Overvågning af levende celler i bioreaktorer er afgørende for produktion af dyrket kød. Skalering kræver præcise værktøjer til at spore cellernes sundhed og vækst i realtid. Denne artikel gennemgår nøglemetoder, herunder kapacitanssensorer, Raman-spektroskopi og fluorescens, og fremhæver deres styrker og begrænsninger for industrielle anvendelser.
Vigtige Indsigter:
- Kapacitanssensorer: Måler kontinuerligt levedygtig celletæthed. Effektiv for adherente celler, men følsom over for ændringer i cellestørrelse.
- Raman-spektroskopi: Sporer metabolitter som glukose og laktat. Ideel til vandige miljøer, men kræver kompleks kalibrering.
- Fluorescens: Overvåger metabolisk aktivitet via NADH/NADPH-signaler. Hurtig, men påvirket af mediebaggrundssignaler.
Udfordringer:
- Traditionelle tests som Trypan Blue er destruktive og langsomme.
- Høje celletætheder og komplekse medier forstyrrer optiske metoder.
- Sensorforurening og kalibreringsbehov begrænser effektiviteten.
Valg af den rigtige metode afhænger af proceskrav, bioreaktorskala og sterilitet. For storskala operationer giver kombinationen af flere teknikker ofte de bedste resultater.
Kapacitansbaserede sensorer til levedygtig celletæthed
Hvordan Dielektrisk Spektroskopi Fungerer
Kapacitanssensorer, også kendt som radiofrekvensimpedanssensorer, behandler levende celler, som om de var små sfæriske kondensatorer. Når et elektrisk felt påføres en suspension af celler, begynder ioner i kulturmediet og inden i cellecytoplasmaet at bevæge sig. De støder til sidst på den ikke-ledende plasmamembran, hvilket forårsager polarisering - en adskillelse af ladninger over membranen [5][6].
Her er nøglen: kun celler med intakte membraner kan polarisere. Døde celler, som mangler intakte membraner, kan ikke fange ioner og bidrager derfor ikke til kapacitanssignalet [5][7]. John Carvell, salgs- og marketingdirektør hos Aber Instruments Ltd., forklarer dette godt:
"Radiofrekvens (RF) impedans... betragtes generelt som den mest robuste og pålidelige metode til at overvåge levende cellekoncentrationer i pattedyrscellekultur." [5]
Dielektrisk spektroskopi bygger videre på dette ved at måle de dielektriske egenskaber (eller permittivitet) af cellesuspensionen over forskellige frekvenser. Denne proces genererer en β-dispersionskurve, der illustrerer, hvordan cellernes evne til at polarisere falder, når den elektriske feltfrekvens stiger [6].En enkeltfrekvensaflæsning afspejler ofte levedygtigt biovolumen - det samlede volumen, der er optaget af levende celler - snarere end blot antallet af celler. Større celler bidrager naturligt mere til signalet end mindre [5][6].
Disse principper udgør rygraden i kapacitanssensor-teknologi, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj i bioreaktorsystemer.
Brug af kapacitanssensorer i dyrkede kød bioreaktorer
Kapacitanssensorer er kompatible med både engangs- og flerbrugssystemer. For engangsopsætninger kan engangssensordiske svejses ind i fleksible filmbags eller indsættes gennem forudmonterede rørporte [5][9]. I rustfrit stål systemer er genanvendelige 12-mm prober forbundet via sterile porte [9].
Et praktisk eksempel kommer fra Aachen Universitet, hvor forskere brugte BioPAT ViaMass systemet i en 20-liters enkeltbrugs bioreaktor med vuggende bevægelse til at overvåge CHO DG44 celler. De opnåede en stærk korrelation (regressionskoefficient på 0,95) mellem kapacitansmålinger og det totale cellevolumen [5]. Tilsvarende anvendte Xpand Biotechnology i Holland Aber biomassesensorer i deres Scinus celleudvidelsessystem til at spore mesenkymale stamceller (MSCs), der blev dyrket på mikrobærere ved en tæthed på 60 g/L. Sensorerne sporede effektivt vækstprofiler på tværs af volumener fra 150 mL til 1 liter, med resultater der stemte tæt overens med offline referencemålinger [5].
