El monitoreo de células vivas en biorreactores es crítico para la producción de carne cultivada. La escalabilidad requiere herramientas precisas para rastrear la salud y el crecimiento celular en tiempo real. Este artículo revisa métodos clave, incluyendo sensores de capacitancia, espectroscopía Raman y fluorescencia, destacando sus fortalezas y limitaciones para aplicaciones industriales.
Perspectivas Clave:
- Sensores de Capacitancia: Miden la densidad celular viable de manera continua. Efectivos para células adherentes pero sensibles a cambios en el tamaño celular.
- Espectroscopía Raman: Rastrea metabolitos como glucosa y lactato. Ideal para ambientes acuosos pero requiere calibración compleja.
- Fluorescencia: Monitorea la actividad metabólica a través de señales de NADH/NADPH. Rápido pero afectado por señales de fondo del medio.
Desafíos:
- Pruebas tradicionales como Trypan Blue son destructivas y lentas.
- Las altas densidades celulares y los medios complejos interfieren con los métodos ópticos.
- El ensuciamiento de los sensores y las necesidades de calibración limitan la eficiencia.
Elegir el método adecuado depende de los requisitos del proceso, la escala del biorreactor y las necesidades de esterilidad. Para operaciones a gran escala, combinar múltiples técnicas a menudo produce los mejores resultados.
Sensores Basados en Capacitancia para la Densidad Celular Viable
Cómo Funciona la Espectroscopía Dieléctrica
Los sensores de capacitancia, también conocidos como sensores de impedancia de radiofrecuencia, tratan a las células vivas como si fueran pequeños capacitores esféricos. Cuando se aplica un campo eléctrico a una suspensión de células, los iones en el medio de cultivo y dentro del citoplasma celular comienzan a moverse. Eventualmente, encuentran la membrana plasmática no conductora, causando polarización - una separación de cargas a través de la membrana [5][6].
Aquí está la clave: solo las células con membranas intactas pueden polarizarse. Las células muertas, que carecen de membranas intactas, no pueden atrapar iones y, por lo tanto, no contribuyen a la señal de capacitancia [5][7]. John Carvell, Director de Ventas y Marketing en Aber Instruments Ltd., lo explica bien:
"La impedancia de radiofrecuencia (RF)... se considera generalmente el método más robusto y confiable para monitorear las concentraciones de células vivas en cultivos celulares de mamíferos." [5]
La espectroscopía dieléctrica se basa en esto midiendo las propiedades dieléctricas (o permitividad) de la suspensión celular a través de varias frecuencias. Este proceso genera una curva de dispersión β, que ilustra cómo la capacidad de las células para polarizarse disminuye a medida que aumenta la frecuencia del campo eléctrico [6].Una lectura de frecuencia única a menudo refleja el biovolumen viable - el volumen total ocupado por células vivas - en lugar de solo el número de células. Las células más grandes naturalmente contribuyen más a la señal que las más pequeñas [5][6].
Estos principios forman la columna vertebral de la tecnología de sensores de capacitancia, convirtiéndola en una herramienta valiosa en los sistemas de biorreactores.
Uso de Sensores de Capacitancia en Biorreactores de Carne Cultivada
Los sensores de capacitancia son compatibles con sistemas de biorreactores de un solo uso y de uso múltiple. Para configuraciones de un solo uso, los discos de sensores desechables pueden soldarse en bolsas de película flexible o insertarse a través de puertos de tubo preinstalados [5][9]. En sistemas de acero inoxidable, las sondas reutilizables de 12 mm se conectan a través de puertos estériles [9].
Un ejemplo práctico proviene de la Universidad de Aquisgrán, donde los investigadores utilizaron el sistema BioPAT ViaMass en un biorreactor de un solo uso de 20 litros con movimiento oscilante para monitorear células CHO DG44. Lograron una fuerte correlación (coeficiente de regresión de 0.95) entre las lecturas de capacitancia y el volumen total de células [5]. De manera similar, Xpand Biotechnology en los Países Bajos empleó sensores de biomasa Aber en su sistema de expansión celular Scinus para rastrear células madre mesenquimales (MSCs) cultivadas en microportadores a una densidad de 60 g/L. Los sensores trazaron eficazmente los perfiles de crecimiento en volúmenes que van desde 150 mL hasta 1 litro, con resultados que se alinean estrechamente con las mediciones de referencia offline [5].
