청소 검증은 오염을 방지하고 제품 안전을 보장하기 위해 배양육 생산에서 중요합니다. 알아야 할 사항은 다음과 같습니다:
- 규제 기준: 청소 과정은 미생물을 99% 제거해야 하며, 이후 소독 또는 멸균을 통해 99.999% 감소를 달성해야 합니다.
- 잔류물 문제: 바이오리액터는 단백질, 지방, 세포 잔해를 축적하여 정밀한 청소 방법이 필요합니다. 일회용 시스템은 탄화수소 및 실록산과 같은 위험을 추가합니다.
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잔류물 검출을 위한 주요 도구:
- HPLC: 특정 잔류물을 감지하지만 미량 오염물에 대한 민감도 제한이 있습니다.
- LC-MS/MS: 매우 민감하여 ng/mL 수준을 감지하며, 미량 분석에 이상적입니다.
- TOC 분석: 모든 유기 잔류물을 빠르게 측정(ppb 민감도)하지만 특이성이 부족합니다.
- 미생물 검출: 전통적인 무균 시험은 느립니다 (5–7일). ATP 발광 및 실시간 PCR과 같은 신속한 방법은 더 빠른 결과를 제공하여 배치 출시 일정을 개선합니다.
- 디지털 모니터링: UV 분광법 및 AI 기반 분석과 같은 실시간 도구는 세척 주기를 최적화하고, 가동 중단 시간을 줄이며, 효율성을 향상시킵니다.
세척 공정을 검증하기 위한 새로운 분석 방법
잔류물 검출 도구
배양육 생산에서, 바이오리액터 세척은 세심한 과정입니다. 단백질, 지방, 세포 잔해 및 배양 매체 성분과 같은 잔류물은 교차 오염을 피하기 위해 완전히 제거되어야 합니다. HPLC, LC-MS/MS 및 TOC 분석과 같은 도구는 철저한 잔류물 검출을 보장하는 데 각각 역할을 하며, 정량적 및 정성적 통찰력을 제공합니다.
고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)
HPLC는 바이오리액터에서 잔류물을 측정하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 자외선(UV) 검출과 결합하면 액체 샘플의 구성 요소를 분리하고 식별하는 데 도움이 됩니다. 이는 특정 성장 배지 성분이나 세정제와 같은 안정적인 잔류물을 정량화하는 데 특히 유용합니다. 그러나 한계가 있습니다. 예를 들어, HPLC-UV는 흡착 손실에 취약하거나 UV 감도가 낮은 고효능 펩타이드를 포함하는 응용 분야에서 미량 잔류물을 감지하기에 충분히 민감하지 않을 수 있습니다 [3].
일반적으로 HPLC-UV는 µg/mL 범위의 검출 한계를 달성하며, 이는 미세한 오염을 모니터링하기에는 충분하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 특정 잔류물의 제거를 감지하고 검증하는 데 있어 신뢰성이 높아 배양육 공정에서 제품 안전성을 보장하는 데 필수적인 방법으로 사용됩니다 [3].
질량 분석 기술
LC-MS/MS는 향상된 민감도와 특이성으로 잔류물 검출을 한 단계 끌어올립니다. 이 방법은 다양한 펩타이드를 분석할 수 있으며, 한 번의 실행으로 1–1,000 ng/mL의 양을 검출할 수 있습니다. 다중 반응 모니터링 조각을 사용하여 잔류물의 정체성을 정확하게 확인합니다. Waters Corporation:
에 의해 언급된 바와 같이고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 자외선(UV) 검출이 결합된 방법이 ARL 결정에 가장 일반적인 분석 도구이지만, 더 민감하고 선택적인 검출을 달성할 수 있는 분석 방법론에 대한 필요성이 증가하고 있습니다 [3].
