먼저 편집하고 나중에 확인하면, 클론에서 목표에서 벗어난 변경을 수정할 수 있습니다. 워크플로를 간단하게 유지하겠습니다: 가장 낮은 위험의 편집 방법을 선택하고, 편집기 노출을 짧게 유지한 후, 출시 전에 예측된 비표적 사이트와 클론 안정성을 테스트합니다.
생물공정 엔지니어, 세포 배양 과학자, 배양육 연구개발 팀에게 주요 요점은 간단합니다. CRISPR 시스템은 여전히 근접 일치 사이트에서 절단할 수 있으며, 종종 3–6개의 불일치를 허용하고, 이러한 오류는 확장된 단일 세포 클론으로 전달될 수 있습니다. 이 기사는 위험 관리를 세 단계로 나눕니다: 편집 전, 편집 중, 그리고 편집 후.
다음은 간단한 용어로 된 전체 체크리스트입니다:
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작업에 가장 낮은 위험의 편집 도구 선택
- 기본 편집 또는 프라임 편집 을 사용하여 이중 가닥 절단 없이 편집을 수행할 수 있는 경우 사용
- 유전자 조절만 필요하다면 dCas9 기반 조절 사용
- 뉴클레이즈가 필요하다면 고정밀 Cas9 변형으로 시작
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시작 물질 고정
- 세포주 정체성 확인
- 마이코플라스마 검사
- 배양 횟수 기록
- 작업 라인의 실제 표적 부위를 시퀀싱하고, 참조 게놈만 시퀀싱하지 않음
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습식 작업 전에 가이드 스크리닝
- 정렬 기반 및 점수 기반 오프 타겟 도구를 함께 사용
- 오직 높은 온 타겟 활동만 있는 가이드보다 더 깨끗한 오프 타겟 프로파일을 가진 가이드를 선호
- 가이드 길이, 40–60% GC 함량, 및 동종 중합체 실행 주의
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세포 내 노출 제한
- 가능한 경우 플라스미드 또는 바이러스 시스템 대신 RNP 또는 mRNA 전달 사용
- 최소 유효 용량 사용
- 트랜스펙션 결과를 강제로 얻기 위해 편집기 지속 시간을 연장하지 않도록 주의
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고위험 사례에 대한 추가 제어 추가
- 쌍 닉케이스 고려
- 타이밍이 중요한 경우 유도성, 분할-Cas9, 또는 광 제어 시스템 사용
- 필요한 경우 종료 단계로 항-CRISPR 단백질 추가
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편집 후 올바르게 검증하십시오
- 먼저 목표 편집을 확인하십시오
- 예측된 모든 비표적 사이트를 타겟 앰플리콘 NGS로 확인하십시오
- 프로젝트 위험이 높을 때 GUIDE-seq, CIRCLE-seq, CAST-seq, UDiTaS, 또는 WGS로 이동하십시오
- 베이스 또는 프라임 에디터, 의 경우 관련된 경우 RNA 수준 검사를 추가하십시오
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단일 클론을 시퀀스만으로 릴리스하지 마십시오
- 2–3개의 독립적인 클론을 비교하십시오
- 편집되지 않은 부모 대조군을 사용하십시오
- 불안정성이나 표현형 드리프트가 있는 클론을 제거하십시오
- 편집 상태, 비표적 스크린 및 기록이 모두 완료되었을 때만 릴리스하십시오
짧게 생각하면: 비표적 절단을 피하기 위한 설계, 세포 내 시간을 제한하기 위한 전달, 그런 다음 프로젝트 위험이 요구하는 깊이에서 검증. 그것이 전체 작품을 관통하는 주제입니다.
