קריופיזור הוא תהליך הקפאת תאים חיים ואחסונם בטמפרטורות נמוכות במיוחד כדי לשמור על חיותם לאורך זמן. שיטה זו היא קריטית לייצור בשר מגודלו, ומבטיחה קווי תאים עקביים ויציבים ומגנה מפני אובדן כתוצאה מזיהום או כשל בציוד. צעדים מרכזיים כוללים:
- הכנה: קצור תאים במהלך שלב הגדילה שלהם, בדוק חיות (שאף ל-≥90%), והכן אותם במדיה הקפאה עם מגן קריופיזור כמו DMSO או גליצרול.
- הקפאה: השתמש בקצב קירור מבוקר (-1°C עד -3°C לדקה) כדי למנוע נזק מגרגרי קרח. אחסן תאים באדי חנקן נוזלי (-135°C עד -190°C) לשימור ארוך טווח.
- הפשרה: הפשר במהירות תאים באמבט מים בטמפרטורה של 37°C כדי למזער את רעילות המגן הקריופיזור, ולאחר מכן העבר אותם למדיה לגדילה לשיקום.
- בקרת איכות: תייגו את הבקבוקים במדויק, פקחו על תנאי האחסון ובדקו את הכשירות לאחר ההפשרה כדי להבטיח שימור מוצלח.
פרוטוקול קריופיזורציה מלא עבור קווי תאים: תהליך של 4 שלבים מהכנה ועד אחסון
הכנת תאים לקריופיזורציה
קטיף תאים ובדיקות כשירות
כדי להבטיח את ההתאוששות הטובה ביותר לאחר ההפשרה, קטפו תאים במהלך שלב הגדילה הלוגריתמית (לוג). עבור קווי תאים מדביקים, זה בדרך כלל כאשר הם מגיעים ל-80–90% קונפלואנטיות [2][3][6].
בדקו את הכשירות של התאים באמצעות שיטת ההחרגה של טריפן בלו. ערבבו חלקים שווים (1:1) של 0.4% טריפן בלו עם התלכיד התאי, ואז ספרו את התאים באמצעות המיקרומטר.תאים חיים לא יספגו את הצבע ויופיעו בהירים תחת המיקרוסקופ, בעוד שתאים לא חיים יכתמו בכחול [4]. אידיאלי, שאפו ל-90% לפחות של חיוניות עבור שיעורי התאוששות הטובים ביותר, אם כי כמה פרוטוקולים עשויים לקבל מינימום של 75% [1][2][3][5].
לפני הקטיף, השתמשו במיקרוסקופ כדי לבדוק זיהום חיידקי או פטרייתי. תאי סספנציה בריאים צריכים להיראות בהירים, עגולים ומפזרים אור תחת מיקרוסקופ הפאזות ההפוך [2][3].
ברגע שהתאים עומדים בסטנדרטים הנדרשים של חיוניות, המשיכו לשלבים שלפני הקפאה.
הכנות לפני הקפאה
עבור תאים דביקים, השתמש בשיטות דיסוציאציה עדינות, כגון טריפסין או TrypLE Express, והגבל את זמן האינקובציה כדי למנוע נזק לממברנות התאים [5]. הכין את התאים בריכוז של 1 × 10⁶ עד 1 × 10⁷ תאים/mL, בהתאם לקו התאים [1][6]. במהלך חלוקה, ודא שהסuspension של התאים מעורבבת לעיתים קרובות כדי לשמור על פיזור אחיד בין הקפואים [5].
שמור את המדיה להקפאה מקוררת בין 2°C ל-8°C במהלך ההסרה מחדש כדי להפחית את רעילות החומר המגן לפני שההליך ההקפאה מתחיל [5]. לאחר שהתאים הוסרו מחדש במדיה להקפאה, המשך במהירות לפרוטוקול ההקפאה [1].תמיד יש לשמור תאים בהקפאה במעבר הנמוך ביותר האפשרי כדי להפחית את הסיכון לדריפט גנטי או שינויים מורפולוגיים [5][7].
בחירת מגן הקפאה וחומרי הקפאה
אפשרויות מגן הקפאה ותפקידיהם
דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בשימוש נרחב כמגן הקפאה, בדרך כלל בריכוז של 10% [2]. הוא פועל על ידי חדירה לממברנות התאים והפחתת היווצרות קרח במהלך ההקפאה. עם זאת, DMSO יכול להיות רעיל לתאים בטמפרטורת החדר, ולכן הפשרה מהירה היא חיונית כדי למזער את החשיפה ולדלל אותו במהירות [1].