Til produktion af dyrket kød er kapacitanssensorer fremragende, når de arbejder med adhærente celler på mikrobærere.I modsætning til optiske metoder, som kan have problemer med faste bærere, kan kapacitanssensorer trænge ind i disse strukturer. Denne evne gør dem særligt nyttige til overvågning af forankringsafhængige celler, en hjørnesten i produktionen af dyrket kød [8].
Styrker og Svagheder ved Kapacitanssensorer
Kapacitanssensorer tilbyder kontinuerlige, realtidsdata uden de kontamineringsrisici eller forsinkelser, der er forbundet med manuel prøvetagning. De er i øjeblikket de eneste kommercielt tilgængelige online værktøjer til vurdering af cellelevedygtighed i industrielle bioprocesser [7]. Mens traditionelle offline metoder som trypanblå assays har en relativ fejl på omkring 10%, kan kapacitansfrekvensscanning reducere denne fejl til mellem 5,5% og 11% [6].
Det skal dog siges, at disse sensorer har deres begrænsninger.Enkeltfrekvensmålinger kan ikke skelne mellem en stigning i celleantal og en stigning i cellestørrelse. For eksempel, hvis celler vokser betydeligt i diameter under en kørsel - hvad enten det skyldes stress eller dødsfasen - kan signalet fejlagtigt repræsentere det faktiske celleantal, medmindre multifrekvensscanning anvendes [6]. Derudover kan ændringer i suspensionsmediet, såsom tilsætning af næring eller fortyndinger, forårsage midlertidige "dyk" i dataene, der ikke afspejler reelle ændringer i biomassen [5]. I bioreaktorer med vuggende bevægelse kan sensoren midlertidigt støde på gasfasen, hvilket kræver avancerede filteralgoritmer for at undgå signalforstyrrelser [5].
Disse faktorer er afgørende, når der finjusteres overvågning af levende celler til produktion af dyrket kød.
Spektroskopimetoder til analyse af levende celler
Raman- og NIR-spektroskopi
Raman-spektroskopi bruger uelastisk lysspredning fra en 785 nm laser til at generere et molekylært fingeraftryk, hvilket muliggør samtidig måling af metabolitter som glukose, laktat, glutamin og ammonium. På den anden side detekterer NIR-spektroskopi (800–2.500 nm) optiske absorptioner fra overtoner og kombinationsbånd [10][12][13][14]. Ramans minimale følsomhed over for vand gør det ideelt til vandige miljøer som cellekulturer, mens NIR's høje vandfølsomhed - på grund af den stærke O–H stræksignal - kan skjule kritiske biokemiske data [10][12][14].
I marts 2017 Lonza Biologics sammenlignede NIR, Raman og 2D-fluorescens i 15 mL miniature bioreaktorer (ambr™ system). De fandt, at Raman var den mest pålidelige til måling af laktat og glukose, mens NIR fungerede bedre til at forudsige glutamin- og ammoniumionniveauer [10][11].
I april 2022 integrerede forskere hos Sartorius Stedim Biotech en in-line Raman flowcelle i den cellefrie høststrøm af en CHO-celle perfusionsproces. Ved hjælp af en HyperFluxPRO Raman spektrometer med en 785 nm laser opnåede de automatiseret glukose feedback kontrol, og opretholdt koncentrationer på 4 g/L og 1,5 g/L med en variation på ±0,4 g/L over flere dage [13]. J.Lemke fra Sartorius Stedim Biotech bemærkede:
"Resultaterne demonstrerer det høje potentiale af Raman-spektroskopi til avanceret procesovervågning og kontrol af en perfusionsproces med en bioreaktor og skaluafhængig målemetode." [13]
I maj 2011 brugte Bristol-Myers Squibb en in-line Raman-sonde i 500-liters bioreaktorer til at overvåge flere parametre, herunder glutamin, glutamat, glukose, laktat, ammonium, levedygtig celletæthed (VCD) og total celletæthed (TCD). Spektre blev indsamlet hver anden time med et Kaiser Optical Systems RamanRXN3-instrument, hvilket viser Ramans evne til at spore næringsstofstigninger og metabolitfald under tilsætning af foder i storskala produktion [14].
