pH-tasojen tarkka ylläpito on kriittistä viljellyn lihan tuotannossa. Nisäkässolut menestyvät kapealla pH-alueella (7,1–7,4), mutta aineenvaihdunnan aiheuttama happamoituminen, CO₂:n kertyminen ja sekoitushaasteet tekevät pH:n hallinnasta monimutkaista, erityisesti suurissa bioreaktoreissa. Tehokkaita strategioita ovat:
- Kaasuvirtaus: Poistaa ylimääräisen CO₂:n nostamatta osmolaliteettia tai aiheuttamatta paikallisia pH-piikkejä.
- Kehittyneet sensorit: Potentiometriset sensorit tarjoavat korkean tarkkuuden ruostumattomasta teräksestä valmistetuille järjestelmille, kun taas optiset sensorit toimivat hyvin kertakäyttöisissä bioreaktoreissa.
- Puskurin optimointi: Puskureiden, kuten HEPES, lisääminen parantaa vakautta, mutta vaatii huolellista tasapainoa ylimääräisen laktaatin tuotannon välttämiseksi.
- Automaattiset järjestelmät: Reaaliaikaiset säädöt palautesilmukoiden avulla varmistavat johdonmukaiset pH-tasot.
Nämä lähestymistavat auttavat voittamaan haasteita, kuten maitohapon kertymistä ja leikkausjännitystä, parantaen solujen terveyttä ja tuotteen saantoa.
pH-mittausten ymmärtäminen bioprosessissa
Keskeiset haasteet pH-hallinnassa
Tässä osiossa syvennytään tärkeimpiin tekijöihin, jotka vaikuttavat pH:n epävakauteen, perustuen aiemmin käsiteltyihin haasteisiin.
Metabolinen happamoituminen ja maitohapon kertyminen
Maitohappo on merkittävä este viljellyn lihan bioprosessoinnissa. Kun solut metaboloivat glukoosia glykolyysin kautta, ne tuottavat laktaattia ja vetyioneja suhteessa 1:1. Tämä prosessi luo merkittävän happokuorman, mikä tekee laktaatista väliaineen happamoitumisen ensisijaisen aiheuttajan [1].
Standardin viljelyalustan puskurointikyky - tyypillisesti välillä 1,1 ja 1,6 mM per pH-yksikkö [1] - on usein riittämätön nopean solukasvun aikana.Kun solut lisääntyvät, niiden aineenvaihduntajätteen tuotanto kasvaa, mikä ylittää väliaineen kyvyn ylläpitää vakaata pH-arvoa. pH:n jyrkkä lasku tässä vaiheessa voidaan suoraan liittää glykolyyttiseen maitohappotuotantoon [1], mikä korostaa laktaatin keskeistä roolia väliaineen pH:n epävakauttamisessa.
Komplikaatiot eivät lopu tähän. CO2:n kertyminen lisää monimutkaisuutta.
CO2:n kertyminen ja pH:n ajautuminen
Soluhengitys tuo CO2:ta väliaineeseen, jossa se liukenee muodostaen hiilihappoa. Keskeinen ongelma on liuenneen CO2:n osapaine (pCO2), joka vaikuttaa siihen, voiko CO2 paeta soluista. Kun pCO2-tasot väliaineessa nousevat liian korkeiksi, CO2 jää loukkuun solujen sisälle, aiheuttaen vaarallisen laskun solunsisäisessä pH:ssa ja lopulta johtaa solukuolemaan [2].
"Jos pCO2 on liian korkea, CO2 ei voi poistua soluista, joten solunsisäinen pH laskee ja solut kuolevat." - Alicat Scientific [2]
Tämä ongelma korostuu suurissa bioreaktoreissa. Näillä järjestelmillä on pienempi pinta-ala-tilavuus-suhde, mikä vähentää CO2:n poistotehokkuutta verrattuna pienempiin astioihin [3]. Jopa rutiinitoiminnot, kuten kasvatusalustan siirtäminen CO2-hautomoon, voivat aiheuttaa pH-vaihteluita. Esimerkiksi pienet kasvatusalustamäärät alkavat emäksistyä lähes välittömästi, aikavakiolla 2–3 tuntia [1].