גליצרול משמש כחלופה שימושית לקווי תאים רגישים ל-DMSO, בדרך כלל בשימוש בריכוזים הנעים בין 5% ל-15% [8].זה במיוחד יעיל עבור סוגי תאים שבהם DMSO עשוי לגרום להבדלים לא רצויים [3], והוא נוטה להיות פחות רעיל בהשוואה ל-DMSO.
ביישומים של בשר מגודלו, פרוטוקולי הקפאה מסורתיים משתמשים לעיתים קרובות בתערובת של 90% סרום עוברי פרה (FBS) ו-10% DMSO [1]. עם זאת, התלות ברכיבים שמקורם בבעלי חיים מגבילה את השיטות הללו מבחינת יכולת ההרחבה ואישור רגולטורי [9]. כדי להתמודד עם בעיות אלו, מדיה מוגדרת כימית - כמו Synth-a-Freeze או Recovery Cell Culture Medium - מספקת חלופה ללא רכיבי בעלי חיים. מדיה אלו שומרות על חיוניות תאים גבוהה לאחר ההפשרה תוך התמודדות עם האתגרים הקשורים לרכיבים שמקורם בבעלי חיים [9].
השוואת מדיות הקפאה
הנה פירוט של היתרונות והמגבלות של מדיות הקפאה שונות המשמשות בייצור בשר מגודלו:
| מדיה | יתרונות | חסרונות | התאמה לבשר מגודל |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO ב-FBS-DMEM | פרוטוקולים שהוקמו [1] | מכיל רכיבים שמקורם בבעלי חיים; שונות בין קבוצות [9] | יכולת סקלביליות מוגבלת |
| Synth-a-Freeze | מוגדר כימית; איכות עקבית; חופשי מרכיבי בעלי חיים [9] | עלות ראשונית גבוהה יותר [9] | כן |
| מדיית תרבות תאים לשיקום | קל לשימוש; מיועד להתאוששות מהירה [9] | עשוי להזדקק לאופטימיזציה עבור קווי תאים ספציפיים | כן |
| 10% גליצרול ב-FBS | חלופה לתאים רגישים ל-DMSO [1] | מתבסס על סרום ממקור חייתי [9] | יכולת סקלביליות מוגבלת |
בפברואר 2023, חוקרים ב-אוניברסיטת טוקיו לרפואה נשים, בראשות הירונובו טקהאשי, הראו את החשיבות של בחירת מדיית הקפאה הנכונה.באמצעות אפשרויות מסחריות כמו CELLBANKER 1 ו-2, הם הצליחו לשמר בהקפאה תאי שריר פרימריים מבקר בטמפרטורה של –80°C למשך עד שנה. באופן מרשים, תאים אלה שמרו על יכולתם להתרבות ולהתמיין לרקמת שריר מתכווצת עם מבני סרקומר שלמים לאחר ההפשרה [10].
לייצור בשר מגודלו, מדיות מוגדרות כימית ועומדות בדרישות GMP זוכות להעדפה גוברת. כפי שSTEMCELL Technologies מדגישה:
בתחומים המפוקחים מאוד כמו טיפול בתאים וגנים, מומלץ להשתמש במדיית הקפאה המיוצרת ב-GMP, המוגדרת לחלוטין, כדי להבטיח שהמוצרים מיוצרים ומפוקחים באופן עקבי בהתאם לסטנדרטים של איכות [9].
פלטפורמות כמו
הליך קירור ושיעורי קירור
פרוטוקול קפיאה שלב אחר שלב
המפתח להקפאה מוצלחת טמון בשמירה על שיעור קירור קבוע של -1°C עד -3°C לדקה[2]. תהליך הדרגתי זה מאפשר למים לצאת מהתאים לאט, מונע את היווצרותם של גבישי קרח תוך-תאיים מזיקים שעשויים לקרוע את ממברנות התאים[1].
התחל על ידי צנטריפוגה של התאים ב150 x g במשך 5 דקות[3]. לאחר הצנטריפוגה, השהה מחדש את פלטת התאים במדיה קפיאה קרה המכילה 10% DMSO בריכוז של 2–4×10⁶ תאים/mL[3].כדי להפחית את החשיפה ל-DMSO, יש לעבור במהירות לשלב הבא - הקפאה.