LC-MS/MS는 특히 단일 사용 바이오리액터 구성 요소에서 미량 잔류물, 분해된 단백질 및 추출물을 식별하는 데 효과적입니다. 분석가들은 비특이적 결합을 최소화하고 회수율을 개선하기 위해 고성능 표면 바이알에 자주 의존합니다. 극히 낮은 수준(ng/mL)에서 잔류물을 감지할 수 있는 능력은 생물반응기 표면에서 고효능 성분의 제거를 확인하는 데 필수적입니다 [3].
총 유기 탄소(TOC) 분석
TOC 분석은 잔류물을 CO₂로 산화시키고 전도도의 변화를 모니터링하여 총 유기 탄소를 측정합니다. 이 방법은 비특이적이어서 단백질, 세포, 세정제, 배지 성분 등 모든 유기 잔류물을 감지합니다. 감지 한계가 6.30 ppb로 낮고 정량 한계가 약 21 ppb로 민감도가 인상적입니다 [4][5].
쿠바 하바나에 있는 유전공학 및 생명공학 센터의 연구는 TOC 분석의 효과를 입증했습니다.연구자들은 잔류물 수준을 세 단계 감소시켜 최종 TOC 값을 22 ppb까지 낮췄습니다. 또한 TOC 측정값과 미생물 부하 사이의 연관성을 확립했습니다: 예를 들어, 27 ppb의 TOC는 약 10⁶ E. coli 세포와 상관관계가 있으며, 16 ppb는 대략 10³ 효모 세포와 상관관계가 있습니다 [4] .
TOC 분석기는 Clean-In-Place 시스템에 특히 적합하며, 장비의 전환 시간을 단축하기 위해 라인 내 또는 라인 상에서 도구로 사용할 수 있습니다 [5]. 유럽 위원회의 부속서 15는 특정 잔류물 테스트가 불가능할 때 TOC와 같은 비특이적 방법의 사용을 지원하며, 다음과 같이 명시하고 있습니다:
생물학적 제제는 pH 극단 및/또는 열에 노출될 때 분해되고 변성되는 것으로 알려져 있으며... 특정 제품 잔류물을 테스트하는 것이 불가능할 때 총 유기 탄소(TOC) 및 전도도와 같은 비특이적 방법을 [지원합니다] [5].
TOC 분석은 성장 배지, 세포 잔해, 세정제와 같은 잔류물 유형을 구별할 수 없지만, 이러한 광범위한 검출은 분해된 단백질의 제거를 검증하는 데 유익합니다. 대규모 세포 배양의 경우, TOC와 세포 수 사이의 상관관계는 바이오리액터 벽에서 바이오매스 제거를 확인하는 실용적인 방법을 제공합니다 [4].
이 도구들은 함께 잔류물 검출을 위한 견고한 프레임워크를 제공하여, 배양육 생산에 필요한 엄격한 청결 기준을 충족하는 바이오리액터를 보장합니다. 이 기초는 이후의 무균 및 미생물 테스트에 필수적입니다.
무균 테스트 및 미생물 검출
잔류물 검출 후, 무균 상태를 보장하는 것은 절대적으로 중요합니다. 전통적인 무균 테스트는 미생물 집락이 검출 가능한 수준(약 10⁷ 세포)으로 성장하는 데 종종 5-7일이 걸립니다 [8]. 이 긴 과정은 배양육 생산에서 장비 교체와 배치 출시를 지연시킬 수 있습니다. 그러나 빠른 미생물 방법(RMM)은 대기 시간을 크게 줄여, 오염을 며칠이 아닌 몇 시간 내에 감지할 수 있습니다. 이러한 방법을 자세히 살펴보겠습니다.