CRISPR 비표적 위험 관리: 세포주 편집을 위한 3단계 체크리스트
편집 전 체크리스트: 편집 시작 전에 위험 줄이기
편집 목표를 정의하고 가장 낮은 위험의 편집 방법 선택
단일 시약을 주문하기 전에 편집이 무엇을 의미하는지 명확히 하십시오. 노크아웃, 노크인, 단일 뉴클레오타이드 변화, 전사 조절은 동일한 비표적 위험을 가지지 않습니다. 또한 동일한 도구를 요구하지 않습니다.
광범위한 위험 순서는 간단합니다. Cas9 및 Cas12와 같은 DSB 형성 뉴클레아제는 큰 결실, 전좌 및 DNA 손상 반응을 유발할 수 있기 때문에 위험의 상단에 위치합니다 [1][7] . 베이스 에디터와 프라임 에디터는 닉케이스를 사용하여 DSB를 피하고 구조적 변이의 위험을 줄입니다 [1] [5]. 전사 조절을 위해, dCas9가 전사 조절 인자와 융합된 후성유전학적 에디터는 DNA 서열을 변경하지 않습니다 [1].
실용적인 규칙은 간단합니다: 필요한 편집을 제공할 수 있는 가장 낮은 유전독성 방법을 사용하십시오. 단일 뉴클레오타이드 변화를 위해서는 CBEs 또는 ABEs가 HDR보다 더 적합하며, HDR은 여전히 인델을 도입할 수 있습니다 [3][1]. 치환 및 작은 삽입 또는 삭제의 경우, 프라임 에디팅은 표준 CRISPR-Cas9보다 낮은 오프 타겟 활동을 보이는 경우가 많습니다 [1]. 뉴클레아제를 사용해야 한다면, SpCas9-HiFi, eSpCas9, 또는 SpCas9-HF1 [1][6].
와 같은 고충실도 변형을 선택하십시오.편집 접근 방식이 설정되면, 작업 세포주와 정확한 타겟 시퀀스를 고정하십시오.
세포주 정체성, 이력 및 타겟 유전자좌 시퀀스를 확인하십시오
세포주가 잘못 식별되었거나 교차 오염된 경우, 나머지 워크플로우가 흔들리기 시작합니다. 잘 설계된 가이드 RNA도 나쁜 시작 물질을 구제하지 못할 것입니다. 편집을 시작하기 전에 세포주 정체성을 확인하십시오. 동시에, 마이코플라스마 상태를 확인하고 현재 패시지 번호를 기록하십시오. 높은 패시지 세포는 유전체 안정성과 편집 효율성을 변화시킬 수 있습니다 [1][6].
마찬가지로, 참조 유전체에만 의존하지 마십시오.작업 세포주에서 정확한 표적 부위를 시퀀싱하십시오. 이 단계는 가이드 결합을 방해하거나 새로운 오프 타겟 사이트를 생성할 수 있는 SNP 또는 인델을 발견하는 데 도움이 됩니다 [1][6].
그 후, 가이드 설계로 이동하십시오.
시약을 선택하기 전에 인 실리코 오프 타겟 스크리닝을 실행하십시오
표적 부위가 확인되면, 젖은 실험실 작업에 착수하기 전에 인 실리코에서 후보 가이드 RNA를 스크리닝하십시오. Cas-OFFinder 또는 FlashFry, 와 같은 정렬 기반 도구와 CFD 스코어링 또는 DeepCRISPR. 와 같은 스코어링 기반 도구를 사용하십시오. 첫 번째 그룹은 서열 상동성을 가진 유전체 사이트를 찾는 데 도움이 됩니다. 두 번째 그룹은 예측된 절단 확률에 따라 해당 사이트를 순위 매기는 데 도움이 됩니다 [1][5] .
