バイオリアクター内の生細胞のモニタリングは、培養肉の生産において重要です。 スケーリングには、細胞の健康状態と成長をリアルタイムで追跡するための正確なツールが必要です。この記事では、キャパシタンスセンサー、ラマン分光法、蛍光を含む主要な方法をレビューし、産業用途におけるそれらの強みと限界を強調します。
重要な洞察:
- キャパシタンスセンサー: 生存細胞密度を継続的に測定します。接着細胞に効果的ですが、細胞サイズの変化に敏感です。
- ラマン分光法: グルコースや乳酸のような代謝物を追跡します。水性環境に理想的ですが、複雑なキャリブレーションが必要です。
- 蛍光: NADH/NADPH信号を介して代謝活動をモニターします。迅速ですが、培地の背景信号に影響されます。
課題:
- トリパンブルーのような従来のテストは破壊的で遅いです。
- 高い細胞密度と複雑な培地は光学的方法に干渉します。
- センサーの汚れと校正の必要性が効率を制限します。
適切な方法を選択するには、プロセスの要件、バイオリアクターの規模、および無菌性のニーズに依存します。大規模な操作では、複数の技術を組み合わせることで最良の結果が得られることがよくあります。
生細胞密度のための静電容量ベースのセンサー
誘電分光法の仕組み
静電容量センサー、または高周波インピーダンスセンサーとしても知られるこれらのセンサーは、生きた細胞を小さな球状のコンデンサーとして扱います。細胞の懸濁液に電場を加えると、培地中のイオンと細胞質内のイオンが動き始めます。最終的に非導電性の細胞膜に遭遇し、分極 - 膜を横切る電荷の分離を引き起こします[5][6]。
ここでのポイントは、膜が無傷の細胞だけが分極できるということです。膜が無傷でない死んだ細胞はイオンを捕捉できず、したがってキャパシタンス信号に寄与しません[5][7]。Aber Instruments Ltd.の営業・マーケティングディレクターであるJohn Carvellはこれをよく説明しています:
"高周波（RF）インピーダンス...は、哺乳類細胞培養における生細胞濃度を監視するための最も堅牢で信頼性の高い方法と一般的に見なされています。" [5]
誘電分光法は、さまざまな周波数にわたる細胞懸濁液の誘電特性（または誘電率）を測定することによってこれを拡張します。このプロセスは、電場周波数が上昇するにつれて細胞の分極能力がどのように低下するかを示すβ分散曲線を生成します[6]。単一周波数の読み取りは、しばしば細胞の数だけでなく、生存可能なバイオボリューム - 生きている細胞が占める総体積 - を反映します。大きな細胞は小さな細胞よりも自然に信号に多く寄与します[5][6].
これらの原理は、キャパシタンスセンサー技術の基盤を形成し、バイオリアクターシステムにおいて貴重なツールとなっています。
培養肉バイオリアクターにおけるキャパシタンスセンサーの使用
キャパシタンスセンサーは、使い捨ておよび再利用可能なバイオリアクターシステムの両方に対応しています。使い捨てのセットアップでは、使い捨てセンサーディスクを柔軟なフィルムバッグに溶接するか、事前に取り付けられたチューブポートを通して挿入することができます[5][9]。ステンレス鋼のシステムでは、再利用可能な12mmプローブが無菌ポートを介して接続されます[9]。
実用的な例として、アーヘン大学の研究者が20リットルのロッキングモーション使い捨てバイオリアクターでBioPAT ViaMassシステムを使用してCHO DG44細胞を監視したケースがあります。彼らは、キャパシタンスの読み取り値と総細胞体積の間に強い相関（回帰係数0.95）を達成しました[5]。同様に、オランダのXpand Biotechnologyは、Scinus細胞拡張システムでAberバイオマスセンサーを使用し、60 g/Lの密度でマイクロキャリア上で成長した間葉系幹細胞（MSC）を追跡しました。センサーは、150 mLから1リットルの範囲のボリュームで成長プロファイルを効果的に追跡し、オフラインの参照測定と密接に一致する結果を示しました[5]。
培養肉の生産において、キャパシタンスセンサーはマイクロキャリア上の接着細胞と連携する際に優れた性能を発揮します。光学的方法とは異なり、固体キャリアで苦労することがあるキャパシタンスセンサーは、これらの構造を貫通することができます。この能力により、キャパシタンスセンサーは、培養肉製造の基盤であるアンカレッジ依存性細胞のモニタリングに特に有用です[8].