Kemiallisten haasteiden ohella myös fysikaaliset prosessit vaikuttavat merkittävästi pH:n epävakauteen.
Sekoittamisen ja leikkausjännityksen vaikutukset pH:n vakauteen
pH:n säätäminen emästä lisäämällä tuo mukanaan omat riskinsä.Kun natriumbikarbonaattia tai vastaavia emäksiä pumpataan bioreaktoreihin, huono sekoitus voi luoda paikallisia korkean pH:n alueita, jotka vahingoittavat lähellä olevia soluja [2] [3]. Toisaalta, voimakas sekoitus, joka on tarpeen emäksen tasaiselle jakautumiselle, voi johtaa leikkausjännitykseen ja vaahdon muodostumiseen, jotka molemmat ovat haitallisia herkille nisäkässoluille [2] [3].
Kontrolloiduissa kokeissa pH:n vakauttamiseksi lisätty emäs vähensi usein solujen elinkykyä lisääntyneen osmolaliteetin vuoksi [3]. Tämä luo vaikean tasapainottelun: riittämätön sekoitus johtaa pH-hotspotteihin, kun taas liiallinen sekoitus estää hotspotit mutta lisää mekaanista rasitusta. Ongelma muuttuu vielä haastavammaksi mittakaavan suurentamisen aikana, jolloin pidemmät sekoitusajat vaikeuttavat tehokkaan pH:n hallinnan ylläpitämistä ilman, että solujen terveys vaarantuu.
Teknologiat pH-seurantaan ja -hallintaan
pH:n pitäminen kapealla alueella 7,1–7,4 on kriittistä nisäkässoluviljelmille, mikä vaatii tarkkoja ja luotettavia seurantatyökaluja [2]. Potentiometriset anturit, jotka toimivat elektrodeina mitaten vapaita vetyioneja, ovat kultastandardi jatkuvalle pH-seurannalle bioreaktoreissa [1]. Nämä anturit tarjoavat reaaliaikaista dataa, mahdollistaen automaattisten järjestelmien tehdä välittömiä säätöjä vaadittujen pH-tasojen ylläpitämiseksi. Niiden korkea tarkkuus tekee niistä välttämättömiä laajamittaisissa operaatioissa. Näiden rinnalla optiset indikaattorit tarjoavat toisen tehokkaan tavan mitata pH:ta.
Optiset indikaattorit perustuvat spektroskooppiseen analyysiin tarjoten kvantitatiivisia pH-mittauksia.Vaikka fenolipuna on usein käytetty visuaalinen indikaattori, tarkemmat lukemat saadaan absorptanssin ratiometrisellä analyysillä kahdella tietyllä aallonpituudella - 560 nm ja 430 nm [1] . Tämä menetelmä kompensoi tekijöitä, kuten väliaineen tilavuus tai väriaineen pitoisuus, varmistaen johdonmukaiset ja tarkat tulokset.
"Vapaiden H+ ionien pitoisuutta ei ole intuitiivista ennustaa, mutta onneksi se on yksinkertaista mitata (e.g. elektrodeilla tai indikaattoriväreillä)." - Johanna Michl et al., University of Oxford [1]
Nykyaikaiset pH-säätöjärjestelmät menevät seurantaa pidemmälle integroimalla nämä mittaukset automatisoituihin palautesilmukoihin, jotka säätelevät pH-tasoja dynaamisesti.
