A tensão de cisalhamento pode fazer ou quebrar a produção de carne cultivada. Por quê? Porque as células usadas não possuem paredes protetoras, tornando-as suscetíveis a danos causados por forças de fluido em biorreatores. Este artigo explora como a tensão de cisalhamento afeta essas células, os limites que elas podem suportar e maneiras de projetar sistemas que as protejam.
Pontos principais:
- A tensão de cisalhamento surge do movimento do fluido e pode prejudicar células animais frágeis, causando danos à membrana, descolamento ou morte.
- A maioria das células de mamíferos tolera 0,3–1,7 Pascals, mas mesmo níveis mais baixos podem ativar respostas de estresse.
- Escolhas de design como tipo de impulsor, métodos de aeração e geometria do biorreator impactam diretamente as forças de cisalhamento.
- Estratégias para minimizar danos incluem o uso de designs de biorreatores mais suaves (e.g. , sistemas de elevação por ar ou oscilantes), otimização das velocidades de agitação e adição de agentes protetores como Pluronic F68.
Para carne cultivada, gerenciar esse equilíbrio é crítico para garantir que as células cresçam e se diferenciem sem danos, especialmente à medida que a produção aumenta. Vamos explorar a ciência por trás desses limites e soluções práticas para o design de biorreatores.
110: Girando Como a Terra: Projetando Biorreatores de Baixo Cisalhamento para Melhor Cultura Celular com Olivier De...
O Que Afeta o Estresse de Cisalhamento em Biorreatores
Compreender os fatores que influenciam o estresse de cisalhamento em biorreatores é crucial para otimizar as condições, especialmente quando células delicadas estão envolvidas. Vamos mergulhar nos principais elementos que moldam sua intensidade e distribuição.
Design e Condições Operacionais do Biorreator
O design de um biorreator desempenha um papel importante na determinação de onde e como o estresse de cisalhamento ocorre. Um fator chave é o tipo de impulsor utilizado.Por exemplo, turbinas Rushton podem criar taxas de dissipação de energia até 280 vezes maiores que a média do vaso, enquanto hélices de fluxo axial de alta eficiência como o HE3 produzem taxas próximas a 180 vezes a dissipação média [4]. Outros elementos de design, como diâmetro do impulsor, velocidade e posicionamento, também influenciam a distribuição de energia.
Curiosamente, a aeração introduz forças muito mais severas do que a agitação. Quando pequenas bolhas (1–2 mm) se rompem, elas liberam níveis de energia entre 10⁷–10⁹ W/m³, o que pode matar mais de 1.000 células em um único evento [4]. Isso torna o comportamento das bolhas uma consideração crítica, especialmente na produção de carne cultivada.
Defletores são outro elemento de design chave. Eles evitam a formação de um vórtice na cultura, que de outra forma puxaria bolhas para o líquido e aumentaria os eventos de ruptura na superfície [4]. Além disso, a relação entre o diâmetro do impulsor e o vaso e a altura do impulsor a partir do fundo influenciam como a energia se espalha por todo o biorreator.
Distribuição Desigual de Tensão de Cisalhamento
A tensão de cisalhamento não é distribuída uniformemente pelo biorreator. Pesquisas mostram que a dissipação de energia tende a se concentrar em zonas específicas, como a área de descarga do impulsor, vórtices de arrasto e a superfície do líquido onde as bolhas se rompem. Esses pontos críticos podem representar desafios durante a ampliação.
Weiwei Hu da Biogen Idec destaca este problema de escala:
A percepção de 'sensibilidade ao cisalhamento' historicamente colocou um limite superior arbitrário na agitação e aeração na operação de biorreatores; no entanto, à medida que as densidades celulares e produtividades continuam a aumentar, os requisitos de transferência de massa podem exceder aqueles impostos por esses limites arbitrariamente baixos [4].
Por exemplo, um estudo de 2021 realizado por Junxuan Zhang e Xueliang Li da Universidade de Jiangnan comparou um frasco agitador de 250 mL com um reator tanque agitado de 20 m³ usando dinâmica de fluidos computacional. Eles observaram que, mesmo nas velocidades de agitação mais baixas, as forças de cisalhamento no reator maior eram fortes o suficiente para desprender células dos microcarregadores, com aeração introduzindo ainda mais estresse do que a agitação [3].