キャパシタンスセンサーの強みと弱み
キャパシタンスセンサーは、手動サンプリングに伴う汚染リスクや遅延なしに、連続的でリアルタイムのデータを提供します。現在、工業的バイオプロセスにおける細胞の生存率を評価するための商業的に利用可能な唯一のオンラインツールです[7]。トリパンブルーアッセイのような従来のオフライン方法では、相対誤差が約10%ですが、キャパシタンス周波数スキャンはこの誤差を5.5%から11%に減少させることができます[6].
とはいえ、これらのセンサーには限界もあります。単一周波数測定では、細胞数の増加と細胞サイズの増加を区別することはできません。例えば、ラン中に細胞が直径で大幅に成長した場合 - ストレスや死滅期によるものであれ - マルチ周波数スキャンを使用しない限り、信号が実際の細胞数を誤って表す可能性があります[6]。さらに、供給の追加や希釈など、懸濁媒の変化は、実際のバイオマスの変化を反映しない一時的な「ディップ」をデータに引き起こす可能性があります[5]。揺動式バイオリアクターでは、センサーが一時的に気相に遭遇することがあり、信号干渉を避けるために高度なフィルターアルゴリズムが必要です[5]。
これらの要因は、培養肉生産のための生細胞モニタリングを微調整する際に重要です。
生細胞分析のための分光法
ラマンおよびNIR分光法
ラマン分光法は、785 nmレーザーからの非弾性光散乱を使用して分子指紋を生成し、グルコース、乳酸、グルタミン、アンモニウムなどの代謝物を同時に測定します。一方、NIR分光法（800–2,500 nm）は、オーバートーンおよび組み合わせバンドからの光吸収を検出します[10][12][13][14]。ラマンの水に対する感度が低いため、細胞培養のような水性環境に理想的ですが、NIRの水に対する高い感度は、強いO–H伸縮信号のために重要な生化学データを隠す可能性があります[10][12][14]。
2017年3月、Lonza Biologicsは、15 mLの小型バイオリアクター（ambr™システム）でNIR、ラマン、2D蛍光を比較しました。ラマンが乳酸とグルコースの測定に最も信頼性が高いことがわかり、一方でNIRはグルタミンとアンモニウムイオンレベルの予測に優れていることが判明しました[10][11].
2022年4月、Sartorius Stedim Biotechの研究者たちは、CHO細胞のパーフュージョンプロセスのセルフリーハーベストストリームにインラインラマンフローセルを統合しました。HyperFluxPROラマンスペクトロメーターと785 nmレーザーを使用して、グルコースの自動フィードバック制御を達成し、数日間にわたり濃度を4 g/Lおよび1.5 g/Lで±0.4 g/Lの変動で維持しました[13]. J.Sartorius Stedim BiotechのLemkeは次のように述べました:
"この結果は、バイオリアクターとスケールに依存しない測定方法を用いたパーフュージョンプロセスの高度なプロセスモニタリングと制御におけるラマン分光法の高い可能性を示しています。" [13]
2011年5月、Bristol-Myers Squibbは500リットルのバイオリアクターでインラインラマンプローブを使用し、グルタミン、グルタミン酸、グルコース、乳酸、アンモニウム、生細胞密度（VCD）、総細胞密度（TCD）を含む複数のパラメータをモニタリングしました。スペクトルはKaiser Optical SystemsのRamanRXN3機器を使用して2時間ごとに収集され、ラマンが大規模製造におけるフィード添加中の栄養素の増加と代謝物の減少を追跡する能力を示しました[14]。
ラマンおよびNIR分光法が詳細な化学的洞察を提供する一方で、蛍光およびUV-Vis法は細胞代謝とバイオマスに関する補完的な視点を提供します。
蛍光およびUV-Vis分光法
UV-Vis分光法は、光の吸収または散乱を測定して総バイオマスを推定します[16]。この簡単で広く使用されている方法は、しかし、生存細胞と死細胞を区別するのが難しく、細胞密度が高くなると精度が低下します[16]。
UV-Visよりも感度の高い蛍光測定法は、NADHやNADPHのような代謝活動の指標となる特定の細胞内マーカーに焦点を当てます。インシチュ蛍光測定法は、366 nmの紫外線を使用してNADH/NADPHを励起し、それが約460 nmで蛍光を発します[16]。Veer Pramod Perwezが説明します:
"細胞集団の生化学的または代謝的状態に関する情報を提供するためにこれまでに開発された唯一の連続監視戦略は、in situ蛍光測定です。" [16]
培養肉の生産において、リアルタイムデータが不可欠な場合、蛍光は代謝変化に関する迅速なフィードバックを提供し、UV-Visはバイオマスを推定する経済的な方法を提供します。蛍光はNADHレベルを監視することで代謝の変化を追跡し、基質の枯渇をリアルタイムで検出できます。例えば、ある研究では、2D蛍光がRMSECV 0.031 g/Lでアンモニウム濃度を測定し、ミニチュアバイオリアクター設定においてラマンおよびNIRの両方を上回りました [11]。さらに、自動化されたマイクロ流体プラットフォームは、プロピジウムヨウ化物を使用した蛍光検出と明視野顕微鏡（総細胞濃度を測定するため）を組み合わせ、わずか10で細胞の生存率を決定できます。3分 [15].