Para la producción de carne cultivada, los sensores de capacitancia brillan cuando trabajan con células adherentes en microportadores.A diferencia de los métodos ópticos, que pueden tener dificultades con los portadores sólidos, los sensores de capacitancia pueden penetrar estas estructuras. Esta capacidad los hace particularmente útiles para monitorear células dependientes de anclaje, una piedra angular de la fabricación de carne cultivada [8].
Fortalezas y Debilidades de los Sensores de Capacitancia
Los sensores de capacitancia ofrecen datos continuos y en tiempo real sin los riesgos de contaminación o retrasos asociados con el muestreo manual. Actualmente son las únicas herramientas en línea disponibles comercialmente para evaluar la viabilidad celular en bioprocesos industriales [7]. Mientras que los métodos tradicionales fuera de línea como los ensayos de azul de tripano tienen un error relativo de alrededor del 10%, el escaneo de frecuencia de capacitancia puede reducir este error a entre 5.5% y 11% [6].
Dicho esto, estos sensores tienen sus limitaciones.Las mediciones de frecuencia única no pueden diferenciar entre un aumento en el número de células y un aumento en el tamaño de las células. Por ejemplo, si las células crecen significativamente en diámetro durante una ejecución - ya sea debido al estrés o a la fase de muerte - la señal podría representar incorrectamente el conteo real de células a menos que se utilice un escaneo de multifrecuencia [6]. Además, los cambios en el medio de suspensión, como adiciones de alimento o diluciones, pueden causar "caídas" temporales en los datos que no reflejan cambios reales en la biomasa [5]. En biorreactores de movimiento oscilante, el sensor puede encontrar momentáneamente el espacio de cabeza gaseoso, requiriendo algoritmos de filtrado avanzados para evitar la interferencia de la señal [5].
Estos factores son cruciales al ajustar el monitoreo de células vivas para la producción de carne cultivada.
Métodos de Espectroscopía para el Análisis de Células Vivas
Espectroscopía Raman y NIR
La espectroscopía Raman utiliza la dispersión inelástica de la luz de un láser de 785 nm para generar una huella molecular, permitiendo la medición simultánea de metabolitos como glucosa, lactato, glutamina y amonio. Por otro lado, la espectroscopía NIR (800–2,500 nm) detecta absorciones ópticas de sobretonos y bandas de combinación [10][12][13][14]. La mínima sensibilidad de Raman al agua lo hace ideal para entornos acuosos como cultivos celulares, mientras que la alta sensibilidad al agua de NIR - debido a la fuerte señal de estiramiento O–H - puede oscurecer datos bioquímicos críticos [10][12][14].
En marzo de 2017, Lonza Biologics comparó NIR, Raman y fluorescencia 2D en biorreactores en miniatura de 15 mL (sistema ambr™). Encontraron que Raman era el más confiable para medir lactato y glucosa, mientras que NIR funcionó mejor para predecir los niveles de glutamina e iones de amonio [10][11].
En abril de 2022, investigadores de Sartorius Stedim Biotech integraron una celda de flujo Raman en línea en la corriente de cosecha sin células de un proceso de perfusión de células CHO. Usando un espectrómetro Raman HyperFluxPRO con un láser de 785 nm, lograron un control automático de retroalimentación de glucosa, manteniendo concentraciones de 4 g/L y 1.5 g/L con una variabilidad de ±0.4 g/L durante varios días [13]. J.Lemke de Sartorius Stedim Biotech señaló:
"Los resultados demuestran el alto potencial de la espectroscopía Raman para el monitoreo y control avanzado de procesos de un proceso de perfusión con un biorreactor y un método de medición independiente de la escala." [13]
En mayo de 2011, Bristol-Myers Squibb utilizó una sonda Raman en línea en biorreactores de 500 litros para monitorear múltiples parámetros, incluidos glutamina, glutamato, glucosa, lactato, amonio, densidad celular viable (VCD) y densidad celular total (TCD). Se recogieron espectros cada dos horas con un instrumento RamanRXN3 de Kaiser Optical Systems, demostrando la capacidad de Raman para rastrear aumentos de nutrientes y disminuciones de metabolitos durante las adiciones de alimentación en la fabricación a gran escala [14].
