El esfuerzo cortante puede hacer o deshacer la producción de carne cultivada. ¿Por qué? Porque las células utilizadas carecen de paredes protectoras, lo que las hace propensas a sufrir daños por las fuerzas de fluidos en los biorreactores. Este artículo profundiza en cómo el esfuerzo cortante afecta a estas células, los umbrales que pueden manejar y las formas de diseñar sistemas que las protejan.
Puntos clave:
- El esfuerzo cortante surge del movimiento de fluidos y puede dañar las células animales frágiles, causando daño a la membrana, desprendimiento o muerte.
- La mayoría de las células de mamíferos toleran 0.3–1.7 Pascales, pero incluso niveles más bajos pueden activar respuestas de estrés.
- Las decisiones de diseño como el tipo de impulsor, los métodos de aireación y la geometría del biorreactor impactan directamente en las fuerzas de corte.
- Estrategias para minimizar el daño incluyen el uso de diseños de biorreactores más suaves (e.g. , sistemas de elevación por aire o de balanceo), optimizar las velocidades de agitación y añadir agentes protectores como Pluronic F68.
Para la carne cultivada, gestionar este equilibrio es fundamental para asegurar que las células crezcan y se diferencien sin daño, especialmente a medida que la producción se escala. Vamos a explorar la ciencia detrás de estos umbrales y soluciones prácticas para el diseño de biorreactores.
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Qué Afecta el Estrés de Cizallamiento en Biorreactores
Entender los factores que influyen en el estrés de cizallamiento en biorreactores es crucial para optimizar las condiciones, especialmente cuando se trata de células delicadas. Vamos a profundizar en los principales elementos que determinan su intensidad y distribución.
Diseño y Condiciones de Operación del Biorreactor
El diseño de un biorreactor juega un papel importante en determinar dónde y cómo ocurre el estrés de cizallamiento. Un factor clave es el tipo de impulsor utilizado.Por ejemplo, las turbinas Rushton pueden crear tasas de disipación de energía hasta 280 veces más altas que el promedio del recipiente, mientras que los impulsores de flujo axial de alta eficiencia como el HE3 producen tasas más cercanas a 180 veces la disipación media [4]. Otros elementos de diseño, como el diámetro del impulsor, la velocidad y la posición, también influyen en la distribución de energía.
Curiosamente, la aireación introduce fuerzas mucho más severas que la agitación. Cuando las pequeñas burbujas (1–2 mm) se rompen, liberan niveles de energía entre 10⁷–10⁹ W/m³, lo que puede matar a más de 1,000 células en un solo evento [4]. Esto hace que el comportamiento de las burbujas sea una consideración crítica, especialmente en la producción de carne cultivada.
Los deflectores son otro elemento clave de diseño. Previenen la formación de un vórtice en el cultivo, que de otro modo arrastraría burbujas al líquido e incrementaría los eventos de ruptura en la superficie [4]. Además, la relación entre el diámetro del impulsor y el recipiente y la altura del impulsor desde el fondo influyen en cómo se distribuye la energía a lo largo del biorreactor.
Distribución Desigual del Esfuerzo de Corte
El esfuerzo de corte no se distribuye uniformemente a través del biorreactor. La investigación muestra que la disipación de energía tiende a concentrarse alrededor de zonas específicas, como el área de descarga del impulsor, los vórtices de arrastre y la superficie del líquido donde se rompen las burbujas. Estos puntos críticos pueden plantear desafíos durante la ampliación.
Weiwei Hu de Biogen Idec destaca este problema de escalado:
La percepción de 'sensibilidad al esfuerzo de corte' ha puesto históricamente un límite superior arbitrario a la agitación y aireación en la operación de biorreactores; sin embargo, a medida que las densidades celulares y las productividades continúan aumentando, los requisitos de transferencia de masa pueden exceder aquellos impuestos por estos límites bajos arbitrarios [4].
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Por ejemplo, un estudio de 2021 realizado por Junxuan Zhang y Xueliang Li de Jiangnan University comparó un matraz de agitación de 250 mL con un reactor de tanque agitado de 20 m³ utilizando dinámica de fluidos computacional. Observaron que incluso a las velocidades de agitación más bajas, las fuerzas de cizallamiento en el reactor más grande eran lo suficientemente fuertes como para desprender células de los microportadores, con la aireación introduciendo aún más estrés que la agitación [3].