가이드를 선별할 때, 더 깨끗한 오프 타겟 프로필이 원시 온 타겟 효율성을 능가해야 합니다. 70%의 온 타겟 효율성과 예측된 오프 타겟이 없는 가이드는 90% 효율성과 여러 고위험 사이트가 있는 가이드보다 시작하기에 더 안전한 장소입니다 [6]. 일부 설정에서는 가이드 길이를 20 bp에서 17-18 bp로 줄이면 온 타겟 정확도를 크게 잃지 않고 오프 타겟 이벤트를 최대 500배까지 줄일 수 있습니다 [5]. GC 함량을 40%에서 60% 사이로 목표로 하고, 네 개 이상의 동일한 염기의 연속을 피하십시오 [6][5].
그렇긴 하지만, 인 실리코 스크리닝에는 한계가 있습니다. 이는 크로마틴 상태, 세포 주기 또는 세포 특유의 맥락을 잘 설명하지 못합니다 [1][6][4]. 이를 증거가 아닌 필터로 생각하십시오. 그것은 범위를 좁히지만, 실험적 확인을 대체하지는 않습니다.
가장 위험도가 높은 예측된 사이트를 편집 및 검증 계획에 포함시키십시오.
sbb-itb-ffee270
편집 체크리스트: 편집기 선택, 전달 및 노출 제어
높은 특이성의 편집기와 잘 평가된 가이드 RNA를 사용하십시오.
예측된 오프 타겟 목록에서 시작하여 편집기를 선택하는 데 사용하십시오. 대부분의 경우, 고충실도 SpCas9 변형 - SpCas9-HiFi, eSpCas9, 또는 SpCas9-HF1 - 이 야생형 SpCas9보다 더 나은 기본값입니다 [6][1]. 야생형 SpCas9는 세 개에서 다섯 개의 염기쌍 불일치를 허용할 수 있습니다, 특히 PAM-원거리 영역 , 에서, 이는 민감한 세포주에서 의미 있는 오프 타겟 위험을 초래합니다 [3].
여기에는 간단한 규칙이 도움이 됩니다: 여전히 의도한 편집을 제공하는 가장 비활성화된 고충실도 편집기를 사용하십시오.
기본 편집기의 경우, 부작용 편집과 RNA 비표적 효과를 DNA 비표적 위험과 별도로 추적하십시오. [1][8] . 이들은 다른 실패 모드이며, 별도의 검사가 필요합니다. 이중 가닥 절단 없이 편집을 수행할 수 있다면, , 기본 편집 또는 프라임 편집이 더 높은 위험 워크플로우에 더 적합할 수 있습니다. [1] [8].
편집기를 선택한 후에는 세포 내에서의 시간을 가능한 한 짧게 유지하는 것이 다음 작업입니다.
일시적인 전달과 최소 유효 용량으로 편집기 지속성을 제한하십시오.
편집기 지속성은 편집기 선택만큼 중요합니다.편집기가 세포 내에서 활성 상태로 오래 있을수록, 낮은 확률의 부위에서 작용할 시간이 더 많아집니다. 이는 전달 형식을 주요 제어 지점으로 만듭니다.
일시적 전달 방법을 사용하고, RNPs 또는 mRNA, 와 같은 방법을 사용하며, 편집기 발현을 연장하는 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터를 피하십시오 [1] [5]. 실제로, RNP 전달이 기본값이 되어야 합니다 [6] .
용량도 중요합니다. 높은 뉴클레아제 농도는 낮은 민감도의 비표적 부위에서 절단 가능성을 증가시킵니다 [5]. 최소 유효 용량 . 을 사용하십시오. 형질 도입 효율이 낮다면, 단순히 더 많은 시약을 추가하고 최선을 기대하지 마십시오. 이는 문제를 해결하기보다는 오히려 문제를 옮기는 경우가 많습니다.
고위험 워크플로우에 대한 정밀 보호 장치 추가
일부 워크플로우는 추가적인 안전 장치가 필요합니다. 이는 특히 종양 유전자, 종양 억제 유전자, 또는 p53-민감 세포주, 와 같은 타겟 근처에서 한 번의 비표적 이벤트가 과도한 비용을 초래할 수 있는 경우에 해당됩니다 [1][6][3].