Mens Raman- og NIR-spektroskopi leverer detaljerede kemiske indsigter, tilbyder fluorescens- og UV-Vis-metoder komplementære perspektiver på cellulær metabolisme og biomasse.
Fluorescens- og UV-Vis-spektroskopi
UV-Vis-spektroskopi måler lysabsorption eller spredning for at estimere den totale biomasse [16]. Denne enkle og udbredte metode har dog svært ved at skelne mellem levedygtige og døde celler og bliver mindre præcis ved højere celletætheder [16].
Fluorometri, som er mere følsom end UV-Vis, fokuserer på specifikke intracellulære markører som NADH og NADPH, indikatorer for metabolisk aktivitet. In situ fluorometri bruger 366 nm ultraviolet lys til at excitere NADH/NADPH, som derefter fluorescerer ved omkring 460 nm [16].Veer Pramod Perwez forklarer:
"Den eneste kontinuerlige overvågningsstrategi, der hidtil er udviklet, som giver information om cellernes biokemiske eller metaboliske tilstand, er in situ fluorometri." [16]
Inden for produktion af dyrket kød, hvor realtidsdata er afgørende, leverer fluorescens hurtig feedback på metaboliske ændringer, mens UV-Vis tilbyder en økonomisk måde at estimere biomasse på. Fluorescens kan spore metaboliske skift og opdage substratudtømning i realtid ved at overvåge NADH-niveauer. For eksempel målte 2D-fluorescens i en undersøgelse ammoniumkoncentrationer med en RMSECV på 0,031 g/L, hvilket overgik både Raman og NIR i miniature bioreaktoropsætninger [11]. Derudover kan automatiserede mikrofluidiske platforme kombinere lysfeltmikroskopi (til at måle den totale cellekoncentration) med fluorescensdetektion ved hjælp af propidiumiodid, hvilket bestemmer celleviabilitet på bare 10.3 minutter [15].
Sammenligning af forskellige spektroskopimetoder
Ved sammenligning af disse teknikker har hver deres unikke styrker til overvågning af bioreaktorer. Raman skiller sig ud for sin evne til at forudsige glukose, laktat og antistofkoncentrationer, takket være dens molekylære fingeraftryk og lave interferens fra vand [10][11]. NIR, på trods af sin følsomhed over for vand, er mere effektiv til overvågning af glutamin og ammonium [10][12]. Fluorescens giver detaljeret indsigt i metabolisk aktivitet og levedygtighed, mens UV-Vis forbliver et enkelt og omkostningseffektivt valg til estimering af total biomasse [16].
Multivariat analyse forbedrer fortolkningen af komplekse spektre, hvilket muliggør samtidig overvågning af flere analytter [10][13][14]. For produktion af dyrket kød afhænger valget af den rigtige spektroskopimetode af de metabolitter, der skal overvåges, bioreaktorens skala og om der anvendes engangs- eller flerbrugssystemer. Disse teknikker muliggør samlet præcis celleovervågning, hvor Ramans kompatibilitet med vandige miljøer og dens multi-analyt kapaciteter gør den særligt attraktiv for storskaladrift [13][14].
Mammalian Cell Culture - Raman som et middel til overvågning &og kontrol af upstream bioprocesser
sbb-itb-ffee270
Avancerede metoder til cellefysiologi og levedygtighed
Ud over spektroskopi tilbyder banebrydende teknikker dybere indsigt i cellefysiologi og levedygtighed.
FTIR til overvågning af cellelevedygtighed og apoptose
FTIR-spektroskopi bruger molekylære vibrationer i proteiner, lipider og kulhydrater til at detektere næringsstress og tidlig apoptose, begge kritiske markører for faldende cellehelbred i dyrkede kød-bioreaktorer.