Mientras que la espectroscopía Raman y NIR ofrecen detalles químicos detallados, los métodos de fluorescencia y UV-Vis ofrecen perspectivas complementarias sobre el metabolismo celular y la biomasa.
Espectroscopía de Fluorescencia y UV-Vis
La espectroscopía UV-Vis mide la absorbancia o dispersión de la luz para estimar la biomasa total [16]. Este método sencillo y ampliamente utilizado, sin embargo, tiene dificultades para diferenciar entre células viables y muertas y se vuelve menos preciso a densidades celulares más altas [16].
La fluorometría, que es más sensible que UV-Vis, se centra en marcadores intracelulares específicos como NADH y NADPH, indicadores de actividad metabólica. La fluorometría in situ utiliza luz ultravioleta de 366 nm para excitar NADH/NADPH, que luego fluoresce alrededor de 460 nm [16].Veer Pramod Perwez explica:
"La única estrategia de monitoreo continuo desarrollada hasta ahora que proporciona información sobre el estado bioquímico o metabólico de la población celular es la fluorometría in situ." [16]
En la producción de carne cultivada, donde los datos en tiempo real son esenciales, la fluorescencia ofrece retroalimentación rápida sobre los cambios metabólicos, mientras que el UV-Vis ofrece una forma económica de estimar la biomasa. La fluorescencia puede rastrear cambios metabólicos y detectar el agotamiento del sustrato en tiempo real al monitorear los niveles de NADH. Por ejemplo, en un estudio, la fluorescencia 2D midió concentraciones de amonio con un RMSECV de 0.031 g/L, superando tanto a Raman como a NIR en configuraciones de biorreactores en miniatura [11]. Además, las plataformas microfluídicas automatizadas pueden combinar microscopía de campo claro (para medir la concentración total de células) con detección de fluorescencia usando yoduro de propidio, determinando la viabilidad celular en solo 10.3 minutos [15].
Comparación de Diferentes Métodos de Espectroscopía
Al comparar estas técnicas, cada una tiene fortalezas distintas para el monitoreo de biorreactores. Raman se destaca por su capacidad para predecir glucosa, lactato y títulos de anticuerpos, gracias a su huella molecular y baja interferencia del agua [10][11]. NIR, a pesar de su sensibilidad al agua, es más efectivo para monitorear glutamina y amonio [10][12]. La fluorescencia proporciona información detallada sobre la actividad metabólica y la viabilidad, mientras que UV-Vis sigue siendo una opción simple y rentable para estimar la biomasa total [16].
El análisis multivariante mejora la interpretación de espectros complejos, permitiendo el monitoreo simultáneo de múltiples analitos [10][13][14]. Para la producción de carne cultivada, la selección del método de espectroscopía adecuado depende de los metabolitos a monitorear, la escala del biorreactor y si se emplean sistemas de un solo uso o de uso múltiple. Estas técnicas colectivamente permiten un monitoreo preciso de células, siendo la compatibilidad de Raman con ambientes acuosos y sus capacidades multi-analito particularmente atractivas para operaciones a gran escala [13][14].
Cultivo de Células de Mamíferos - Raman como Medio de Monitoreo &y Control de Bioprocesos Upstream
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Métodos Avanzados para la Fisiología y Viabilidad Celular
Además de la espectroscopía, las técnicas de vanguardia ofrecen una comprensión más profunda de la fisiología y viabilidad celular.
FTIR para el Monitoreo de Viabilidad Celular y Apoptosis
La espectroscopía FTIR utiliza vibraciones moleculares en proteínas, lípidos y carbohidratos para detectar estrés nutricional y apoptosis temprana, ambos marcadores críticos de la disminución de la salud celular en biorreactores de carne cultivada.
