전단 응력은 배양육 생산의 성패를 좌우할 수 있습니다. 왜냐하면 사용되는 세포는 보호벽이 없어, 생물 반응기에서 유체 힘에 의해 손상되기 쉽기 때문입니다. 이 기사는 전단 응력이 이러한 세포에 미치는 영향, 세포가 견딜 수 있는 한계, 그리고 세포를 보호하는 시스템을 설계하는 방법에 대해 다룹니다.
주요 요점:
- 전단 응력은 유체의 움직임에서 발생하며, 동물의 연약한 세포에 해를 끼쳐 막 손상, 분리 또는 사망을 초래할 수 있습니다.
- 대부분의 포유류 세포는 0.3–1.7 파스칼, 을 견디지만, 더 낮은 수준에서도 스트레스 반응을 유발할 수 있습니다.
- 임펠러 유형, 공기 공급 방법, 생물 반응기 형상과 같은 설계 선택은 전단력에 직접적인 영향을 미칩니다.
- 손상을 최소화하기 위한 전략으로는 부드러운 생물 반응기 설계(e.g. , 공기 리프트 또는 흔들림 시스템), 최적의 교반 속도 조정, Pluronic F68. 과 같은 보호제를 추가하는 것이 포함됩니다.
배양육의 경우, 세포가 손상 없이 성장하고 분화할 수 있도록 이 균형을 관리하는 것이 중요하며, 특히 생산이 확대됨에 따라 더욱 그렇습니다. 이러한 임계값 뒤에 숨겨진 과학과 바이오리액터 설계를 위한 실질적인 해결책을 탐구해 봅시다.
110: 지구처럼 회전하기: Olivier De와 함께 저전단 바이오리액터 설계로 더 나은 세포 배양하기
바이오리액터에서 전단 응력에 영향을 미치는 요소
바이오리액터에서 전단 응력에 영향을 미치는 요소를 이해하는 것은 조건을 최적화하는 데 중요하며, 특히 섬세한 세포가 관련된 경우 더욱 그렇습니다. 그 강도와 분포를 형성하는 주요 요소를 살펴보겠습니다.
바이오리액터 설계 및 운영 조건
바이오리액터의 설계는 전단 응력이 발생하는 위치와 방식을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 한 가지 주요 요소는 임펠러의 유형입니다.예를 들어, 러스턴 터빈은 용기의 평균보다 최대 280배 높은 에너지 소산율을 생성할 수 있으며, HE3와 같은 고효율 축류 임펠러는 평균 소산율의 약 180배에 가까운 비율을 생성합니다. [4]. 임펠러 직경, 속도 및 위치와 같은 다른 설계 요소도 에너지 분포에 영향을 미칩니다.
흥미롭게도, 공기 주입은 교반보다 훨씬 더 강한 힘을 도입합니다. 작은 기포(1–2 mm)가 터질 때, 10⁷–10⁹ W/m³의 에너지 수준을 방출하여 단일 사건에서 1,000개 이상의 세포를 죽일 수 있습니다.[4]. 이로 인해 기포의 행동은 특히 배양육 생산에서 중요한 고려 사항이 됩니다.
배플은 또 다른 주요 설계 요소입니다. 배플은 배양액에서 소용돌이 형성을 방지하여 그렇지 않으면 기포를 액체로 끌어들여 표면에서 파열 사건을 증가시킬 수 있습니다.[4]. 또한, 임펠러와 용기의 직경 비율 및 임펠러의 바닥으로부터의 높이는 생물반응기 내에서 에너지가 퍼지는 방식에 영향을 미칩니다.
전단 응력의 불균등 분포
전단 응력은 생물반응기 전체에 고르게 분포되지 않습니다. 연구에 따르면 에너지 소산은 임펠러 배출 영역, 후류 소용돌이, 거품이 터지는 액체 표면과 같은 특정 영역에 집중되는 경향이 있습니다. 이러한 핫스팟은 규모 확장 시 도전 과제가 될 수 있습니다.
Biogen Idec의 Weiwei Hu는 이 확장 문제를 강조합니다:
'전단 민감성'에 대한 인식은 역사적으로 생물반응기 운영에서 교반 및 공기 공급에 임의의 상한선을 설정했지만, 세포 밀도와 생산성이 계속 증가함에 따라 질량 전달 요구 사항이 이러한 임의의 낮은 한계에 의해 부과된 것을 초과할 수 있습니다 [4].