바이오리액터 청소 검증의 주요 장애물 중 하나는 표준 기술로 특정 유기체를 배양하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 예를 들어, 2023년 9월에 AstraZeneca는 증폭된 ATP 발광을 사용하여 Dermacoccus nishinomiyaensis, 와 같은 느리게 자라는 유기체를 신속하게 식별했으며, 이는 표준 트립틱 소야 한천으로는 감지할 수 없었습니다. 이는 빠른 방법이 전통적인 배양 기술보다 뛰어나다는 것을 강조합니다. AstraZeneca의 수석 과학자인 Miriam Guest는 다음과 같이 설명했습니다:
"...신속한 대응을 가능하게 하여 완화 조치를 적시에 실행할 수 있도록 합니다."
– Miriam Guest, Principal Scientist, AstraZeneca [6]
자동화 시스템은 수동 판독 중 인간 오류를 제거하여 정확성을 더욱 향상시킵니다. 또한 실험실 정보 관리 시스템(LIMS)과 직접 통합되어 전사 오류를 줄이고 문서화를 가속화합니다. 이는 여러 배치를 관리하는 배양육 시설에 큰 이점입니다 [8].
신속한 미생물 검출 방법
전통적인 배양 방법의 한계를 극복하기 위해 여러 신속한 검출 기술이 등장했습니다. 다음은 그 작동 방식입니다:
- ATP 발광법: 이 방법은 살아있는 세포에서 아데노신 삼인산(ATP)을 검출하여 몇 분에서 몇 시간 내에 결과를 제공합니다.비특이적이지만, 빠른 위생 점검에 유용하며, 한천 배지가 놓칠 수 있는 미생물을 식별할 수 있습니다. 핵산 기반 방법: 실시간 PCR 및 LAMP(루프 매개 등온 증폭)과 같은 기술은 높은 민감도와 특이성을 제공합니다. 실시간 PCR은 농축 후 1–3.5시간 내에 10⁴ cfu/mL까지 검출할 수 있습니다. LAMP는 일정한 온도(59–65°C)에서 작동하며, 농축 후 60–75분 내에 10²에서 10⁴ cfu/mL을 검출합니다. RNA 검출을 위한 역전사 LAMP(rtLAMP)는 농축 없이 스왑당 4 cfu까지 식별할 수 있는 더 높은 민감도를 제공합니다. 광학 분석: 이는 미생물의 대사 활동에 따라 색이 변하거나 형광을 발하는 염료가 포함된 배지에 의존합니다.플랫폼 BioLumix 및 Soleris는 8개의 효모 세포 또는 50–100개의 박테리아를 감지할 수 있습니다 - 이는 시각적 집락 검사보다 훨씬 낮은 임계값입니다 [8]. 감지 시간은 단일 박테리아의 경우 8–18시간, 곰팡이 세포의 경우 35–48시간입니다 [7].
- 임피던스 미생물학: 이 방법은 박테리아 대사에 의해 배양 배지에서 발생하는 전기적 변화를 모니터링합니다. 이는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하며, 14–24시간 내에 결과를 제공합니다 [7].
빠른 방법을 선택할 때 고려해야 할 주요 요소 중 하나는 과정이 파괴적인지 여부입니다. 형광 기반 방법은 종종 비파괴적이어서 집락 추적이 가능하지만, ATP 생물발광 및 세포 용해 방법은 일반적으로 샘플을 파괴합니다 [8]. 바이오리액터 청소 검증에서 잔류 세제나 소독제가 방해가 될 수 있는 경우, 중화제를 사용하여 면봉을 미리 적시면 거짓 음성을 피할 수 있습니다 [7] .
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디지털 및 프로세스 분석 도구
프로세스 분석 기술 (PAT)과 디지털 모니터링 플랫폼의 도입은 배양육 생산에서 청소 검증을 변화시키고 있습니다. 전통적으로 오프라인 테스트는 실험실 결과를 기다리는 동안 장비가 몇 시간 또는 며칠 동안 유휴 상태로 있어야 했습니다 [9]. 이제 인라인 및 온라인 도구는 청소 주기 동안 실시간 데이터를 제공하여 이러한 지연을 제거합니다.