Formato de Cultura e Sensibilidade ao Cisalhamento
O formato de cultura também determina como as células experimentam o estresse de cisalhamento. Células cultivadas em microcarregadores são particularmente vulneráveis. Se a mistura intensa ou colisões entre os carregadores causarem o desprendimento das células, essas células são efetivamente perdidas [4]. Por outro lado, culturas de suspensão de células de hibridoma demonstraram resiliência, mantendo a viabilidade em velocidades de agitação de até 1.500 RPM em biorreatores com defletores sem uma interface ar-líquido [4].
Diferentes sistemas de cultura lidam com cisalhamento de várias maneiras. Biorreatores de leito fixo minimizam o cisalhamento mantendo as células imobilizadas em superfícies estacionárias, enquanto leitos fluidizados introduzem cisalhamento moderado a alto através do movimento de microcarregadores e fluxo ascendente de fluido [2]. Alguns microcarregadores, especialmente os porosos, oferecem superfícies internas que podem proteger as células de forças extremas, proporcionando melhor proteção em comparação com microcarregadores sólidos [2]. Essas diferenças destacam a necessidade de equilibrar cuidadosamente a entrega de nutrientes com o risco de danos às células ao projetar biorreatores.
Limiares de Tensão de Cisalhamento para Diferentes Tipos de Células
Limiares de Tolerância à Tensão de Cisalhamento para Tipos de Células de Carne Cultivada
Gerenciar a tensão de cisalhamento é crítico para a produção de carne cultivada, pois o estresse desigual pode prejudicar células que não possuem paredes celulares fortes. Compreender os níveis específicos de estresse que cada tipo de célula pode tolerar ajuda a manter a saúde celular, desencadear respostas mecanossensíveis ou incentivar a diferenciação.
Valores de Limite para Tipos Comuns de Células
A tolerância à tensão de cisalhamento varia significativamente entre os tipos de células, e conhecer esses limites é fundamental para ajustar as configurações do biorreator.
Por exemplo, mioblastos de carne cultivada como a linha C2C12 prosperam sob baixa tensão de cisalhamento. O estresse cíclico de cerca de 1,68 mPa melhora a formação e fusão de miofibras [8] . Células-tronco derivadas de músculo de camundongo (MDSCs) mostram melhor diferenciação miogênica e formação de miotubos mais extensiva quando expostas a 16 mPa [8] . À medida que os mioblastos amadurecem em miotubos, eles podem lidar com níveis de estresse mais altos; o estresse pulsado entre 400 mPa e 1,400 mPa ativa vias que regulam o tamanho das fibras musculares, potencialmente levando à hipertrofia [8] .
Células-tronco mesenquimais (MSCs) também respondem de forma única. Por exemplo, MSCs caninas expostas a estresse de cisalhamento entre 100 mPa e 1,500 mPa regulam positivamente marcadores endoteliais como PECAM-1 e VE-caderina enquanto regulam negativamente marcadores de músculo liso [10] .
Tabela de Comparação de Limiares de Tensão de Cisalhamento
Aqui está uma rápida comparação dos limiares de tensão de cisalhamento entre diferentes tipos de células de carne cultivada:
| Tipo de Célula | Limiar de Tensão de Cisalhamento (mPa) | Efeitos Observados | Fonte |
|---|---|---|---|
| Células Mamíferas (Geral) | 300–1.700 | Faixa base; níveis acima disso podem levar a danos celulares ou apoptose | [1] |
| Mioblastos C2C12 (Adesos) | ~1.68 | Viabilidade melhorada e aumento na formação de miotubos | [8] |
| MDSCs de Camundongo (Adesão) | ~16 | Diferenciação aprimorada e formação extensiva de miotubos | [8] |
| Miotubos C2C12 (Adesão) | 400–1,400 | Ativação de vias que regulam o tamanho das fibras musculares (potencial hipertrofia) | [8] |
| MSCs Caninas | 100–1,500 | Regulação positiva de marcadores endoteliais, redução de marcadores de músculo liso | [10] |
| Sensores de Superfície Celular (Integrinas) | 100–1,000 | Ativação de canais iônicos mecanossensíveis e receptores | [1] |
Para contexto, agitar uma cultura a 100–200 rpm em um frasco padrão gera níveis de tensão de cisalhamento de 300–660 mPa, enquanto agitadores orbitais operando a 20–60 rpm produzem forças maiores variando de 600 mPa a 1.600 mPa [1]. Sistemas mais suaves, como biorreatores de balanço (±5° a 1 Hz), criam estresse de cerca de 90 mPa [9], e biorreatores clinostáticos operam em torno de 10 mPa, mantendo-se bem abaixo do limiar de ativação para sensores de superfície celular mecanossensíveis [1].