예를 들어, 장쑤 대학의 Junxuan Zhang과 Xueliang Li가 2021년에 수행한 연구에서는 250 mL 스피너 플라스크와 20 m³ 교반 탱크 반응기를 전산 유체 역학을 사용하여 비교했습니다. 그들은 가장 낮은 교반 속도에서도 큰 반응기에서의 전단력이 미세 운반체에서 세포를 분리할 만큼 강하다는 것을 관찰했으며, 스파징이 교반보다 더 많은 스트레스를 유발한다고 보고했습니다 [3] .
배양 형식과 전단 민감성
배양 형식은 세포가 전단 스트레스를 경험하는 방식을 결정합니다. 미세 운반체에서 자란 세포는 특히 취약합니다. 강한 혼합이나 운반체 간의 충돌로 인해 세포가 분리되면, 그 세포는 사실상 손실됩니다 [4] . 반면, 하이브리도마 세포의 현탁 배양은 공기-액체 계면이 없는 배플드 바이오리액터에서 최대 1,500 RPM의 교반 속도에서도 생존력을 유지하는 회복력을 보여주었습니다 [4].
다양한 배양 시스템은 전단을 다양한 방식으로 처리합니다. 고정층 바이오리액터는 세포를 고정된 표면에 고정시켜 전단을 최소화하는 반면, 유동층은 미세 운반체의 움직임과 상향 유체 흐름을 통해 중간에서 높은 전단을 도입합니다 [2]. 특히 다공성인 일부 미세 운반체는 극한의 힘으로부터 세포를 보호할 수 있는 내부 표면을 제공하여 고체 미세 운반체에 비해 더 나은 보호를 제공합니다 [2]. 이러한 차이점은 바이오리액터 설계 시 영양소 전달과 세포 손상의 위험을 신중하게 균형을 맞출 필요성을 강조합니다.
다양한 세포 유형에 대한 전단 응력 임계값
배양육 세포 유형에 대한 전단 응력 내성 임계값
배양육 생산에서 전단 응력 관리가 중요합니다. 불균일한 응력은 강한 세포벽이 없는 세포에 해를 끼칠 수 있습니다. 각 세포 유형이 견딜 수 있는 특정 응력 수준을 이해하면 세포 건강을 유지하고, 기계적 감응 반응을 유도하거나 분화를 촉진하는 데 도움이 됩니다.
일반적인 세포 유형에 대한 임계값
전단 응력 내성은 세포 유형에 따라 크게 다르며, 이러한 임계값을 아는 것은 바이오리액터 설정을 미세 조정하는 데 중요합니다.
예를 들어, 배양육 근모세포인 C2C12 라인은 낮은 전단 응력에서 잘 자랍니다. 약 1.68 mPa의 주기적 응력은 근관 형성과 융합을 개선합니다 [8] . 마우스 근육 유래 줄기 세포(MDSCs)는 16 mPa에 노출되었을 때 더 나은 근육 분화와 더 광범위한 근육관 형성을 보여줍니다[8] . 근원세포가 근육관으로 성숙함에 따라 더 높은 스트레스 수준을 처리할 수 있으며, 400 mPa와 1,400 mPa 사이의 펄스 스트레스는 근섬유 크기를 조절하는 경로를 활성화하여 잠재적으로 비대화를 초래할 수 있습니다 [8] .
중간엽 줄기 세포(MSCs)도 독특하게 반응합니다. 예를 들어, 100 mPa와 1,500 mPa 사이의 전단 응력에 노출된 개의 MSCs는 PECAM-1 및 VE-cadherin과 같은 내피 세포 마커를 상향 조절하고 평활근 마커를 하향 조절합니다 [10] .