유용한 보호 장치에는 다음이 포함됩니다:
- 쌍 니케이스, 는 두 개의 인접한 절단이 필요합니다. 단일 비표적 니크는 일반적으로 돌연변이 없이 복구되므로, 표준 뉴클레아제 설정과 비교하여 비표적 위험이 크게 감소합니다 [4][1].
- 유도성, 빛 제어, 또는 분할-Cas9 시스템, 전달이 효율적이고 노출이 짧아야 할 때 편집기 활동을 엄격한 시간 내에 유지하는 데 도움이 됩니다 [1].
- Anti-CRISPR (Acr) 단백질, 종료 스위치로 작용합니다. 이러한 자연 발생 Acr 단백질은 정의된 간격 후에 CRISPR-Cas 복합체를 비활성화하여 편집기 활동에 대한 분자적 제동을 제공합니다 [1].
편집 후 체크리스트: 비표적 이벤트 감지 및 클론 검증
예측된 비표적 부위를 타겟 시퀀싱으로 스크리닝
편집이 완료되면 먼저 온타겟 위치에서 의도한 변경을 확인하십시오. 풀링된 세포에서 빠른 첫 번째 검사를 위해 T7 Endonuclease I, 제한 소화 또는 플랭킹 PCR과 같은 불일치 절단 분석을 사용할 수 있습니다.각 방법에는 해석에 주의해야 합니다: 특히 희귀한 편집이나 동형접합 변이에 대해 민감도 한계가 있습니다 [9].
클론 수준의 검증을 위해 타겟 앰플리콘 NGS가 표준입니다. 이는 대립 유전자 빈도의 정량적 관점을 제공하며 0.01%에서 0.1%까지 변이를 감지할 수 있습니다 [3].
예측된 모든 오프 타겟 사이트를 타겟 앰플리콘 NGS로 시퀀싱하십시오. 이는 기본 검증 단계가 되어야 합니다.
프로젝트 위험이 높을 때는 전장 유전체 또는 구조적 분석으로 확대하십시오
사이트별 스크리닝만으로는 항상 충분하지 않습니다. 편집기, 타겟 위치, 세포주가 숨겨진 위험을 시사하는 경우, 사전에 예측하지 못한 이벤트를 감지할 수 있는 분석으로 이동하십시오.
전장 유전체 발견 분석인 GUIDE-seq 및 CIRCLE-seq는 사전 오프 타겟 사이트 목록이 필요하지 않습니다. GUIDE-seq는 0.03% [2]. 만큼 낮은 indel 빈도의 오프 타겟 사이트를 감지할 수 있습니다. CIRCLE-seq는 94%의 오프 타겟 사이트를 in vitro [3]. 까지 식별할 수 있습니다. 이러한 방법은 세포 유형의 맥락이 오프 타겟 활동을 가릴 수 있는 경우에 유용합니다.
큰 재배열이 걱정된다면, 표준 앰플리콘 리드는 주요 문제를 놓칠 수 있습니다. 삭제, 역위 및 전좌는 CAST-seq 및 UDiTaS [1]. 와 같은 구조적 변화를 위한 분석이 필요합니다.
전체 유전체 시퀀싱 (WGS)은 가장 광범위한 옵션입니다. 이는 유전체 전반에 걸쳐 indel, 구조적 변이 및 복제 수 변화를 감지할 수 있습니다 [1] . The trade-off is depth and cost: it usually needs 20–60× coverage, which makes it a poor fit for routine screening of bulk populations [1].
예측된 부위에 대해 타겟팅된 앰플리콘 NGS를 사용하십시오. 더 높은 위험 프로젝트의 경우, 전장 유전체 또는 구조적 분석으로 이동하십시오. 기본 또는 프라임 에디터의 경우, RNA 수준의 오프 타겟 효과를 확인하기 위해 RNA-seq를 추가하십시오.