En tilgang, ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection), analyserer spektral variabilitet i højfrekvensområder for at skelne mellem sunde og næringsmangelfulde celler. I maj 2024, forskere ved Dxcover Ltd.ansatte en ATR-FTIR-platform udstyret med engangs-intern refleksionselementer (IRE'er) til at overvåge CHO-cellers sundhed. Ved hjælp af Principal Component Analysis (PCA) adskilte de med succes sunde celler fra næringsstofmangelfulde i PC-rummet. Platformen opnåede imponerende multi-output R²-værdier tæt på 0,98 for glukose og mælkesyre, hvilket tilbyder realtidsindsigt i cellelevedygtighed [17]. Da ophobning af mælkesyre kan føre til celledød, tillader denne realtidsmonitorering rettidige indgreb for at opretholde cellesundhed.
Moderne FTIR-systemer er designet med engangs-IRE'er eller nedsænkede prober til direkte integration i bioreaktormiljøer. Denne opsætning giver ikke kun realtidsdata, men reducerer også risikoen for kontaminering [17].Som fremhævet i Frontiers in Bioengineering and Biotechnology:
"Spektroskopibaserede teknologier er velegnede som PAT-tilgange, da de er ikke-destruktive og kræver minimal prøveforberedelse." [17]
Ved at udvide disse kapaciteter adresserer multifrekvens kapacitansscanning begrænsningerne ved enkeltfrekvensmetoder.
Multifrekvens kapacitansscanning
Mens enkeltfrekvens kapacitanssensorer er nyttige til at måle levedygtigt cellevolumen (VCV), har de svært ved at skelne mellem ændringer i cellestørrelse og celleantal. Denne begrænsning bliver særligt problematisk under apoptose, når cellediametre ofte øges [18].Multi-frekvens kapacitansscanning løser dette problem ved at måle permittivitet over et område fra 50–20.000 kHz, hvilket fanger β-dispersionskurven for nøjagtigt at vurdere levedygtige cellekoncentrationer uanset størrelsesvariationer [18].
I oktober 2019 anvendte forskere hos Sartorius Stedim Biotech en Aber Instruments FUTURA pico probe til at overvåge DG44 CHO-celler i 250 mL bioreaktorer. Ved at anvende Orthogonal Partial Least Squares (OPLS) modellering på 25 diskrete frekvenser reducerede de VCC forudsigelsesfejl til blot 5,5% til 11%, en betydelig forbedring i forhold til 16% til 23% fejlraterne set ved enkeltfrekvensmålinger [18]. Modellen sporede effektivt cellekoncentrationer, der oversteg 10 millioner celler/mL, og identificerede hurtigt afvigelser forårsaget af fortynding og fodringsændringer, med fejlmargener på 6,7% til 13.2% [18].
Den karakteristiske frekvens (fC), som angiver det punkt, hvor cellulær polarisering er halvt fuldført, skifter baseret på celle størrelse og polariserbarhed. Dette giver en yderligere markør for fysiologiske ændringer, især under celledødsfasen, når morfologien gennemgår bemærkelsesværdige transformationer [18]. Som Analytical and Bioanalytical Chemistry forklarer:
"Virkningerne af VCC og cellediameter på permittivitetssignalet er ikke adskillelige med en enkelt frekvensmåling." [18]
Sammenligning af analytiske metoder til overvågning af levende celler
Sammenligning af analytiske metoder til overvågning af levende celler i bioreaktorer
Dette afsnit ser nærmere på nøglemetoder til overvågning af levende celler i dyrkede kød bioreaktorer, baseret på de avancerede teknikker, der tidligere er diskuteret.
Valg af den bedste metode indebærer en balance mellem nøjagtighed, hastighed og praktisk anvendelighed. Hver teknik tilbyder unikke styrker, hvad enten det er sporing af levedygtig celletæthed, overvågning af metabolisk aktivitet eller opretholdelse af sterilitet i engangssystemer.