전단 응력 임계값 비교표
다양한 배양육 세포 유형 간의 전단 응력 임계값을 빠르게 비교해 보세요:
| 세포 유형 | 전단 응력 임계값 (mPa) | 관찰된 효과 | 출처 |
|---|---|---|---|
| 포유류 세포 (일반) | 300–1,700 | 기본 범위; 이 수준을 초과하면 세포 손상 또는 세포 자멸사가 발생할 수 있음 | [1] |
| C2C12 근모세포 (부착성) | ~1.68 | 개선된 생존력 및 증가된 근관 형성 | [8] |
| 마우스 MDSCs (부착성) | ~16 | 향상된 분화 및 광범위한 근관 형성 | [8] |
| C2C12 근관 (부착성) | 400–1,400 | 근섬유 크기를 조절하는 경로의 활성화 (잠재적 비대) | [8] |
| 개 MSCs | 100–1,500 | 내피 세포 마커의 상향 조절, 평활근 마커의 감소 | [10] |
| 세포 표면 센서 (인테그린) | 100–1,000 | 기계 감지 이온 채널 및 수용체의 활성화 | [1] |
참고로, 표준 플라스크에서 100–200 rpm으로 배양을 저어주면 300–660 mPa, 의 전단 응력이 발생하며, 궤도 셰이커가 20–60 rpm으로 작동할 때는 600 mPa에서 1,600 mPa [1] . 의 더 높은 힘을 생성합니다.Gentler systems like rocking bioreactors (±5° at 1 Hz) create stress of about 90 mPa [9], and clinostat bioreactors operate at around 10 mPa , staying well below the activation threshold for mechanosensitive cell surface sensors [1].
이러한 임계값은 배양기 조건을 조정하는 가이드 역할을 하여, 규모 확장 및 세포 성장 단계 동안 최적의 환경을 유지하는 데 도움을 줍니다.
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전단 응력 손상을 줄이는 방법
배양육 생산에서 전단 응력 손상을 최소화하는 것은 섬세한 균형을 이루는 것입니다. 목표는 효율적인 혼합 및 산소 전달을 보장하면서 민감한 세포를 기계적 손상으로부터 보호하는 것입니다. 이는 스마트한 배양기 설계와 신중한 운영 전략의 조합을 포함합니다.
바이오리액터 설계 수정
CFD (전산 유체 역학) 모델링은 바이오리액터 성능 최적화의 핵심 단계입니다. 현대의 CFD 기술은 이제 다상 흐름 시뮬레이션을 포함하여 세포와 마이크로캐리어 간의 상호작용을 고려합니다. 이는 전단 응력과 그로 인한 잠재적 손상의 보다 정확한 평가를 가능하게 합니다[5].
바이오리액터의 유형은 전단 응력 수준을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 교반 탱크 반응기는 여전히 널리 사용되고 있지만, 대안 설계는 더 부드러운 조건을 제공할 수 있습니다:
- 에어리프트 바이오리액터: 이들은 기계적 교반기를 제거하고, 대신 가스 유도 순환을 사용하여 기계적 전단을 줄입니다 [5].
- 웨이브 또는 록킹 바이오리액터: 임펠러 대신 표면 운동에 의존하여 부드러운 혼합이 필요한 저밀도에서 중밀도 배양에 이상적입니다 [5].
- 수직 휠 바이오리액터: 특히 집합체 기반 배양에 효과적이며, 인간 iPSC 집합체의 확장 중 세포 생존율을 유지하는 데 성공을 보였습니다 [11].
또 다른 중요한 요소는 세포 현탁액의 비뉴턴적 행동입니다. 예를 들어, 혈청을 포함한 현탁액은 전단 박화 특성을 나타내며, 이는 전통적인 모델이 종종 포착하지 못합니다. Sisko 모델과 같은 고급 모델을 사용하면 전단 응력의 보다 정확한 예측을 제공하여 기계적 힘을 미세 조정하고 유전자 발현을 변경할 수 있는 임계값을 피하는 데 도움이 됩니다 [6].
세포 접종 및 교반 방법
운영 전략도 전단 응력 손상을 줄이는 데 큰 역할을 합니다. 예를 들어, 초기 세포 부착 단계에서 간헐적 교반은 영양소가 효과적으로 분배되도록 하면서 전단 노출을 제한할 수 있습니다. 교반을 조정할 때는 혈청 함량, 세포 밀도, 배양의 연령과 같은 요소를 신중하게 고려해야 합니다 [6].
교반 속도를 결정할 때, CFD 모델링 은 기계적 손상을 일으키지 않으면서 충분한 산소 전달을 위한 이상적인 균형을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구획화된 시뮬레이션은 전단 응력 분포를 더욱 정밀하게 조정하여 프로세스를 더 효율적으로 만듭니다 [5].
생물반응기 설계 및 규모 확장에 미치는 영향
배양육 생산을 위한 생물반응기를 규모 확장할 때, 전단 응력 임계값을 이해하고 적용하는 것이 중요합니다. 이러한 임계값은 임펠러 속도, 스파저 설계 및 기타 매개변수에 대한 결정을 내리는 데 영향을 미쳐 생산량이 증가함에 따라 세포의 생존 가능성을 보장합니다.