Esses limiares servem como um guia para ajustar as condições do biorreator, ajudando a manter ambientes ideais durante as fases de aumento de escala e crescimento celular.
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Como Reduzir Danos por Estresse de Cisalhamento
Minimizar danos por estresse de cisalhamento na produção de carne cultivada é tudo sobre alcançar um equilíbrio delicado. O objetivo é garantir uma mistura eficiente e entrega de oxigênio enquanto protege células sensíveis de danos mecânicos. Isso envolve uma combinação de design inteligente de biorreatores e estratégias operacionais cuidadosas.
Modificações no Design de Biorreatores
Usar modelagem CFD (Dinâmica de Fluidos Computacional) é um passo chave na otimização do desempenho de biorreatores. As técnicas modernas de CFD agora incluem simulações de fluxo multifásico, que consideram as interações entre células e microcarregadores. Isso resulta em avaliações mais precisas do estresse de cisalhamento e seu potencial dano [5].
O tipo de biorreator desempenha um papel importante na determinação dos níveis de estresse de cisalhamento. Embora os reatores de tanque agitado ainda sejam amplamente utilizados, designs alternativos podem oferecer condições mais suaves:
- Biorreatores de Airlift: Estes eliminam agitadores mecânicos, usando em vez disso a circulação induzida por gás para reduzir o cisalhamento mecânico [5].
- Biorreatores de onda ou oscilantes: Ao depender do movimento da superfície em vez de impulsores, são ideais para culturas de baixa a média densidade que requerem mistura suave [5].
- Biorreatores de roda vertical: Particularmente eficazes para culturas baseadas em agregados, têm mostrado sucesso em manter a viabilidade celular durante a expansão de agregados de iPSC humanos [11].
Outro fator importante é o comportamento não-Newtoniano das suspensões celulares. Por exemplo, suspensões contendo soro exibem propriedades de afinamento por cisalhamento, que os modelos tradicionais muitas vezes não conseguem capturar. Usar modelos avançados, como o modelo de Sisko, fornece previsões mais precisas do estresse de cisalhamento, ajudando a ajustar as forças mecânicas e evitar limites que possam alterar a expressão genética [6].
Métodos de Semeadura e Agitação de Células
Estratégias operacionais também desempenham um papel importante na redução de danos por estresse de cisalhamento. Por exemplo, agitação intermitente durante os estágios iniciais de fixação celular pode limitar a exposição ao cisalhamento enquanto ainda garante que os nutrientes sejam distribuídos de forma eficaz. Ajustar a agitação requer consideração cuidadosa de fatores como conteúdo de soro, densidade celular e a idade da cultura [6].
Ao determinar as velocidades de agitação, modelagem CFD pode ajudar a identificar o equilíbrio ideal - transferência suficiente de oxigênio sem causar danos mecânicos. Simulações compartimentadas podem refinar ainda mais a distribuição do estresse de cisalhamento, tornando o processo mais eficiente [5].
Impacto no Design e Escalonamento de Biorreatores
Ao escalar biorreatores para a produção de carne cultivada, compreender e aplicar os limites de tensão de cisalhamento é fundamental. Esses limites influenciam decisões sobre a velocidade do impulsor, design do dispersor e outros parâmetros para garantir a viabilidade celular à medida que os volumes de produção aumentam.