Formato de Cultivo y Sensibilidad al Cizallamiento
El formato de cultivo también determina cómo las células experimentan el estrés de cizallamiento. Las células cultivadas en microportadores son particularmente vulnerables. Si la mezcla intensa o las colisiones entre portadores hacen que las células se desprendan, esas células se pierden efectivamente [4]. Por otro lado, los cultivos en suspensión de células de hibridoma han demostrado resiliencia, manteniendo la viabilidad a velocidades de agitación de hasta 1,500 RPM en biorreactores con deflectores sin una interfaz aire-líquido [4].
Diferentes sistemas de cultivo manejan el cizallamiento de diversas maneras. Los biorreactores de lecho fijo minimizan el cizallamiento manteniendo las células inmovilizadas en superficies estacionarias, mientras que los lechos fluidizados introducen cizallamiento moderado a alto a través del movimiento de microportadores y el flujo ascendente de fluidos [2]. Algunos microportadores, especialmente los porosos, ofrecen superficies internas que pueden proteger a las células de fuerzas extremas, proporcionando mejor protección en comparación con los microportadores sólidos [2]. Estas diferencias destacan la necesidad de equilibrar cuidadosamente la entrega de nutrientes con el riesgo de daño celular al diseñar biorreactores.
Umbrales de Estrés de Cizallamiento para Diferentes Tipos de Células
Umbrales de Tolerancia al Estrés de Cizallamiento para Tipos de Células de Carne Cultivada
Gestionar el estrés de cizallamiento es crítico para la producción de carne cultivada, ya que el estrés desigual puede dañar células que carecen de paredes celulares fuertes. Comprender los niveles específicos de estrés que cada tipo de célula puede tolerar ayuda a mantener la salud celular, desencadenar respuestas mecanosensibles o fomentar la diferenciación.
Valores Umbral para Tipos Comunes de Células
La tolerancia al estrés de cizallamiento varía significativamente entre los tipos de células, y conocer estos umbrales es clave para ajustar las configuraciones del biorreactor.
Por ejemplo, los mioblastos de carne cultivada como la línea C2C12 prosperan bajo bajo estrés de cizallamiento. El estrés cíclico de aproximadamente 1.68 mPa mejora la formación y fusión de miotubos [8]. Las células madre derivadas del músculo de ratón (MDSCs) muestran una mejor diferenciación miogénica y una formación de miotubos más extensa cuando se exponen a 16 mPa [8]. A medida que los mioblastos maduran en miotubos, pueden manejar niveles de estrés más altos; el estrés pulsado entre 400 mPa y 1,400 mPa activa vías que regulan el tamaño de las fibras musculares, lo que potencialmente conduce a la hipertrofia [8].
Las células madre mesenquimales (MSCs) también responden de manera única. Por ejemplo, las MSCs caninas expuestas a un esfuerzo cortante entre 100 mPa y 1,500 mPa regulan al alza marcadores endoteliales como PECAM-1 y VE-cadherina mientras regulan a la baja marcadores de músculo liso [10].
Tabla de Comparación de Umbrales de Tensión de Corte
A continuación, una rápida comparación de los umbrales de tensión de corte en diferentes tipos de células de carne cultivada:
| Tipo de Célula | Umbral de Tensión de Corte (mPa) | Efectos Observados | Fuente |
|---|---|---|---|
| Células Mamíferas (General) | 300–1,700 | Rango base; niveles por encima de esto pueden llevar a daño celular o apoptosis | [1] |
| Mioblastos C2C12 (Adherentes) | ~1.68 | Viabilidad mejorada y aumento en la formación de miotubos | [8] |
| MDSCs de ratón (Adherente) | ~16 | Diferenciación mejorada y formación extensa de miotubos | [8] |
| Miotubos C2C12 (Adherente) | 400–1,400 | Activación de vías que regulan el tamaño de las fibras musculares (hipertrofia potencial) | [8] |
| MSCs caninas | 100–1,500 | Regulación al alza de marcadores endoteliales, reducción de marcadores de músculo liso | [10] |
| Sensores de Superficie Celular (Integrinas) | 100–1,000 | Activación de canales iónicos mecanosensibles y receptores | [1] |
Para contexto, agitar una cultura a 100–200 rpm en un matraz estándar genera niveles de esfuerzo cortante de 300–660 mPa, mientras que los agitadores orbitales que funcionan a 20–60 rpm producen fuerzas más altas que van desde 600 mPa a 1,600 mPa [1] . Sistemas más suaves como los biorreactores oscilantes (±5° a 1 Hz) crean un estrés de aproximadamente 90 mPa [9] , y los biorreactores clinostatos operan alrededor de 10 mPa, manteniéndose bien por debajo del umbral de activación para los sensores de superficie celular mecanosensibles [1].