Un enfoque, ATR-FTIR (Reflexión Total Atenuada), analiza la variabilidad espectral en regiones de alto número de onda para diferenciar entre células sanas y deficientes en nutrientes. En mayo de 2024, investigadores de Dxcover Ltd.empleó una plataforma ATR-FTIR equipada con elementos de reflexión interna desechables (IREs) para monitorear la salud de las células CHO. Utilizando el Análisis de Componentes Principales (PCA), distinguieron con éxito las células sanas de las deficientes en nutrientes en el espacio PC. La plataforma logró valores R² de salida múltiple impresionantes cercanos a 0.98 para glucosa y ácido láctico, ofreciendo información en tiempo real sobre la viabilidad celular [17]. Dado que la acumulación de ácido láctico puede llevar a la muerte celular, este monitoreo en tiempo real permite intervenciones oportunas para mantener la salud celular.
Los sistemas FTIR modernos están diseñados con IREs desechables o sondas sumergidas para una integración directa en entornos de biorreactores. Esta configuración no solo proporciona datos en tiempo real, sino que también reduce los riesgos de contaminación [17].Como se destaca en Frontiers in Bioengineering and Biotechnology:
"Las tecnologías basadas en espectroscopía son adecuadas como enfoques PAT ya que son no destructivas y requieren una preparación mínima de la muestra." [17]
Ampliando estas capacidades, el escaneo de capacitancia multifrecuencia aborda las limitaciones de los métodos de frecuencia única.
Escaneo de Capacitancia Multifrecuencia
Si bien los sensores de capacitancia de frecuencia única son útiles para medir el volumen celular viable (VCV), tienen dificultades para distinguir entre cambios en el tamaño y el conteo de células. Esta limitación se vuelve especialmente problemática durante la apoptosis, cuando los diámetros celulares a menudo aumentan [18].El escaneo de capacitancia multifrecuencia resuelve este problema midiendo la permitividad en un rango de 50–20,000 kHz, capturando la curva de dispersión β para evaluar con precisión las concentraciones de células viables independientemente de las variaciones de tamaño [18].
En octubre de 2019, investigadores de Sartorius Stedim Biotech utilizaron una sonda FUTURA pico de Aber Instruments para monitorear células DG44 CHO en biorreactores de 250 mL. Al aplicar el modelado de Mínimos Cuadrados Parciales Ortogonales (OPLS) a 25 frecuencias discretas, redujeron los errores de predicción de VCC a solo 5.5% a 11%, una mejora significativa sobre las tasas de error de 16% a 23% observadas con mediciones de frecuencia única [18]. El modelo rastreó efectivamente concentraciones de células superiores a 10 millones de células/mL e identificó rápidamente desviaciones causadas por cambios de dilución y alimentación, con márgenes de error de 6.7% a 13.2% [18].
La frecuencia característica (fC), que indica el punto donde la polarización celular está a medio completar, cambia según el tamaño de la célula y la polarizabilidad. Esto proporciona un marcador adicional para los cambios fisiológicos, particularmente durante la fase de muerte celular cuando la morfología experimenta transformaciones notables [18]. Como Analytical and Bioanalytical Chemistry explica:
"Las influencias de VCC y el diámetro celular en la señal de permitividad no son distinguibles con una medición de frecuencia." [18]
Comparación de Métodos Analíticos para el Monitoreo de Células Vivas
Comparación de Métodos Analíticos para el Monitoreo de Células Vivas en Biorreactores
Esta sección examina más de cerca los métodos analíticos clave utilizados para el monitoreo de células vivas en biorreactores de carne cultivada, basándose en las técnicas avanzadas discutidas previamente.
Seleccionar el mejor método implica equilibrar precisión, velocidad y practicidad. Cada técnica ofrece fortalezas distintas, ya sea rastreando la densidad celular viable, monitoreando la actividad metabólica o manteniendo la esterilidad en sistemas de un solo uso.