인라인 UV 분광법을 예로 들어보겠습니다. 이 기술은 센서를 사용하여 실시간으로 세정제와 단백질 잔류물을 모니터링합니다.STERIS의 John Schallom이 설명하듯이:
UV의 인라인 모니터링 기능은 전체 세척 사이클의 실시간 연속 모니터링을 가능하게 하며, 품질 설계, 공정 분석 기술, 공정 디지털화 및 Pharma 4.0 제조 시설의 지속 가능성 목표에 적용할 수 있습니다. [5]
UV 분광법 및 UPLC와 같은 도구를 사용하여 세척 과정 중 잔류물 수준을 정밀하게 측정합니다. 이를 통해 "깨끗할 때까지 세척" 접근 방식을 가능하게 하여, 최악의 시나리오에 맞춰 설계된 고정 세척 시간에 의존하는 대신 잔류물 수준이 목표 임계값에 도달하면 세척을 중지합니다. 결과적으로 장비 가동 중단 시간이 크게 줄어듭니다 [9]. 이러한 연속 모니터링 시스템은 예측 세척 프로토콜을 위한 길을 열어 효율성을 개선하고 낭비를 줄입니다.
AI 기반 예측 분석
AI는 청소 프로토콜 최적화에 중요한 역할을 하고 있습니다. 디지털 트윈 을 통해 AI는 TACT(온도, 행동, 화학, 시간) 변수를 시뮬레이션하여 반복 실험의 필요성을 줄임으로써 프로세스를 간소화합니다. 머신 러닝은 이러한 변수들의 상호작용을 분석하여 가장 효율적이고 재현 가능한 청소 조건을 식별합니다 [11]. 이 접근 방식은 시간과 자원을 절약할 뿐만 아니라 배양육을 전통적인 육류와 비용 경쟁력을 갖추도록 지원합니다 [10].
실시간 모니터링 플랫폼
실시간 모니터링 플랫폼은 여러 센서를 결합하여 청소 주기 동안 지속적으로 청결을 확인합니다. 예를 들어, 2014년 5월에 Waters Corporation은 PATROL UPLC 프로세스 분석 시스템을 선보였습니다.이 시스템은 1리터 반응 용기에서 세척 용매를 60초 등용매 방법으로 모니터링하여 주입 간 사이클 시간을 160초로 달성하고, 검출 한계는 24 ng/mL입니다. 이 거의 즉각적인 분석은 수동 세척의 필요성을 제거하고 "깨끗할 때까지 청소" 방법론을 강화합니다 [9].
배양육 시설의 경우, 이러한 플랫폼은 더욱 큰 이점을 제공합니다. 총 유기 탄소(TOC) 분석은 1,000,000개의 대장균 세포를 27 ppb 수준에서 감지할 수 있으며 [4], 미생물 청결도를 평가하는 민감한 방법을 제공합니다. 추가로, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술은 1–10 ng/mL 사이의 검출 민감도를 제공하여 [2], 고효능 생물학적 제제의 청소를 검증하는 데 매우 유용합니다.이 실시간 도구들을 통합함으로써, 배양육 생산업체들은 엄격한 규제 요구 사항에 부합하는 효율적인 청소 검증을 보장할 수 있습니다.
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도구 비교
배양육 생산에서 바이오리액터 청소 검증을 위한 분석 도구 비교
바이오리액터 청소 검증을 위한 적절한 분석 도구를 선택하는 것은 민감도, 특이성, 비용, 그리고 배양육 생산 과정에 얼마나 잘 맞는지를 고려하는 것을 포함합니다. 여기에는 이 엄격한 검증 노력에 기여하는 다양한 도구들의 분석이 포함되어 있습니다.