생물반응기 운영 매개변수 설정
전단 응력 임계값은 운영 한계를 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 예를 들어, 조혈모세포(HSCs)의 임계값은 약 0.092 Pa[12]. 이 수준 이하로 유지하는 것 - 약 0.068 Pa를 생성하는 50 rpm에서 운영하는 것과 같은 - 은 건강한 세포 확장을 지원하여 27.4배 증가. 를 달성합니다. 그러나 교반을 100 rpm으로 올리면 전단 응력이 약 0.192 Pa로 증가하여 72%의 세포자멸사율을 초래하고 확장을 24로 제한합니다.5‐fold[12].
"HSCs의 증식과 기능에 대한 임계 전단 응력은 0.092 Pa로 보고되었습니다." – Hosseinizand et al. [12]
전단 손상은 난류 소용돌이가 세포 또는 집합체의 직경의 약 3분의 2보다 작아질 때 발생합니다[12][13]. 50 rpm에서는 소용돌이가 약 280 µm로 측정되어 세포에 안전합니다. 그러나 100 rpm에서는 소용돌이가 166 µm로 줄어들어 기계적 손상의 위험이 증가합니다.
스파징은 추가적인 유체역학적 스트레스를 도입합니다. 작은 거품(직경 1 mm)은 파열 시 약 6.4 m/s의 국부 유체 속도를 생성하며, 더 큰 6 mm 거품은 0.94 m/s의 부드러운 피크를 생성합니다.[13]. 이를 상쇄하기 위해 Pluronic F68과 같은 첨가제가 사용되어 세포가 거품 표면에 달라붙는 것을 방지합니다.그러나, 그들의 효과는 가스 표면적에 대한 적절한 농도를 유지하는 것에 달려 있습니다[13] .
이러한 매개변수는 더 큰 생물반응기 시스템으로 전환할 때 필수적입니다.
확대 과정에서 조건 유지
250 mL 스피너 플라스크에서 20 m³ 교반 탱크 반응기로 확대하는 것은 독특한 도전을 제시합니다. 소규모 시스템의 유체역학적 조건은 산업적 규모로 직접 변환되지 않습니다. 큰 반응기를 최소 교반 속도로 작동하더라도 미세운반체에서 세포를 분리할 만큼 강한 전단력이 발생할 수 있습니다[3].
"Njs에 가까운 교반 속도로 작동하더라도, 임펠러에 의해 가해지는 전단력만으로도 미세운반체에서 세포가 분리될 수 있으며, 스파징을 통해 더 많은 유체역학적 스트레스가 추가됩니다." – Zhang et al.[3]
스케일 업 중 일관된 전단 조건을 유지하기 위해 한 가지 접근 방식은 임펠러 팁 속도를 일정하게 유지하는 것입니다. 그러나 이는 혼합 시간을 길게 하고 영양소 및 산소 구배를 형성하여 세포 성장과 성능에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다[3]. 스케일 업 중 스트레스 영역을 식별하고 반응기 설계를 최적화하기 위해 전산 유체 역학(CFD) 모델링이 필수적입니다[5].
전단에 매우 민감한 세포주에는 대체 반응기 설계가 더 적합한 경우가 많습니다. 기계적 교반기를 제거한 에어리프트 반응기는 최대 300,000 L의 부피로 성공적으로 모델링되었으며, 이론적인 세포 밀도 2 × 10⁸ cells/mL[7]. 유사하게, 흔들림 생물반응기는 부드러운 파동 운동을 사용하여 전단을 최소화하며, 최대 500 L의 시드 트레인에 효과적입니다[14][15].
요약 및 권장 사항
전단 응력을 효과적으로 관리하는 것은 배양육 생산에서 세포 생존력과 생산성을 유지하는 데 중요합니다. 연구에 따르면, 기포 파열은 기계적 교반보다 더 많은 손상력을 생성합니다. 예를 들어, 작은 기포(1 mm)는 파열 시 6.4 m/s의 유체 속도를 생성하는 반면, 큰 기포(6 mm)는 0.94 m/s의 부드러운 피크를 생성합니다 [13] . 이러한 힘을 최소화하기 위해 조달 팀은 맥동 공기 공급을 허용하고 가스-액체 계면을 줄이는 소결 미세 스파저(15-μm 기공 크기)가 장착된 바이오리액터에 집중해야 합니다. 이러한 고려 사항은 바이오리액터 시스템을 확장하는 데 필수적입니다.