異なる分光法の比較
これらの技術を比較する際、それぞれがバイオリアクターのモニタリングにおいて独自の強みを持っています。ラマン分光法は、分子の指紋認識と水からの干渉が少ないため、グルコース、乳酸、抗体の濃度を予測する能力で際立っています [10][11]。NIRは水に対する感度があるにもかかわらず、グルタミンとアンモニウムのモニタリングにより効果的です [10][12]。蛍光分光法は代謝活動と生存率に関する詳細な洞察を提供し、UV-Visは総バイオマスを推定するためのシンプルでコスト効率の高い選択肢です [16]。
多変量解析は複雑なスペクトルの解釈を向上させ、複数の分析物の同時監視を可能にします[10][13][14]。培養肉の生産において、適切な分光法の選択は、監視する代謝物、バイオリアクターの規模、使い捨てシステムまたは多用途システムの使用に依存します。これらの技術は、正確な細胞監視を可能にし、ラマン分光法は水性環境との互換性と多分析物能力により、大規模な運用に特に魅力的です[13][14]。
哺乳類細胞培養 - ラマンを用いた上流バイオプロセスのモニタリング&および制御
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細胞生理学と生存率のための先進的手法
分光法に加えて、最先端の技術は細胞の生理学と生存率に関するより深い洞察を提供します。
細胞の生存率とアポトーシスのモニタリングのためのFTIR
FTIR分光法は、タンパク質、脂質、炭水化物の分子振動を利用して、栄養ストレスと早期アポトーシスを検出します。これらは、培養肉バイオリアクターにおける細胞健康の低下の重要な指標です。
一つのアプローチであるATR-FTIR（減衰全反射）は、高波数領域のスペクトル変動を分析して、健康な細胞と栄養不足の細胞を区別します。2024年5月に、Dxcover Ltd.の研究者たちが。ATR-FTIRプラットフォームに使い捨て内部反射素子（IRE）を装着し、CHO細胞の健康状態を監視しました。主成分分析（PCA）を使用して、PC空間で健康な細胞と栄養不足の細胞を区別することに成功しました。このプラットフォームは、グルコースと乳酸に対して0.98に近い印象的なマルチアウトプットR²値を達成し、細胞の生存率に関するリアルタイムの洞察を提供します[17]。乳酸の蓄積は細胞死を引き起こす可能性があるため、このリアルタイム監視により、細胞の健康を維持するためのタイムリーな介入が可能になります。
現代のFTIRシステムは、使い捨てIREまたはバイオリアクター環境への直接統合のための浸漬プローブを備えて設計されています。このセットアップは、リアルタイムデータを提供するだけでなく、汚染リスクも軽減します[17]。バイオエンジニアリングとバイオテクノロジーのフロンティアで強調されているように:
"分光法に基づく技術は、非破壊的であり、サンプルの準備が最小限で済むため、PATアプローチとして非常に適しています。" [17]
これらの能力を拡張することで、多周波容量スキャンは単一周波数法の限界に対処します。
多周波容量スキャン
単一周波数の容量センサーは、生細胞体積（VCV）の測定には有用ですが、細胞サイズと細胞数の変化を区別するのに苦労します。この制限は、アポトーシス中に細胞の直径がしばしば増加する際に特に問題となります [18]。多周波数容量スキャンは、50–20,000 kHzの範囲で誘電率を測定し、β分散曲線を捉えることで、サイズの変動に関係なく生存細胞濃度を正確に評価することでこの問題を解決します[18].