חלקו את תסניף התאים לבקבוקונים קריוגניים עם תוויות מוכנות מראש. כל בקבוקון צריך לציין בבירור פרטים חיוניים כמו שם קו התאים, מספר המעבר, מספר הקבוצה, ריכוז התאים, ותאריך ההקפאה[3]. עם הבקבוקונים המוכנים, הגיע הזמן לבחור ולהשתמש בציוד הקירור המתאים.
ציוד וטכניקות קירור
הניחו את הבקבוקונים מיד במכשיר קירור בקצב מבוקר. מיכלי הקפאה פסיביים, כמו ה-Nalgene "Mr Frosty" (שמשתמש באיזופרופנול) או ה-Corning "CoolCell", הם בחירות פופולריות. כלים אלה יכולים להשיג קצב קירור של כ-1°C לדקה כאשר הם ממוקמים במקפיא בטמפרטורה של -80°C[2].
עבור פעולות בקנה מידה גדול שבהן עקביות היא קריטית, מקפיא עם שליטה על קצב התכנות הוא האפשרות הטובה ביותר. כפי שנאמר על ידי Sigma-Aldrich:
ECACC משתמשים באופן שגרתי במקפיא עם שליטה על קצב התכנות. זו הדרך המהימנה והחוזרת ביותר להקפיא תאים[3].
לאחר כ-24 שעות ב-80- מעלות צלזיוס, העבירו את הבקבוקים לשלב האדים של חנקן נוזלי, שבו הטמפרטורות נעות בין -135 מעלות צלזיוס ל-190- מעלות צלזיוס, לאחסון לטווח ארוך[4]. הימנעו מאחסון תאים ב-80- מעלות צלזיוס יותר משבוע, מכיוון שזה עלול לפגוע בחיותם. טמפרטורות מתחת ל-135- מעלות צלזיוס חיוניות לשימור בלתי מוגבל[2]. השימוש בשלב האדים במקום בשלב הנוזל מפחית את הסיכון לזיהום צולב תוך שמירה על טמפרטורות נמוכות מספיק.
פרוטוקולי הפשרה ושיקום
תהליך הפשרה
הפשרת תאים במהירות היא קריטית כדי להגביל את החשיפה לחומרים מגן קפואים רעילים ולמנוע נזק שנגרם על ידי גבישי קרח. ודא שאתה לובש מסכת פנים מלאה וכפפות מבודדות לבטיחות. התחל בהסרת הצינור הקפוא מחנקן נוזלי והרפיית המכסה מעט כדי לשחרר כל לחץ שנצבר. לאחר מכן, הדק שוב את המכסה.
מניחים את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37°C, ודואגים שהמכסה יישאר מעל קו המים. תן לו להפשיר במשך 1–2 דקות, או עד שנשארים רק כמה גבישי קרח. לאחר ההפשרה, נגב את החלק החיצוני של הצינור עם אלכוהול 70% כדי לשמור על סטריליות.
העבר את תוכן הצינור לתוך צינור המכיל 5–10 מ"ל של מדיום גידול מחומם מראש. הוסף את המדיום לאט כדי לעזור להפחית את הלם האוסמוטי. אם אתה עובד עם קווי תאים בהשעיה, סנטריפוג את השעיית התאים מיד ב-300 × g במשך 5 דקות ב-4°C.שלב זה מסייע לדחוס את התאים ומסיר את חומר ההגנה הקפוא. לאחר צנטריפוגה, יש להחזיר את התאים בתמיסה חדשה. עבור תאים דביקים, צנטריפוגה בדרך כלל אינה נחוצה. במקום זאת, יש לזרוע את התאים ישירות בכלי תרבות מתאים ולהסיר כל שאריות DMSO במהלך החלפת המדיה הראשונה, בדרך כלל לאחר 24 שעות.
הערכות לאחר ההפשרה
מיד לאחר ההפשרה, יש לבדוק את חיות התאים כדי להבטיח שהשיקום היה מוצלח. השתמש בשיטת ההחרגה של טריפן בלו להערכה זו. באופן אידיאלי, חיות התאים צריכה לעלות על 90% [11], אך מינימום של 75% מתקבל. לאחר 24 שעות, יש לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ קונטרסט שלב כדי לאשר דבקות, להעריך את צפיפות התאים, ולבדוק אם יש סימנים לזיהום.