또 다른 중요한 요소는 소용돌이 규모와 세포 직경의 비율(η/d_c)로, 이는 교반으로 인한 손상을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 2017년 8월에 생물공정공학 및 제약기술 연구소에서 수행한 연구가 이를 강조합니다. Sf21 곤충 세포를 사용한 3-L Applikon 유리 바이오리액터에서 205 rpm의 6-블레이드 러쉬튼 임펠러와 199 μm 기포를 결합하여 GFP 단백질 수율이 12.75 μg/mL로 나타났습니다. 반면, 171 rpm의 피치 블레이드 임펠러는 18.0 m²/m³의 더 높은 특정 가스 표면적을 생성하여 단지 4.0 μg/mL의 수율을 보였습니다 [13]. 이것은 총 가스 표면적이 교반 속도보다 더 영향력이 있음을 보여줍니다.
Pluronic F68 (0.5–3 g/L)와 같은 보호제는 거품 주위에 16–40 μm의 보호층을 형성하여 세포가 부착되는 것을 방지할 수 있습니다 [13] . 그러나 Tobias Weidner와 동료들이 관찰한 바에 따르면:
[총 가스] 표면적이 특정 임계값을 초과하면 Pluronic의 농도가 더 이상 세포 보호에 충분하지 않습니다 [13].
이는 엔지니어들이 세포가 보호되도록 하기 위해 스케일업 과정에서 Pluronic F68 농도와 관련하여 가스 표면적을 주의 깊게 모니터링해야 함을 의미합니다.
민감한 세포주에 대해서는 대체 반응기 설계가 해결책을 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 에어리프트 반응기는 기계적 교반기를 제거하여 더 부드러운 혼합 환경을 만듭니다 [7]. 고정층 생물반응기는 또 다른 옵션으로, 10⁻³에서 10⁻² Pa 범위의 초저벽 전단 응력을 유지할 수 있습니다 [17]. 특수 저전단 시스템을 탐색하는 팀에게는
또한, 소 근육모세포를 25회 이하의 세포 분열로 유지하는 것이 그들의 분화 능력을 보존하는 데 필수적입니다 [16]. 이 임계값을 초과하면 각 세대마다 융합 지수가 약 6.81% 감소하여 [16] , 세포의 근섬유 형성 능력이 감소할 수 있습니다. 이를 해결하기 위해 공정 엔지니어는 실험실에서 산업 시스템으로 확장하기 전에 고전단 영역을 식별하기 위해 전산유체역학(CFD) 모델링을 활용해야 합니다. 이 접근 방식은 확장 중에 더 원활한 전환과 더 나은 결과를 보장합니다.
자주 묻는 질문
내 생물반응기에서 전단 응력을 어떻게 측정하나요?
생물반응기에서의 전단 응력은 종종 전산 유체 역학(CFD)과 같은 전산 모델링 기법을 사용하여 평가됩니다. 이러한 방법은 흐름 패턴을 분석하고 생물반응기 내 전단 영역을 식별하는 데 도움이 됩니다. 또한, 소규모 전단 테스트 도구는 특정 세포주가 얼마나 민감한지 특성화하고 다양한 공정 조건을 평가하는 데 유용합니다. 지속적인 모니터링을 위해, 전단 응력은 유체 속도와 점도를 계산하여 결정할 수 있습니다. 이 접근법은 특히 미세 유체 시스템에서 효과적이며 온라인 전단 응력 계산기를 활용하여 사용할 수 있습니다.
어떤 공기 공급 방법이 기포 파열 손상을 최소화하나요?
기포 파열 손상을 최소화하려면 작은 기포를 사용하는 것이 중요합니다. 이러한 기포는 부피 대 부피 기준으로 비교할 때 세포 손상을 덜 유발합니다.비록 정확한 기술이 명시되어 있지 않지만, 거품의 크기와 행동을 관리하는 것 - 예를 들어 크기를 조절하는 것 - 은 파열의 유해한 영향을 줄이는 데 중요한 역할을 합니다.
전단을 줄이기 위해 확장할 때 무엇을 일정하게 유지해야 합니까?
배양육 바이오리액터의 크기를 늘릴 때, 세포에 해를 끼치지 않도록 전단 응력을 약 3 Pa 이하로 유지하는 것이 중요합니다. 교반, 유동 패턴, 및 공기 주입과 같은 요소에 주의를 기울여 운영 전반에 걸쳐 전단 수준이 일관되게 유지되도록 하십시오.