Sensores basados en capacitancia son actualmente la única opción en línea disponible comercialmente adaptada para el monitoreo de viabilidad [7].Estos sensores miden el volumen celular viable detectando la polarización de células con membranas intactas en un campo eléctrico alterno. Mientras que los sistemas de frecuencia única pueden tener dificultades con la precisión cuando los tamaños de las células varían, el escaneo multifrecuencia mejora significativamente la precisión, logrando márgenes de error del 5.5%–11% [18].
Métodos espectroscópicos - como la espectroscopía Raman, NIR y de fluorescencia - ofrecen una visión más completa de la actividad metabólica, rastreando múltiples parámetros junto con la biomasa. Estos métodos son no invasivos, lo que los hace ideales para biorreactores de un solo uso donde la esterilidad es crítica. Sin embargo, presentan desafíos: los sistemas espectroscópicos requieren una calibración extensa con modelos quimiométricos y a menudo implican costos iniciales más altos en comparación con las sondas de capacitancia.
La espectroscopía FTIR es particularmente efectiva para detectar signos tempranos de apoptosis y estrés nutricional a través del análisis de vibraciones moleculares. Sin embargo, su fuerte absorción de agua limita su utilidad para el monitoreo continuo en línea en ambientes acuosos [7]. En su lugar, FTIR funciona mejor como un método en línea, especialmente cuando se combina con análisis multivariado para el seguimiento en tiempo real de metabolitos.
Tabla de Comparación de Métodos Analíticos
| Método | Capacidad en Tiempo Real | Compatibilidad con Biorreactor | Necesidades de Calibración | Limitaciones Clave |
|---|---|---|---|---|
| Sensores de Capacitancia | Sí (En línea/En el lugar) | Alta (Agitado, Balanceo, SUBs) | Baja a Moderada | Sensible a burbujas de gas y cambios en el tamaño/morfología celular |
| Espectroscopía Raman | Sí (En línea) | Moderada (Requiere puerto de sonda) | Alta (Quimiometría) | Alto costo del equipo; interpretación de datos compleja |
| Espectroscopía NIR | Sí (En línea/En el lugar) | Alta | Alta (Multivariante) | Sensibilidad a la interferencia del agua y cambios en el medio |
| Fluorescencia | Sí (En línea) | Alta | Moderada | Fluorescencia de fondo del medio; fotoblanqueo |
| FTIR | Sí (En línea) | Moderada | Alta | La fuerte absorción de agua limita el uso en línea en medios acuosos |
Para la producción de carne cultivada, donde la precisión y la fiabilidad son innegociables, adaptar los métodos analíticos a los requisitos específicos del proceso es clave para lograr un rendimiento óptimo del biorreactor.Plataformas como
Conclusión y Recomendaciones
Seleccionar el método analítico adecuado implica equilibrar los requisitos del proceso con factores como la escala, el costo y las demandas regulatorias. Su elección dependerá de consideraciones clave como si sus células son adherentes o adaptadas a suspensión, con qué frecuencia se necesita monitoreo y cuánta invasividad se puede tolerar mientras se asegura que la esterilidad permanezca intacta [1]. Con las demandas sustanciales de células en la producción de carne cultivada [1], la precisión en el monitoreo es innegociable.
Factores Clave para Elegir Métodos Analíticos
El monitoreo en tiempo real debe ser una prioridad principal.Los sistemas en línea permiten la recolección de datos in situ sin retirar muestras, haciéndolos más eficientes y menos propensos a errores en comparación con los métodos fuera de línea, que son laboriosos y tienen riesgo de contaminación [3][1]. Para biorreactores a gran escala - hasta 2,000 litros o más - las técnicas no invasivas como la espectroscopía Raman o NIR son especialmente útiles. Estos métodos no requieren reactivos y pueden rastrear múltiples parámetros, como glucosa, lactato y aminoácidos, simultáneamente [1][3]. Esta capacidad multivariante no solo reduce los costos de monitoreo, sino que también mantiene el ambiente estéril y de grado alimenticio necesario para el cumplimiento normativo [19].