Automaattiset palautesysteemit hyödyntävät anturidataa tehdäkseen reaaliaikaisia säätöjä, poistaen manuaalisen puuttumisen tarpeen. Nämä järjestelmät voivat säätää pH:ta lisäämällä emästä tai käyttämällä kaasusparraustekniikoita [2].Suurikokoisissa bioreaktoreissa kaasun syöttö on erityisen tehokasta. Massavirtausohjaimien avulla CO2-tasoja voidaan säätää nopeasti ja tasaisesti, mikä varmistaa yhtenäisen pH-säädön [2]. Sen sijaan emäksen pumppaus, vaikka se onkin tehokasta pienemmissä järjestelmissä, voi aiheuttaa paikallisia pH-epätasapainoja ja lisätä osmolaliteettia, mikä tekee siitä vähemmän käytännöllisen suuremmissa astioissa [2]. Kuitenkin kaasun syöttö vaatii huolellista huomiota syöttölaitteiden suunnitteluun, jotta vältetään leikkausjännitys, joka voisi vahingoittaa soluja [2]. Viljellyn lihan tuotannossa investointi kehittyneisiin kaasunhallintajärjestelmiin voi johtaa parempaan solujen terveyteen ja korkeampiin tuottoihin, mikä tekee siitä kannattavan kulun.
sbb-itb-ffee270
pH-hallinnan strategiat suuressa mittakaavassa
Potentiometriset vs optiset pH-anturit viljellyn lihan bioreaktoreille
Potentiometriset vs optiset anturit: Vertailu
Oikean anturiteknologian valinta tulee yhä tärkeämmäksi, kun viljellyn lihan tuotanto laajenee. Potentiometriset anturit ovat ensisijainen valinta ruostumattomasta teräksestä valmistetuille bioreaktoreille niiden tarkkuuden ja nopean vasteen vuoksi. Niillä on kuitenkin haasteita, kuten säännöllisen kalibroinnin tarve ja herkkyys ajautumiselle pitkien prosessien aikana. Jacob Crowe, sovellusten & teknisen tuen johtaja
"Ajan myötä pH-mittaukset voivat ajautua, mikä vaikuttaa prosessin vakauteen ja suorituskykyyn.On tärkeää seurata ja lieventää pH:n muutoksia estääkseen haitalliset vaikutukset sekä aineenvaihduntaan että koko prosessiin" [8].
Toisaalta optiset sensorit ovat käytännöllinen vaihtoehto, erityisesti kertakäyttöisille bioreaktorijärjestelmille. Nämä sensorit voidaan asentaa etukäteen kertakäyttöisiin pusseihin, mikä vähentää kontaminaatioriskejä ja poistaa steriloinnin tarpeen syklien välillä [7]. Mikrofluidijärjestelmissä optiset sensorit ovat osoittaneet e
| Ominaisuus | Potentiometriset anturit | Optiset anturit |
|---|---|---|
| Tarkkuus | Korkea, mutta altis ajautumiselle | Korkea; ihanteellinen reaaliaikaiseen seurantaan |
| Huolto | Vaatii usein kalibrointia | Vähäinen; usein kertakäyttöinen |
| Skaalautuvuus | Vakiintunut ruostumattoman teräksen kokoonpanoihin | Erinomainen kertakäyttöisiin ja mikrofluidiikkaan |
| Vasteaika | Nopea, rajoittuu elektrodin vakauteen | Välitön reaaliaikainen palaute |
| Kustannusvaikutukset | Korkeammat työvoima- ja huoltokustannukset | Alhaisempi työvoima; integroitu kertakäyttöisiin |
Anturin valinta riippuu suurelta osin reaktorityypistä.Ruostumattomasta teräksestä valmistetut bioreaktorit voivat hyötyä potentiometrisista antureista, joilla on toimenpiteitä ajautuman hallitsemiseksi, kun taas kertakäyttöiset alustat voivat hyödyntää integroitujen optisten antureiden helppoutta &[7] [8]. Nämä päätökset vaikuttavat suoraan siihen, miten pH:n vakaus säilytetään väliaineen optimoinnin aikana.