2019年10月、Sartorius Stedim Biotechの研究者は、Aber InstrumentsのFUTURA picoプローブを使用して、250 mLバイオリアクター内のDG44 CHO細胞を監視しました。直交部分最小二乗法（OPLS）モデリングを25の個別周波数に適用することで、VCC予測誤差を5.5%から11%にまで低減し、単一周波数測定で見られる16%から23%の誤差率に比べて大幅に改善しました[18]。このモデルは、1,000万細胞/mLを超える細胞濃度を効果的に追跡し、希釈や給餌の変更によって引き起こされる偏差を迅速に特定し、誤差範囲は6.7%から13%でした。2% [18].
細胞の分極が半分完了する点を示す特性周波数（fC）は、細胞のサイズと分極性に基づいてシフトします。これは、特に形態が顕著に変化する細胞死の段階での生理学的変化の追加の指標を提供します[18]。Analytical and Bioanalytical Chemistryは次のように説明しています:
"VCCと細胞直径の誘電率信号への影響は、1つの周波数測定では区別できません。" [18]
ライブセルモニタリングのための分析手法の比較
バイオリアクターにおけるライブセルモニタリングのための分析手法の比較
このセクションでは、培養肉バイオリアクターで使用されるライブセルモニタリングのための主要な分析手法を、以前に議論された高度な技術に基づいて詳しく見ていきます。
最適な方法を選択するには、精度、速度、実用性のバランスを取る必要があります。各技術は、細胞の生存密度の追跡、代謝活動のモニタリング、または使い捨てシステムでの無菌性の維持など、独自の強みを提供します。
キャパシタンスベースのセンサーは、現在、商業的に利用可能な唯一のオンラインオプションであり、生存率モニタリングに特化しています[7]。これらのセンサーは、交番電場における膜が無傷の細胞の分極を検出することによって、生細胞体積を測定します。単一周波数システムは細胞サイズが変動する場合に精度に苦労することがありますが、多周波数スキャンは精度を大幅に向上させ、誤差範囲を5.5%–11%に達成します[18].
分光法 - ラマン、NIR、蛍光分光法など - は、代謝活動のより包括的なビューを提供し、バイオマスと並行して複数のパラメータを追跡します。これらの方法は非侵襲的であり、無菌性が重要な使い捨てバイオリアクターに理想的です。しかし、課題もあります：分光システムは化学計量モデルによる広範なキャリブレーションが必要であり、しばしばキャパシタンスプローブと比較して初期コストが高くなることがあります。
FTIR分光法は、分子振動分析を通じてアポトーシスや栄養ストレスの初期兆候を検出するのに特に効果的です。しかし、その強い水吸収は、水性環境での連続インラインモニタリングの実用性を制限します[7]。代わりに、FTIRは特に多変量解析と組み合わせてリアルタイムの代謝物追跡を行う場合に、アットライン法として最適に機能します。
分析方法比較表
| 方法 | リアルタイム機能 | バイオリアクター適合性 | 校正の必要性 | 主な制限事項 |
|---|---|---|---|---|
| キャパシタンスセンサー | はい（インライン/オンライン） | 高い（撹拌、ロッキング、SUBs） | 低から中程度 | ガスバブルや細胞サイズ/形態の変化に敏感 |
| ラマン分光法 | はい（インライン） | 中程度（プローブポートが必要） | 高い（ケモメトリックス） | 高い機器コスト; 複雑なデータ解釈 |
| NIR分光法 | はい（インライン/アットライン） | 高い | 高い（多変量） | 水干渉および媒体の変化に対する感度 |
| 蛍光 | はい（インライン） | 高い | 中程度 | 媒体からの背景蛍光; フォトブリーチング |
| FTIR | はい（アットライン） | 中程度 | 高い | 強い水吸収が水性媒体でのインライン使用を制限 |
結論と推奨事項
適切な分析方法を選択するには、プロセス要件と規模、コスト、規制要件などの要因をバランスさせる必要があります。選択は、細胞が接着性か懸濁適応性か、モニタリングの頻度、無菌性を維持しながら許容できる侵襲性の程度などの重要な考慮事項に依存します [1]。培養肉生産の大規模な細胞需要に伴い [1]、モニタリングの精度は妥協できません。