Definindo Parâmetros Operacionais do Biorreator
Os limites de tensão de cisalhamento desempenham um papel crucial na definição dos limites operacionais. Por exemplo, células-tronco hematopoiéticas (HSCs) têm um limite de aproximadamente 0.092 Pa[12]. Manter-se abaixo desse nível - como operar a 50 rpm, que gera cerca de 0.068 Pa - apoia a expansão saudável das células, alcançando um aumento de 27,4 vezes. No entanto, aumentar a agitação para 100 rpm eleva a tensão de cisalhamento para cerca de 0.192 Pa, resultando em uma taxa de apoptose de 72% e limitando a expansão para 24.5‐fold[12].
"O limite de tensão de cisalhamento para a proliferação e função de HSCs foi relatado como 0,092 Pa." – Hosseinizand et al. [12]
O dano por cisalhamento ocorre quando os redemoinhos turbulentos se tornam menores que cerca de dois terços do diâmetro de uma célula ou agregado[12][13]. A 50 rpm, os redemoinhos medem cerca de 280 µm, o que é seguro para as células. Mas a 100 rpm, os redemoinhos encolhem para 166 µm, aumentando o risco de dano mecânico.
A aeração introduz estresse hidrodinâmico adicional. Bolhas pequenas (1 mm de diâmetro) geram velocidades de fluido locais de cerca de 6,4 m/s durante a ruptura, enquanto bolhas maiores de 6 mm produzem picos mais suaves de 0,94 m/s[13]. Para combater isso, aditivos como Pluronic F68 são usados para evitar que as células grudem nas superfícies das bolhas.No entanto, sua eficácia depende da manutenção da concentração correta em relação à área de superfície do gás [13].
Esses parâmetros são essenciais ao transitar para sistemas de biorreatores maiores.
Manutenção das Condições Durante a Ampliação
A ampliação de um frasco spinner de 250 mL para um reator de tanque agitado de 20 m³ apresenta desafios únicos. As condições hidrodinâmicas em sistemas de pequena escala não se traduzem diretamente para volumes industriais. Mesmo operando grandes reatores em velocidades mínimas de agitação pode resultar em forças de cisalhamento fortes o suficiente para desprender células de microcarregadores[3].
"Mesmo quando operado a uma velocidade de agitação próxima ao Njs, o cisalhamento exercido apenas pelos impelidores poderia causar o desprendimento de células dos microcarregadores, enquanto ainda mais estresse hidrodinâmico é introduzido via sparging." – Zhang et al.[3]
Para manter condições de cisalhamento consistentes durante a ampliação, uma abordagem é manter constante a velocidade da ponta do impulsor. No entanto, isso pode levar a tempos de mistura mais longos e à formação de gradientes de nutrientes e oxigênio, o que pode afetar negativamente o crescimento e o desempenho das células[3]. A modelagem de Dinâmica de Fluidos Computacional (CFD) torna-se essencial para identificar zonas de estresse e otimizar o design do reator durante a ampliação[5].
Para linhagens celulares que são altamente sensíveis ao cisalhamento, designs de reatores alternativos são frequentemente mais adequados. Reatores de circulação de ar, que eliminam agitadores mecânicos, foram modelados com sucesso para volumes de até 300.000 L, alcançando densidades celulares teóricas de 2 × 10⁸ células/mL[7]. Da mesma forma, biorreatores de balanço utilizam movimentos de onda suave para minimizar o cisalhamento, tornando-os eficazes para trens de sementes de até 500 L[14][15]. Plataformas como
Resumo e Recomendações
Gerenciar efetivamente o estresse de cisalhamento é crucial para manter a viabilidade e produtividade celular na produção de carne cultivada. Pesquisas mostram que a ruptura de bolhas durante a aeração cria forças mais danosas do que a agitação mecânica. Por exemplo, pequenas bolhas (1 mm) geram velocidades de fluido de 6,4 m/s ao romper, enquanto bolhas maiores (6 mm) produzem picos mais suaves de 0,94 m/s [13]. Para minimizar essas forças, as equipes de compras devem se concentrar em biorreatores equipados com microspargers sinterizados (tamanho de poro de 15 μm), que permitem a aeração pulsada e reduzem a interface gás-líquido. Essas considerações são vitais para a ampliação dos sistemas de biorreatores.