Väliaineen optimointi ja puskurin parannukset
Kun sopivat anturit ovat paikoillaan, viljelyväliaineen puskurointijärjestelmän vakauttaminen on olennaista pH:n hallinnan ylläpitämiseksi skaalausvaiheessa. Nisäkässolut ovat riippuvaisia CO₂/HCO₃⁻-puskurointijärjestelmästä (pKa 6,15 37°C:ssa), mutta sen puskurointikyky on usein riittämätön. Esimerkiksi standardi DMEM FBS:n kanssa tarjoaa tyypillisesti vain 1,1–1,6 mM puskurointia [1].
Tämän ratkaisemiseksi lisätään haihtumattomia puskuriaineita (NVB), kuten HEPES (pKa 7.3 at 37°C) voi merkittävästi vahvistaa puskurointia aiheuttamatta ongelmallisia osmolaliteettimuutoksia [1]. Suositeltu menetelmä sisältää väliaineen titraamisen kohde-pH:hon ensin, sitten NaHCO₃:n lisäämisen pitoisuudella, joka on linjassa inkubaattorin pCO₂:n kanssa. Tämä lähestymistapa vähentää alkuperäistä pH:n muutosta, kun tuore väliaine altistuu CO₂:lle, prosessi, joka voi kestää jopa kaksi tuntia NVB:iden kanssa [1].
Kuitenkin, vahvemmat puskurointijärjestelmät voivat laukaista lisääntynyttä glykolyysiä, mikä johtaa korkeampaan laktaatin tuotantoon. Joissakin solulinjoissa jopa 90% glukoosista muuttuu suoraan laktaatiksi [1], ja parannettu puskurointi voi joskus voimistaa tätä vaikutusta, mikä johtaa suurempaan maitohapon kertymiseen [10].
Ilmastus- ja Sekoittamistekniikat
Kaasu-ilmastus tarjoaa käytännöllisen tavan hallita pH:ta suurimittaisessa viljellyn lihan tuotannossa.Alicat Scientific huomauttaa:
"Kaasukuplat spargereista voidaan sekoittaa ja jakaa tasaisemmin kuin emäs, ja paljon vähemmällä sekoituksella" [2].
Jakamalla kaasukuplat tasaisesti, spargaus tarjoaa johdonmukaisemman lähestymistavan kuin kemialliset emäslisäykset. Esimerkiksi vuoden 2018 tutkimus osoitti, että pitämällä spargausnopeudet vakiona samalla kun lisättiin päätilan ilmastusta, titrit pysyivät vakaina skaalattaessa 30 litrasta 250 litraan [2].
Makrospargerit, jotka tuottavat kuplia, joiden halkaisija on 1–4 mm, ovat erityisen tehokkaita poistamaan ylimääräistä CO₂:ta viljelmästä. Tämä nostaa pH:ta luonnollisesti, välttäen kemiallisten emästen tarpeen, jotka voisivat nostaa osmolaliteettia [2] [5]. Uudempi "vain-kaasu" pH:n hallintastrategia käyttää automatisoituja ilman spargauspalautesilmukoita.Kun pH laskee, ilmavirtaus kasvaa poistaakseen enemmän CO₂:ta. Tätä menetelmää on onnistuneesti skaalattu ambr®250-bioreaktoreista 200 litran astioihin, säilyttäen tarkat pH-tasot koko syöttöeräkulttuurien ajan [6].
Tehokkaan kaasunsiirron tasapainottaminen minimaalisen leikkausjännityksen kanssa on edelleen kriittinen haaste skaalausprosessin aikana. Ilmanvaihtobioreaktorit, jotka käyttävät kaasukäyttöistä kiertoa, tarjoavat hellävaraisemman sekoitusvaihtoehdon vähentyneellä leikkausjännityksellä. Laskennalliset virtausdynamiikan (CFD) simulaatiot voivat myös auttaa tunnistamaan korkean leikkausjännityksen alueet lähellä juoksupyörän lapoja, mikä mahdollistaa bioreaktorien suunnittelun optimoinnin ennen skaalausta [4]. Näiden lähestymistapojen yhdistäminen
pH-säätölaitteiden hankinta Cellbase kautta
Miksi valita Cellbase hankintaan?