여러 독립적인 클론을 선택하고 방출 기준을 문서화하십시오
서열 검사가 끝난 후, 하나 이상의 클론에서 표현형을 테스트하십시오.
단일 편집 클론으로 진행하지 마십시오. 최소한 두세 개의 독립적인 클론 집단을 분리하고 확장하여 편집되지 않은 부모 대조군과 비교하십시오 [4][9]. 불안정성이나 표현형 변이를 보이는 클론을 제거하십시오 [3]. 그런 다음 목표한 앰플리콘 NGS [9] .
를 사용하여 이형접합 또는 동형접합 상태의 의도된 편집을 확인하십시오.문서화는 끝의 관리 작업이 아닙니다. 이는 클론 릴리스의 일부입니다. 부모 계통 배경, sgRNA 설계, 뉴클레아제 변형, 전달 방법 및 모든 QC 결과를 기록하십시오 [3]. 의도된 편집이 확인되고 예측된 비표적 사이트가 명확하며 전체 기록이 준비된 경우에만 클론이 진행되어야 합니다.
CRISPR: 를 사용한 유전체 편집: 비표적 효과를 효과적으로 최소화하는 방법
결론: 더 깨끗한 세포주 편집을 위한 3단계 체크리스트
종합적으로, 체크리스트는 비표적 제어를 일회성 QC 검사가 아닌 단계적 프로세스로 취급합니다. 목표는 간단합니다: 위험을 조기에 줄이고, 편집기 활동을 제한한 다음 결과를 확인하는 것입니다.
검증 깊이는 위험과 일치해야 합니다. 의도한 대립 유전자 상태에서 확인된 여러 독립적인 클론만 방출하십시오.
자주 묻는 질문
왜 하나의 클론에 의존하지 않나요?
단일 클론에 의존하는 것은 위험합니다. CRISPR 편집은 완벽하게 특정적이지 않기 때문에, 예기치 않은 비표적 돌연변이를 도입할 수 있습니다.
그래서 팀들은 보통 여러 클론 집단을 확장합니다. 이렇게 하면 유해한 비표적 변화 없이 의도한 표적 편집을 가진 라인을 찾기 쉬워집니다.
또 다른 이유도 있습니다: 세포주는 유전적 이질성을 보일 수 있습니다. 여러 클론을 시퀀싱하면 목표 유전자 좌위 전반에 걸쳐 의도한 동형접합 녹아웃 또는 다른 표적 부위 수정이 존재하는지 확인하는 데 도움이 됩니다.
앰플리콘 NGS는 언제 충분한가?
앰플리콘 기반 차세대 시퀀싱은 컴퓨터 도구나 다른 스크리닝 방법에 의해 표시된 잠재적 오프 타겟 사이트를 확인하는 데 목표 지향적이고 비용 효율적인 방법이 필요할 때 종종 충분합니다.
전체 유전체 시퀀싱은 여전히 오프 타겟 효과를 완전히 정량화할 수 있는 유일한 방법입니다. 그러나 많은 응용 프로그램에서는 그 수준의 분석이 필요하지 않습니다.
가장 안전한 편집기를 어떻게 선택하나요?
여전히 온 타겟 사이트를 잘 절단하는 가장 활동성이 낮은 CRISPR 뉴클레이즈 변형 을 선택하세요.
예측만으로는 최상의 변형을 선택할 수 없습니다. 유일하게 신뢰할 수 있는 방법은 선택된 뉴클레이즈 변형을 대상으로 작은 스크린을 실행하고 차세대 시퀀싱으로 편집을 읽어내는 것입니다..
배양육 연구개발을 위해, 실용적인 경로를 제공합니다: 변형의 짧은 목록으로 시작한 다음, 목표 부위를 효율적으로 편집할 수 있는 가장 덜 활성화된 옵션을 찾을 때까지 약한 것들을 단계적으로 테스트합니다.