Outro fator importante é a razão entre a escala de turbilhão e o diâmetro da célula (η/d_c), que pode ajudar a reduzir os danos causados pela agitação. Um estudo realizado em agosto de 2017 pelo Instituto de Engenharia de Bioprocessos e Tecnologia Farmacêutica destaca isso. Usando um biorreator de vidro Applikon de 3 L com células de inseto Sf21, eles mostraram que um impulsor Rushton de seis lâminas a 205 rpm, combinado com bolhas de 199 μm, produziu um rendimento de proteína GFP de 12,75 μg/mL. Em contraste, um impulsor de lâmina inclinada a 171 rpm, que gerou uma área de superfície de gás específica maior de 18,0 m²/m³, produziu apenas 4,0 μg/mL [13]. Isso demonstra que a área total da superfície do gás é mais influente do que a velocidade de agitação.
Agentes protetores, como o Pluronic F68 (0,5–3 g/L), podem formar uma camada protetora de 16–40 μm ao redor das bolhas, impedindo que as células se fixem [13]. No entanto, como Tobias Weidner e colegas observaram:
Se a área da superfície [total do gás] exceder um certo limite, a concentração de Pluronic não é mais suficiente para a proteção das células [13].
Isso significa que os engenheiros devem monitorar cuidadosamente a área da superfície do gás em relação à concentração de Pluronic F68 durante a ampliação para garantir que as células permaneçam protegidas.
Para linhagens celulares sensíveis, designs alternativos de reatores podem fornecer soluções. Reatores airlift, por exemplo, eliminam agitadores mecânicos, criando um ambiente de mistura mais suave [7]. Os biorreatores de leito fixo são outra opção, capazes de manter tensões de cisalhamento na parede ultra-baixas, variando de 10⁻³ a 10⁻² Pa [17]. Para equipes que exploram sistemas especializados de baixo cisalhamento, fornecedores como
Além disso, manter os mioblastos bovinos abaixo de 25 duplicações populacionais é essencial para preservar sua capacidade de diferenciação [16]. Exceder esse limite pode levar a uma diminuição no índice de fusão em aproximadamente 6,81% a cada passagem [16], reduzindo a capacidade das células de formar fibras musculares. Para resolver isso, engenheiros de processo devem utilizar modelagem de Dinâmica de Fluidos Computacional (CFD) para identificar zonas de alto cisalhamento antes de aumentar a escala de sistemas laboratoriais para industriais. Essa abordagem garante transições mais suaves e melhores resultados durante a ampliação.
Perguntas Frequentes
Como medir o estresse de cisalhamento no meu biorreator?
O estresse de cisalhamento em biorreatores é frequentemente avaliado usando técnicas de modelagem computacional como Dinâmica de Fluidos Computacional (CFD). Esses métodos permitem a análise de padrões de fluxo e a identificação de zonas de cisalhamento dentro do biorreator. Além disso, ferramentas de teste de cisalhamento em pequena escala são valiosas para caracterizar a sensibilidade de linhas celulares específicas e para avaliar várias condições de processo. Para monitoramento contínuo, o estresse de cisalhamento pode ser determinado calculando a velocidade e a viscosidade do fluido. Essa abordagem é particularmente eficaz em sistemas microfluídicos ou utilizando calculadoras de estresse de cisalhamento online.
Qual método de aeração minimiza os danos por ruptura de bolhas?
Minimizar os danos por ruptura de bolhas depende muito do uso de bolhas menores. Essas bolhas causam menos danos às células quando comparadas em uma base de volume para volume.Embora as técnicas exatas não sejam delineadas, gerenciar o tamanho e o comportamento das bolhas - como regular seu tamanho - desempenha um papel crucial na redução dos efeitos nocivos da ruptura.
O que devo manter constante ao aumentar a escala para reduzir o cisalhamento?
Ao aumentar o tamanho dos biorreatores de carne cultivada, é crucial manter a tensão de cisalhamento abaixo de cerca de 3 Pa para evitar danos às células. Preste muita atenção a fatores como agitação, padrões de fluxo, e aeração para garantir que os níveis de cisalhamento permaneçam consistentes durante toda a operação.