Kapacitansbaserede sensorer er i øjeblikket den eneste kommercielt tilgængelige online mulighed skræddersyet til levedygtighedsovervågning [7].Disse sensorer måler levedygtigt cellevolumen ved at detektere polariseringen af celler med intakte membraner i et vekslende elektrisk felt. Mens enkeltfrekvenssystemer kan have problemer med nøjagtigheden, når celle størrelser varierer, forbedrer multifrekvensscanning præcisionen betydeligt og opnår fejlmarginer på 5,5%–11% [18].
Spektroskopiske metoder - såsom Raman, NIR og fluorescensspektroskopi - tilbyder et mere omfattende billede af metabolisk aktivitet ved at spore flere parametre sammen med biomasse. Disse metoder er ikke-invasive, hvilket gør dem ideelle til engangsbioreaktorer, hvor sterilitet er kritisk. Dog kommer de med udfordringer: spektroskopiske systemer kræver omfattende kalibrering med kemometriske modeller og indebærer ofte højere startomkostninger sammenlignet med kapacitansprober.
FTIR-spektroskopi er særligt effektiv til at opdage tidlige tegn på apoptose og næringsstress gennem molekylær vibrationsanalyse. Dog begrænser dens stærke vandabsorption dens anvendelighed til kontinuerlig in-line overvågning i vandige miljøer [7]. I stedet fungerer FTIR bedst som en at-line metode, især når den kombineres med multivariat analyse til realtidsmetabolitsporing.
Analytiske Metoder Sammenligningstabel
| Metode | Realtidskapacitet | Bioreaktor Kompatibilitet | Kalibreringsbehov | Væsentlige Begrænsninger |
|---|---|---|---|---|
| Kapacitanssensorer | Ja (In-line/On-line) | Høj (Omrørt, Vuggende, SUBs) | Lav til Moderat | Følsom over for gasbobler og ændringer i celle størrelse/morfologi |
| Raman-spektroskopi | Ja (In-line) | Moderat (Kræver probeport) | Høj (Kemometri) | Høje udstyrsomkostninger; kompleks datafortolkning |
| NIR-spektroskopi | Ja (In-line/At-line) | Høj | Høj (Multivariat) | Følsomhed over for vandinterferens og medieændringer |
| Fluorescens | Ja (In-line) | Høj | Moderat | Baggrundsfluorescens fra medier; fotoblegning |
| FTIR | Ja (At-line) | Moderat | Høj | Stærk vandabsorption begrænser in-line brug i vandige medier |
Til produktion af dyrket kød, hvor præcision og pålidelighed er ufravigelige, er det afgørende at matche analytiske metoder til specifikke proceskrav for at opnå optimal bioreaktorpræstation.Platforme som
Konklusion og Anbefalinger
Valg af den rette analytiske metode indebærer en balance mellem proceskrav og faktorer som skala, omkostninger og regulatoriske krav. Dit valg vil afhænge af nøgleovervejelser som om dine celler er adherente eller suspensionstilpassede, hvor ofte overvågning er nødvendig, og hvor meget invasivitet der kan tolereres, mens steriliteten forbliver intakt [1]. Med de betydelige celledemands i produktionen af dyrket kød [1], er præcision i overvågning ufravigelig.
Nøglefaktorer for Valg af Analytiske Metoder
Realtidsovervågning bør være en topprioritet.Online-systemer muliggør in situ dataindsamling uden at fjerne prøver, hvilket gør dem mere effektive og mindre tilbøjelige til fejl sammenlignet med offline-metoder, som er arbejdskrævende og risikerer kontaminering [3][1]. For storskala bioreaktorer - op til 2.000 liter eller mere - er ikke-invasive teknikker som Raman eller NIR-spektroskopi særligt nyttige. Disse metoder er reagensfrie og kan spore flere parametre, såsom glukose, laktat og aminosyrer, samtidig [1][3]. Denne multivariate kapabilitet reducerer ikke kun overvågningsomkostningerne, men opretholder også det sterile, fødevaregodkendte miljø, der er nødvendigt for overholdelse af lovgivningen [19].