Tarkka pH-säätö on olennaista viljellyn lihan bioprosessoinnissa, joten oikeiden laitteiden hankinta on ratkaisevan tärkeää. Yleiset laboratoriotarvikkeiden toimitusalustat eivät usein omaa tarvittavaa erikoisosaamista tämän alan tiukkoihin pH-alueisiin.
Käyttämällä
Löydä pH:n hallintateknologioita Cellbase
Skaalauksen osalta alusta tarjoaa pääsyn massavirran säätimiin ja erikoistuneisiin spargereihin, jotka ovat kriittisiä tehokkaassa kaasupohjaisessa pH:n hallinnassa. Kuten Alicat Scientific korostaa:
"pH:n pitäminen terveellisillä biologisilla tasoilla on mahdollisesti voimakkain työkalu ylävirran bioprosessoinnissa tuotetitterien lisäämiseksi" [2].
Lisäksi
Hankinta-asiantuntijat voivat myös hankkia laitteita CO₂:n poistoon, mukaan lukien autoklavoitavat CO₂-anturit ja kertakäyttöiset pH-anturit. Nämä työkalut tukevat skaalautuvia strategioita tarkan pH-säätelyn ylläpitämiseksi, mikä helpottaa kehittyneen pH-hallinnan integroimista laajamittaiseen tuotantoon [11]. Tarjoamalla kohdennettuja ratkaisuja,
Päätelmä: Parhaat käytännöt pH-säätelyyn viljellyn lihan bioprosessoinnissa
pH-alueen 7,1–7,4 ylläpitäminen on kriittistä nisäkässolujen selviytymiselle viljellyn lihan tuotannossa [2]. pH:n pitäminen tässä vaihteluvälissä on keskeisessä roolissa tuoteyieldien parantamisessa ylävirran bioprosessoinnin aikana.
pH:n hallinnan haasteisiin on kehitetty useita tehokkaita käytäntöjä. Yksi merkittävä menetelmä on kaasun sparrauksen käyttö emäksen lisäämisen sijaan skaalausvaiheessa. Kaasun sparraus poistaa tehokkaasti ylimääräisen CO₂:n jakamalla sen tasaisesti vähäisellä sekoituksella, mikä auttaa välttämään ongelmia, kuten pH:n epäjohdonmukaisuuksia ja osmolaliteetin vaihteluita [2]. Vuoden 2021 tutkimus, jonka teki Aryogen Pharmed, osoitti tämän menetelmän menestyksen 250 litran mittakaavassa, saavuttaen 51% lopputuotteen saannon kasvun [3].
Toinen tärkeä käytäntö on suora pH-seuranta, joka tarjoaa kattavamman käsityksen viljelmän terveydestä verrattuna pelkästään pCO₂-mittauksiin luottamiseen.Tämä on erityisen tärkeää, koska liuenneen CO₂:n tasot eivät ota huomioon maitohapon kertymistä, joka voi muodostaa jopa 90% glukoosimetabolian tietyissä solulinjoissa [1]. pH:n suora seuranta tulee entistä tärkeämmäksi eksponentiaalisen kasvuvaiheen aikana, jolloin aineenvaihdunta on huipussaan.
Ei-haihtuvien puskurien, kuten HEPES, kohdalla on tärkeää ottaa huomioon puskurin tasapaino. HEPES-puskurit voivat vakiintua jopa kahdessa tunnissa ja ne on titrattava huolellisesti bikarbonaatin ja CO₂:n kanssa [1]. Puskurikapasiteetin lisääminen voi kuitenkin tahattomasti lisätä laktaatin tuotantoa, mikä voi kumota aiotun vakauttavan vaikutuksen [1]. Kun nämä puskurinäkökohdat yhdistetään anturipohjaiseen seurantaan ja kaasun sparraustekniikoihin, ne auttavat ylläpitämään vakaita ja optimaalisia prosessiolosuhteita.