TOC 분석은 속도와 모든 유기 잔류물을 감지하는 능력으로 두드러지지만, 특정 분자를 구별하지는 않습니다. 총 유기 부하의 빠르고 민감한 검증을 제공하여, 유기물의 완전한 제거를 확인하는 것이 중요한 헹굼수 분석에 특히 가치가 있습니다. 그러나 총 탄소를 측정하기 때문에 존재하는 유기물의 특정 유형을 식별할 수 없습니다.
HPLC는 특정성에서 뛰어나며, 단일 실행에서 세제 및 기타 성분으로부터 목표 잔류물을 분리합니다. 그 민감도는 분자의 화학적 특성과 사용된 검출기의 유형( e.g. , UV 또는 형광)에 따라 달라집니다. 단점은? HPLC는 시간이 많이 소요되며, 샘플당 최대 40분이 걸리고 분석 전에 광범위한 준비가 필요합니다[12]. 일상적인 모니터링에는 이상적이지 않지만, 편차가 발생할 때 오염 물질을 식별하는 데 매우 효과적입니다.
질량 분석법은 매우 낮은 수준(ppb)에서 분자를 감지할 수 있는 뛰어난 특이성과 민감성을 제공합니다. 이는 강력한 성장 인자나 단백질의 제거를 검증하는 데 완벽합니다. 그러나 잔류 허용 한계 근처에서 정확성을 보장하기 위해 종종 내부 표준이 필요합니다. 질량 분석법의 높은 비용과 복잡성은 일상적인 사용에는 덜 실용적이지만, 편차 조사나 최악의 시나리오 검증에는 필수적입니다.
비교 표
다음 표는 잔류물 감지 및 미생물 모니터링에 사용되는 다양한 도구의 강점과 한계를 요약한 것입니다. 각 도구는 검증된 청소 프로토콜을 유지하는 데 독특한 역할을 합니다.
| 도구 | 특이성 | 민감도 | 주요 장점 | 주요 제한점 | 배양육에의 적용 가능성 |
|---|---|---|---|---|---|
| TOC 분석 | 낮음 (비특이적) | 높음 (ppb 수준) | 빠름; 모든 유기 잔류물 감지; 검증 용이 | 특정 분자를 식별할 수 없음 | 높음; 린스 샘플 및 총 유기 부하 검증에 이상적[4][15] |
| HPLC | 높음 (특이적) | 가변적 (검출기 의존적) | 세제를 타겟에서 분리; 매우 정확함 | 시간 소요 (샘플당 최대 40분); 크로모포어 필요 | 중간; 편차 동안 특정 오염 물질 식별에 최적[12][15] |
| 질량 분석법 | 매우 높음 (특정) | 매우 높음 (ppb 수준) | 극도의 민감도; e |
높은 비용; 내부 표준 필요 | 중간; 고효능 잔류물 및 복잡한 특성화에 예약됨 |
| 신속한 미생물 검출 | 변동 가능 | 높음 | 전통적인 무균 시험보다 빠른 피드백 제공 | 높은 초기 비용 | 높음; 배치 실패율 감소에 필수적 (현재 11–20%)[14] |
| 디지털/PAT 도구 | N/A (모니터링) | 고급 (프로세스) | 실시간, 비파괴 모니터링; 수작업 감소 | 간섭의 대상 (e.g. , 형광 소광) | 높음; 확장 가능하고 일관된 생산 지원[13][15] |
이 비교는 속도, 특이성 및 실시간 모니터링을 결합한 균형 잡힌 접근 방식의 필요성을 강조합니다. 제약 제조업체보다 예산이 더 제한적인 배양육 시설의 경우, TOC 분석은 종종 일상적인 검증을 위한 가장 실용적인 선택으로 부상합니다. HPLC나 질량 분석법에 비해 방법 개발이 훨씬 적게 요구됩니다[12].