המשך לנטר את התאים דרך מעברים 1–3 כדי להבטיח פרוליפרציה נורמלית שהם שומרים על התכונות הצפויות שלהם. עבור קווי תאים שמתאוששים לאט יותר, ניתן לשפר את ההישרדות על ידי הגדלת ריכוז הסרום העוברי הבקרי הראשוני לכ-20% v/v.
sbb-itb-ffee270
אחסון וחיים ארוכים
תנאי אחסון ומשך
כדי לשמור על חיות קווי התאים לאורך זמן, חיוני לאחסן אותם בטמפרטורות מתחת ל-135- מעלות צלזיוס [7][2]. זה מבטיח שהם יישמרו לנצח.
השיטה המועדפת לאחסון קווי תאים של בשר מגודלים היא חנקן נוזלי בשלב אדים. טכניקה זו שומרת על טמפרטורות בין 135- ל-190-, מה שהופך אותה לאידיאלית לשימור ארוך טווח תוך הצעת בטיחות משופרת בהשוואה לאחסון בשלב נוזלי.
אם אתה צריך לאחסן תאים ב-80- מעלות צלזיוס, הגבל זאת לתקופה של 24 שעות עד שבוע. מעבר לכך, חיות התאים עשויה לרדת.לשימור זמני בטמפרטורה זו, העבר את התאים לאחסון בחנקן נוזלי בהקדם האפשרי.
השתמש בבקבוקונים קריוגניים סטריליים סטנדרטיים (1–2 מ"ל) עם חוט פנימי ואטם O לאחסון בטוח [4][5]. תמיד הנח בקבוקוני קריוגן סגורים בשלב הגז ולא בשלב הנוזל של החנקן כדי להפחית את הסיכון לפיצוץ הבקבוקונים במהלך ההפשרה [5]. בנוסף, ודא שמיכלי חנקן נוזלי בכמות גדולה נשמרים לפחות חצי מלאים כדי לשמור על רצועת בטיחות.
לבסוף, אמצעי בקרת איכות קפדניים הם קריטיים כדי להבטיח את יכולת הקיום לטווח ארוך של התאים.
בדיקות בקרת איכות
כדי להבטיח את האמינות של קווי התאים המאוחסנים, יש לעקוב אחר פרוטוקולים קפדניים לבקרת איכות. התחל בלתייג במדויק כל בקבוקון עם תוויות עמידות לחנקן נוזלי.כלול פרטים חיוניים כגון זהות קו התאים, מספר אצווה, מספר מעבר ותאריך הקפאה. שמור על מסד נתונים אלקטרוני כדי לרשום את המיקום המדויק של כל בקבוקון, מה שמפחית את הזמן שבו כלי האחסון צריכים להישאר פתוחים [7][2].
לפני שמתחייבים לאחסון ארוך טווח של אצוות שלמות, בדוק את חיותו של בקבוקון אחד לאחר אחסון קצר טווח בשלב גז. שלב זה מסייע לאשר שההליך ההקפאה היה מוצלח ומזהה בעיות פוטנציאליות [4][7][2]. עבור מניות תאים בעלות ערך גבוה, זה חכם לאחסן עותקים במיקום משני כדי להגן מפני תקלות בציוד או אסונות מקומיים [7][2].
ציידו את כל כלי האחסון במערכות ניטור טמפרטורה ואזעקות כדי לזהות רמות נמוכות של חנקן נוזלי [7]. בנוסף, התקינו אזעקות חמצן באזורי האחסון, המוגדרות לפעול ב-18% חמצן (v/v), כדי למזער את הסיכונים לחנק עבור העובדים עם חנקן נוזלי [7][2].
פרוטוקול וידאו להקפאת תאי יונקים
סיכום ומסקנות עיקריות
הנה סיכום מהיר של הצעדים וההמלצות החשובות להקפאה יעילה בייצור בשר מגודלו:
- איסוף תאים: אספו תאים במהלך שלב הגדילה הלוגריתמית שלהם, ודאו שהחיים עולים על 90%. השתמשו ב-10% DMSO כחומר מגן להקפאה, אם כי גליצרול יכול להיות חלופה עבור קווי תאים עדינים יותר [11][1].