Usein kysytyt kysymykset
Miten kaasuspargaus tukee pH:n hallintaa viljellyn lihan tuotannossa?
Kaasuspargaus on tärkeässä roolissa pH-tasojen tasapainottamisessa viljellyn lihan tuotannon aikana. Solujen kasvaessa ne vapauttavat hiilidioksidia (CO₂) hengityksen sivutuotteena. Tämä CO₂ voi laskea viljelyalustan pH:ta, mikä voi vahingoittaa solujen terveyttä. Tuomalla bioreaktoriin kaasuja, kuten ilmaa, happea tai inerttejä kaasuja, spargaus auttaa poistamaan ylimääräistä CO₂:ta. Tämä estää alustan liiallisen happamoitumisen ja pitää pH:n vakaana.
Viljelyalustan pitäminen ihanteellisella pH-alueella, noin 7,1–7,4, on ratkaisevan tärkeää solujen terveelle kasvulle ja tuottavuudelle. Kun se yhdistetään puskurointijärjestelmiin ja reaaliaikaiseen seurantaan pH-antureilla, kaasuspargaus ei ainoastaan paranna prosessin tehokkuutta, vaan myös lisää solujen elinkelpoisuutta. Se on kriittinen osa viljellyn lihan bioprosessoinnin onnistumisen varmistamisessa.
Mikä tekee potentiometrisistä antureista paremman valinnan kuin optisista antureista pH-seurantaan viljellyn lihan tuotannossa?
Potentiometriset anturit ovat tärkeässä roolissa viljellyn lihan tuotannossa niiden kyvyn ansiosta tarjota reaaliaikaisia pH-mittauksia korkealla tarkkuudella. Oikeiden pH-tasojen ylläpitäminen on olennaista solujen kasvulle sopivan ympäristön luomiseksi, ja nämä anturit ovat erinomaisia tarjoamaan tarvittavat tiedot tämän saavuttamiseksi. Lisäksi ne ovat suhteellisen edullisia ja integroituvat saumattomasti suurikokoisiin bioreaktoreihin, mikä tekee niistä ihanteellisia jatkuvaan seurantaan teollisissa ympäristöissä.
Lisäksi nämä anturit on suunniteltu kestämään monimutkaisten viljelyalustojen haasteet, tarjoten luotettavaa suorituskykyä jopa vaativissa olosuhteissa. Kuitenkin ne vaativat säännöllistä kalibrointia tarkkuuden ylläpitämiseksi.Potentiometriset anturit ovat tulleet suosituksi valinnaksi tehokkaaseen pH-säätöön viljellyn lihan bioprosessoinnissa niiden tarkkuuden, luotettavuuden ja kustannustehokkuuden ansiosta.
Miksi maitohapon kertyminen vaikeuttaa vakaan pH-tason ylläpitämistä?
Maitohapon kertyminen vaikeuttaa pH-säätöä lisäämällä viljely-ympäristön happamuutta, mikä aiheuttaa pH:n laskun. Tämä voi vahingoittaa solujen elinkelpoisuutta ja tuottavuutta, sillä useimmat solut tarvitsevat tarkasti hallitun pH-alueen kasvaakseen ja toimiakseen oikein.
Maitohappotasojen hallinta on ratkaisevan tärkeää viljellyn lihan bioprosessoinnissa tukemaan terveellistä solukasvua ja ylläpitämään tuotteen laatua. Lähestymistavat, kuten reaaliaikainen pH-seuranta, pH-puskureiden käyttö tai syöttöprotokollien säätäminen, voivat auttaa vakauttamaan ympäristöä ja välttämään haitallisia pH-vaihteluita.