결론
잔류물 검출과 실시간 모니터링을 결합하는 것은 배양육 생산에서 효과적인 바이오리액터 청소 검증에 필수적입니다. TOC 분석, HPLC 및 질량 분석과 같은 분석 방법을 활용하여 생산자는 일상적인 점검과 상세한 편차 조사를 모두 해결할 수 있습니다.각 도구는 고유한 강점을 제공하여 견고하고 포괄적인 검증 과정을 보장합니다.
업계의 자동화 시스템 및 실시간 모니터링으로의 전환은 게임 체인저입니다. 이러한 발전은 가동 중단 시간을 최소화하고 배치 실패를 줄이며 운영을 간소화합니다. Ferdinand Groten이 적절히 표현했듯이:
자동화는 프로세스의 효율성, 안정성 및 재현성을 높이고 일관된 데이터 문서를 가능하게 하여 일관되게 높은 제품 품질을 제공하고 프로세스 수율의 확장을 가능하게 합니다 [1].
올바른 도구를 선택하는 것은 잔류물 허용 한계, 민감도 및 샘플링 호환성을 고려하는 것을 포함합니다 [12]. 고효능 단백질의 엄격한 허용 일일 노출 한계에 대해, 표면 플라스몬 공명 기술은 1–5 ng/mL까지 감지할 수 있는 뛰어난 민감도를 제공하며, 이는 SDS-PAGE가 보여준 90–95% 분해 수준을 훨씬 능가합니다. [2].
신뢰할 수 있는 생물제약 등급의 분석 장비를 조달하는 것은 쉬운 일이 아닙니다.
성공의 열쇠는 속도, 정밀도 및 확장성을 균형 있게 조화시키는 검증 전략에 있습니다. 신속한 일상 모니터링은 필요할 때 심층 조사를 수행할 수 있는 능력과 함께 작동해야 합니다.효율적인 장비 소싱과 결합하여, 이 접근 방식은 확장 가능한 배양육 생산의 요구를 충족하는 일관되고 준수하는 프로세스를 보장합니다.
자주 묻는 질문
세척 검증을 위해 TOC, HPLC 및 LC-MS/MS 중에서 어떻게 선택해야 하나요?
TOC, HPLC, 및 LC-MS/MS, 중에서 선택할 때는 무엇을 감지해야 하는지와 방법의 정밀도가 얼마나 필요한지가 중요합니다.
- TOC (총 유기 탄소): 이 방법은 세제와 같은 전체 유기 잔류물을 측정하지만 특정 화합물을 정확히 찾아내지는 않습니다. 일반적인 잔류물 모니터링에 유용한 광범위한 접근 방식입니다.
- HPLC (고성능 액체 크로마토그래피): 이 방법은 더 구체적인 옵션으로, 샘플 내의 알려진 불순물을 식별하고 정량화하는 데 적합합니다.
- LC-MS/MS (액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법): 극도의 민감도가 필요하거나 복잡한 샘플을 분석해야 하는 경우, 이 방법이 최적입니다. 미세한 수준까지 흔적 잔류물을 감지하는 데 뛰어납니다.
올바른 선택은 프로세스 요구 사항과 다루고 있는 잔류물의 특성에 따라 다릅니다.
바이오리액터의 잔류물 허용 한계는 무엇인가요?
바이오리액터의 잔류물 허용 한계는 허용 가능한 잔류물 전이 또는 허용 일일 노출량(PDE) 값과 같은 건강 기반 노출 수준에 따라 설정됩니다. 이러한 한계는 환자 안전을 보장하면서 규제 표준을 충족하기 위해 필수적이며, 확립된 지침에 따라 설정됩니다.
소독제가 결과에 영향을 미칠 수 있는 경우 가장 좋은 신속한 미생물 방법은 무엇인가요?
7000RMS 미생물 검출 분석기는 소독제가 결과에 영향을 미칠 수 있는 상황에서 훌륭한 선택입니다.2초마다 데이터를 캡처하여 지속적인 생물부하 모니터링을 제공합니다. 이는 소독제 간섭의 영향을 줄이고 일관되고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.