Følsomhed og dynamisk rækkevidde er lige så vigtige, når man analyserer komplekse biologiske medier.Luminescensbaserede assays tilbyder generelt højere følsomhed end fluorescens- eller absorptionsmetoder [2]. I mellemtiden genererer avancerede spektroskopiske teknikker komplekse datasæt, der ofte kræver maskinlæring eller kemometriske værktøjer til korrekt analyse [3][1]. For en enklere løsning er kapacitansbaserede sensorer effektive til at overvåge cellelevedygtighed.
Skalerbarhed og overholdelse af lovgivning er essentielle for kommerciel produktion. Sensorer i disse miljøer skal kunne modstå højtemperatursterilisering, minimere udvaskning og fungere i længere perioder uden behov for rekvalibrering. Automatiserede, billedbaserede sporingssystemer kan også give tidsstemplet, revisionsklar dokumentation, hvilket er afgørende for lovgivningsmæssige indsendelser til organer som FDA og EMA [4].Disse krav fremhæver vigtigheden af at skaffe det rigtige udstyr fra specialiserede leverandører.
Effektivisering af udstyrskøb med Cellbase
I betragtning af de tekniske og lovgivningsmæssige kompleksiteter er det afgørende at finde det rigtige analytiske udstyr. Generelle laboratorieplatforme mangler ofte den ekspertise, der er skræddersyet til den dyrkede kødindustri.
Ofte stillede spørgsmål
Hvad er fordelene ved at bruge kapacitanssensorer i bioreaktorer til produktion af dyrket kød?
Kapacitanssensorer giver en real-time, ikke-intrusiv måde at måle levedygtig cellebiomasse i bioreaktorer. De leverer præcise og pålidelige data uden at afbryde processen, hvilket gør dem til et e
Disse sensorer fungerer problemfrit på tværs af systemer i alle størrelser, fra små opsætninger til store engangsindustrielle bioreaktorer. Denne fleksibilitet forbedrer processtyring, minimerer afhængigheden af offline prøvetagning og strømliner produktionsarbejdsgange.Ved at tilbyde detaljerede indsigter i celleaktivitet spiller kapacitanssensorer en nøglerolle i at forfine bioprocesser, især for produktion af dyrket kød.
Hvad er fordelene ved Raman-spektroskopi til overvågning af cellemetabolitter i bioreaktorer?
Raman-spektroskopi muliggør realtids, ikke-invasiv sporing af vigtige cellemetabolitter direkte inden i bioreaktorer. Denne tilgang eliminerer behovet for at udtage prøver, hvilket reducerer risikoen for kontaminering betydeligt. Det kan samtidig måle en række forbindelser, såsom glukose, laktat, ammonium og produkttitre, hvilket gør det til et effektivt værktøj til udvidede processer som perfusionskørsler.
Sammenlignet med andre metoder leverer Raman-spektroskopi ofte højere præcision for nøglemetabolitter som glukose og laktat. Det kan endda overgå teknikker som nær-infrarød (NIR) og 2D-fluorescens under visse betingelser.I modsætning til traditionelle offline-metoder, såsom HPLC eller kolorimetriske assays, arbejder Raman-spektroskopi kontinuerligt, hvilket reducerer tids- og ressourceforbrug, samtidig med at cellekulturens integritet bevares.
Inden for produktion af dyrket kød skiller Raman-spektroskopi sig ud på grund af dens kompatibilitet med kompakte bioreaktorer og dens evne til at levere pålidelige, kalibreringsfri målinger. For dem, der har brug for Raman-baserede overvågningsværktøjer,
Hvad er udfordringerne ved at bruge optiske metoder i bioreaktorer med høj celletæthed?
I miljøer med høj celletæthed står optiske metoder over for udfordringer som øget lysspredning og medieturbiditet, som kan forvride målingerne.Tilføjelse til kompleksiteten, opbygningen af celleaffald kan svække signaler og forårsage ikke-lineære reaktioner, hvilket gør nøjagtige aflæsninger endnu sværere at opnå.
Disse problemer er særligt problematiske i bioreaktorer, hvor forholdene konstant ændrer sig og er indviklede. For at imødegå disse begrænsninger og opretholde pålidelig overvågning kan mere sofistikerede analytiske teknikker være nødvendige.