- קירור ואחסון: שמירה על קצב קירור מבוקר והעברת בקבוקונים במהירות לאחסון בחנקן נוזלי בשלב האדים כדי להגן על שלמות התאים [11]
מחקר של רוקה קקהי ואחרים מדגיש את החשיבות של דיוק בהקפאת תאים [10]:
"הבטחת מקור אמין ועקבי של תאים באמצעות הקפאה תאפשר לנו להגדיל את האספקה היציבה של תאים מבטיחים לייצור בשר מגודלו." - רוקה קקהי ואחרים, אוניברסיטת טוקיו לרפואה נשים
- תהליך ההפשרה: הפשר תאים באמבט מים בטמפרטורה של 37°C במשך כעשר דקות, עצור כאשר 80% מהקרח נמס. זה מפחית את רעילות ה-DMSO ומשפר את התאוששות התאים [1]. המשך עם בדיקות חיוניות לאחר ההפשרה כדי להבטיח הצלחה ולדייק את ההליכים העתידיים.
שיטות אלו פועלות בשיתוף פעולה עם פרקטיקות קפדניות של בקרת איכות. תמיד תסמנו את הבקבוקים בצורה מדויקת, שמרו על רשומות מאורגנות, ויישמו בדיקות מעמיקות לפני אחסון לטווח ארוך [11]. עבור צרכים מיוחדים של קריופיזור, פלטפורמות כמו
שאלות נפוצות
מה היתרונות של שימוש במדיה כימית מוגדרת עבור קריופיזור של קווי תאים בייצור בשר מגודלו?
מדיה כימית מוגדרת מביאה יתרונות רבים כאשר מדובר בקריופיזור של קווי תאים עבור ייצור בשר מגודלו. על ידי הסרת רכיבים לא מוגדרים, כמו סרום שמקורו בבעלי חיים, הם מבטיחים תוצאות עקביות וצפויות - גורם קרדינלי לשמירה על האמינות לטווח הארוך של קווי התאים.
יתרון נוסף הוא הסיכון המופחת לזיהום ולשונות. זה לא רק תומך בסטנדרטים גבוהים יותר של איכות ובטיחות אלא גם מתיישב בצורה מושלמת עם הדיוק והיכולת להתרחב הנדרשים כדי לעמוד בדרישות הרגולטוריות ובציפיות הצרכנים בתעשיית הבשר המגודלת.
איך הבחירה בחומר מגן לקירור משפיעה על הישרדות התאים במהלך הקפאה והפשרה?
הבחירה בחומר מגן לקירור היא גורם מפתח בשמירה על בריאות התאים במהלך הקפאה והפשרה. שתי אפשרויות בשימוש נרחב הן דימתיל סולפוקסיד (DMSO) וגליצרול, כל אחת עם תכונות ייחודיות. DMSO ידוע ביכולתו לחדור לתאים במהירות ולספק הגנה חזקה. עם זאת, יש לו אזהרה: בריכוזים גבוהים או עם חשיפה ממושכת, הוא עלול להפוך לרעיל, מה שעשוי להפחית את יכולת ההישרדות של התאים.
גליצרול, לעומת זאת, פחות רעיל וניתן ליישום ישיר.החיסרון שלו טמון בקצב החדירה האיטי יותר של התאים, מה שעשוי להוביל להגנה פחות מיידית בהשוואה ל-DMSO.
השגת האיזון הנכון היא קריטית. התאמת הריכוז וזמן החשיפה של המגן הקפוא בצורה נכונה מסייעת להגן על התאים תוך צמצום הסיכון לרעילות. בנוסף, הקפדה על שיטות עבודה מומלצות לקצב הקירור ותנאי האחסון היא חיונית כדי להבטיח את שיעורי ההחלמה הגבוהים ביותר לאחר ההפשרה.
מדוע חשוב לשלוט בקצב הקירור במהלך הקפאת תאים?
שמירה על קצב קירור יציב, בדרך כלל בין –1°C ל–3°C לדקה, היא המפתח לשמירה על חיות התאים. קירור בהדרגה מאפשר לתאים להתייבש בקצב מבוקר, מה שמפחית את הסיכון להיווצרות גבישי קרח מזיקים, שעלולים לקרוע או להזיק לממברנות התאים.
גישה מדודה זו מגנה על מבנה התאים, ומגבירה את סיכויי ההישרדות והפונקציונליות שלהם לאחר ההפשרה.שמירה על פרוטוקולי קירור מדויקים היא חיונית כדי להבטיח אחסון ושחזור מוצלחים של קווי תאים.
