Quando comparada a outros métodos, a espectroscopia Raman frequentemente oferece maior precisão para metabólitos chave como glicose e lactato. Ela pode até superar técnicas como infravermelho próximo (NIR) e fluorescência 2D em certas condições.Ao contrário dos métodos tradicionais off-line, como HPLC ou ensaios colorimétricos, a espectroscopia Raman funciona continuamente, reduzindo o tempo e o uso de recursos enquanto preserva a integridade da cultura celular.
Na produção de carne cultivada, a espectroscopia Raman se destaca devido à sua compatibilidade com biorreatores compactos e sua capacidade de fornecer medições confiáveis, sem necessidade de calibração. Para aqueles que precisam de ferramentas de monitoramento baseadas em Raman,
Quais são os desafios do uso de métodos ópticos em biorreatores com altas densidades celulares?
Em ambientes com alta densidade celular, os métodos ópticos enfrentam desafios como dispersão de luz aumentada e turbidez do meio, que podem distorcer as medições. Adicionando à complexidade, o acúmulo de detritos celulares pode enfraquecer os sinais e causar respostas não lineares, tornando as leituras precisas ainda mais difíceis de alcançar.
Esses problemas são particularmente problemáticos em biorreatores, onde as condições estão constantemente mudando e são intrincadas. Para abordar essas limitações e manter um monitoramento confiável, técnicas analíticas mais sofisticadas podem ser necessárias.