分析方法を選択するための重要な要因
リアルタイムモニタリング は最優先事項であるべきです。オンラインシステムは、サンプルを取り除くことなくその場でデータを収集できるため、オフラインの方法と比べて効率的でエラーが少なく、労働集約的で汚染のリスクがある方法よりも優れています[3][1]。2,000リットル以上の大規模なバイオリアクターにおいては、ラマン分光法や近赤外分光法のような非侵襲的な技術が特に有用です。これらの方法は試薬を必要とせず、グルコース、乳酸、アミノ酸などの複数のパラメータを同時に追跡することができます[1][3]。この多変量の能力は、モニタリングコストを削減するだけでなく、規制遵守に必要な無菌で食品グレードの環境を維持します[19]。
感度と動的範囲は、複雑な生物学的媒体を分析する際に同様に重要です。ルミネッセンスベースのアッセイは、一般的に蛍光や吸光度法よりも高い感度を提供します[2]。一方で、先進的な分光技術は、しばしば機械学習やケモメトリックツールを必要とする複雑なデータセットを生成します[3][1]。より簡単な解決策として、キャパシタンスベースのセンサーは細胞の生存率を監視するのに効果的です。
スケーラビリティと規制遵守は商業生産において不可欠です。これらの環境でのセンサーは、高温滅菌に耐え、浸出を最小限に抑え、再校正を必要とせずに長期間動作する必要があります。自動化された画像ベースの追跡システムは、FDAやEMAのような機関への規制提出に重要な、タイムスタンプ付きで監査対応の文書を提供することもできます[4]。これらの要件は、専門のサプライヤーから適切な機器を調達することの重要性を強調しています。
機器調達の効率化 Cellbase
技術的および規制上の複雑さを考慮すると、適切な分析機器を見つけることが重要です。一般的なラボプラットフォームは、培養肉産業に特化した専門知識を欠いていることが多いです。
よくある質問
培養肉生産のためのバイオリアクターにおける容量センサーの使用の利点は何ですか？
容量センサーは、バイオリアクター内の生細胞バイオマスを測定するためのリアルタイムで非侵襲的な方法を提供します。プロセスを中断することなく正確で信頼性の高いデータを提供し、細胞の成長と健康を追跡するための優れた選択肢です。
これらのセンサーは、小規模なセットアップから大規模な使い捨て産業用バイオリアクターまで、あらゆるサイズのシステムでシームレスに機能します。この柔軟性により、プロセス管理が向上し、オフラインサンプリングへの依存が最小限に抑えられ、生産ワークフローが合理化されます。セル活動に関する詳細な洞察を提供することで、キャパシタンスセンサーは、特に培養肉の生産において、バイオプロセスの改善に重要な役割を果たします。
バイオリアクター内の細胞代謝物を監視するためのラマン分光法の利点は何ですか？
ラマン分光法は、リアルタイムで非侵襲的にバイオリアクター内の重要な細胞代謝物を直接追跡することを可能にします。このアプローチはサンプルを取り出す必要を排除し、汚染のリスクを大幅に低減します。グルコース、乳酸、アンモニウム、製品濃度などの化合物を同時に測定できるため、パーフュージョンランのような長時間のプロセスにおいて効率的なツールとなります。
他の方法と比較して、ラマン分光法はしばしばグルコースや乳酸のような重要な代謝物に対してより高い精度を提供します。特定の条件下では、近赤外線（NIR）や2D蛍光などの技術を上回ることさえあります。従来のオフライン手法、例えばHPLCや比色分析とは異なり、ラマン分光法は連続的に作業を行い、細胞培養の完全性を保ちながら時間とリソースの使用を削減します。
培養肉の生産において、ラマン分光法はコンパクトなバイオリアクターとの互換性と、信頼性の高いキャリブレーション不要の測定を提供する能力で際立っています。ラマンベースのモニタリングツールを必要とする方には、
高細胞密度のバイオリアクターで光学的方法を使用する際の課題は何ですか？
高細胞密度の環境では、光学的方法は光散乱の増加や培地の濁度などの課題に直面し、測定が歪む可能性があります。細胞の破片の蓄積が信号を弱め、非線形の反応を引き起こし、正確な読み取りをさらに困難にします。
これらの問題は、条件が絶えず変化し複雑なバイオリアクターで特に問題となります。これらの制限に対処し、信頼性のあるモニタリングを維持するためには、より高度な分析技術が必要になるかもしれません。