La sensibilidad y el rango dinámico son igualmente importantes al analizar medios biológicos complejos.Los ensayos basados en luminiscencia generalmente ofrecen una mayor sensibilidad que los métodos de fluorescencia o absorbancia [2]. Mientras tanto, las técnicas espectroscópicas avanzadas generan conjuntos de datos complejos que a menudo requieren herramientas de aprendizaje automático o quimiometría para un análisis adecuado [3][1]. Para una solución más sencilla, los sensores basados en capacitancia son efectivos para monitorear la viabilidad celular.
La escalabilidad y el cumplimiento normativo son esenciales para la producción comercial. Los sensores en estos entornos deben soportar la esterilización a alta temperatura, minimizar la lixiviación y operar durante períodos prolongados sin necesidad de recalibración. Los sistemas de seguimiento automatizados basados en imágenes también pueden proporcionar documentación con marcas de tiempo y lista para auditorías, lo cual es crucial para las presentaciones regulatorias a organismos como la FDA y la EMA [4].Estos requisitos destacan la importancia de obtener el equipo adecuado de proveedores especializados.
Optimización de la Adquisición de Equipos con Cellbase
Dadas las complejidades técnicas y regulatorias, encontrar el equipo analítico adecuado es fundamental. Las plataformas de laboratorio generales a menudo carecen de la experiencia adaptada a la industria de la carne cultivada.
Preguntas Frecuentes
¿Cuáles son los beneficios de usar sensores de capacitancia en biorreactores para la producción de carne cultivada?
Los sensores de capacitancia proporcionan una forma en tiempo real y no intrusiva de medir la biomasa celular viable en biorreactores. Ofrecen datos precisos y confiables sin interrumpir el proceso, lo que los convierte en una e
Estos sensores funcionan sin problemas en sistemas de todos los tamaños, desde configuraciones a pequeña escala hasta grandes biorreactores industriales de un solo uso. Esta flexibilidad mejora la gestión de procesos, minimiza la dependencia de muestreos fuera de línea y agiliza los flujos de trabajo de producción.Al ofrecer información detallada sobre la actividad celular, los sensores de capacitancia desempeñan un papel clave en el perfeccionamiento de los bioprocesos, particularmente para la producción de carne cultivada.
¿Cuáles son las ventajas de la espectroscopía Raman para monitorear metabolitos celulares en biorreactores?
La espectroscopía Raman permite el seguimiento en tiempo real y no invasivo de metabolitos celulares cruciales directamente dentro de los biorreactores. Este enfoque elimina la necesidad de retirar muestras, reduciendo significativamente el riesgo de contaminación. Puede medir simultáneamente una gama de compuestos, como glucosa, lactato, amonio y títulos de productos, lo que lo convierte en una herramienta eficiente para procesos prolongados como las corridas de perfusión.
En comparación con otros métodos, la espectroscopía Raman a menudo ofrece mayor precisión para metabolitos clave como la glucosa y el lactato. Incluso puede superar a técnicas como el infrarrojo cercano (NIR) y la fluorescencia 2D bajo ciertas condiciones.A diferencia de los métodos tradicionales fuera de línea, como HPLC o ensayos colorimétricos, la espectroscopía Raman funciona de manera continua, reduciendo el tiempo y el uso de recursos mientras preserva la integridad del cultivo celular.
En la producción de carne cultivada, la espectroscopía Raman se destaca por su compatibilidad con biorreactores compactos y su capacidad para proporcionar mediciones confiables y sin necesidad de calibración. Para aquellos que necesitan herramientas de monitoreo basadas en Raman,
¿Cuáles son los desafíos de usar métodos ópticos en biorreactores con altas densidades celulares?
En entornos con alta densidad celular, los métodos ópticos enfrentan desafíos como dispersión de luz aumentada y turbidez del medio, lo que puede sesgar las mediciones.Añadiendo a la complejidad, la acumulación de desechos celulares puede debilitar las señales y causar respuestas no lineales, haciendo que las lecturas precisas sean aún más difíciles de lograr.
Estos problemas son particularmente problemáticos en biorreactores, donde las condiciones están cambiando constantemente y son intrincadas. Para abordar estas limitaciones y mantener un monitoreo confiable, pueden ser necesarias técnicas analíticas más sofisticadas.