Estos umbrales sirven como guía para ajustar las condiciones del biorreactor, ayudando a mantener entornos óptimos durante las fases de escalado y crecimiento celular.
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Cómo Reducir el Daño por Estrés de Cizallamiento
Minimizar el daño por estrés de cizallamiento en la producción de carne cultivada se trata de lograr un equilibrio delicado. El objetivo es asegurar una mezcla eficiente y una entrega de oxígeno mientras se protegen las células sensibles del daño mecánico. Esto implica una combinación de diseño inteligente de biorreactores y estrategias operativas reflexivas.
Modificaciones en el Diseño de Biorreactores
El uso de modelado CFD (Dinámica de Fluidos Computacional) es un paso clave para optimizar el rendimiento de los biorreactores. Las técnicas modernas de CFD ahora incluyen simulaciones de flujo multifásico, que tienen en cuenta las interacciones entre células y microportadores. Esto resulta en evaluaciones más precisas del esfuerzo cortante y su posible daño [5].
El tipo de biorreactor juega un papel importante en la determinación de los niveles de esfuerzo cortante. Aunque los reactores de tanque agitado todavía se utilizan ampliamente, los diseños alternativos pueden ofrecer condiciones más suaves:
- Biorreactores de circulación por aire: Estos eliminan los agitadores mecánicos, utilizando en su lugar la circulación inducida por gas para reducir el esfuerzo cortante mecánico [5].
- Biorreactores de onda o balanceo: Al depender del movimiento de la superficie en lugar de impulsores, son ideales para cultivos de baja a media densidad que requieren una mezcla suave [5].
- Biorreactores de rueda vertical: Particularmente efectivos para cultivos basados en agregados, han demostrado éxito en mantener la viabilidad celular durante la expansión de agregados de iPSC humanos [11].
Otro factor importante es el comportamiento no newtoniano de las suspensiones celulares. Por ejemplo, las suspensiones que contienen suero exhiben propiedades de adelgazamiento por cizallamiento, que los modelos tradicionales a menudo no logran capturar. Usar modelos avanzados, como el modelo de Sisko, proporciona predicciones más precisas del esfuerzo cortante, ayudando a ajustar finamente las fuerzas mecánicas y evitar umbrales que podrían alterar la expresión genética [6].
htmlMétodos de Siembra Celular y Agitación
Las estrategias operativas también juegan un papel importante en la reducción del daño por estrés de cizallamiento. Por ejemplo, la agitación intermitente durante las primeras etapas de la adhesión celular puede limitar la exposición al cizallamiento mientras se asegura que los nutrientes se distribuyan de manera efectiva. Ajustar la agitación requiere una consideración cuidadosa de factores como el contenido de suero, la densidad celular y la edad del cultivo [6].
Al determinar las velocidades de agitación, la modelización CFD puede ayudar a identificar el equilibrio ideal: suficiente transferencia de oxígeno sin causar daño mecánico. Las simulaciones compartimentadas pueden refinar aún más la distribución del estrés de cizallamiento, haciendo el proceso más eficiente [5].
Impacto en el Diseño y Escalado de Biorreactores
Al escalar biorreactores para la producción de carne cultivada, comprender y aplicar los umbrales de esfuerzo cortante es fundamental. Estos umbrales influyen en las decisiones sobre la velocidad del impulsor, el diseño del dispersor y otros parámetros para garantizar la viabilidad celular a medida que aumentan los volúmenes de producción.
Establecimiento de Parámetros de Operación del Biorreactor
Los umbrales de esfuerzo cortante juegan un papel clave en la definición de los límites operativos. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSCs) tienen un umbral de aproximadamente 0.092 Pa[12]. Mantenerse por debajo de este nivel - como operar a 50 rpm, lo que genera alrededor de 0.068 Pa - apoya la expansión celular saludable, logrando un aumento de 27.4 veces. Sin embargo, aumentar la agitación a 100 rpm incrementa el esfuerzo cortante a alrededor de 0.192 Pa, resultando en una tasa de apoptosis del 72% y limitando la expansión a 24.5‐fold[12] .
"Se ha informado que el umbral de esfuerzo cortante para la proliferación y función de HSCs es de 0.092 Pa." – Hosseinizand et al. [12]
El daño por cizallamiento ocurre cuando los remolinos turbulentos se vuelven más pequeños que aproximadamente dos tercios del diámetro de una célula o agregado[12][13]. A 50 rpm, los remolinos miden alrededor de 280 µm, lo cual es seguro para las células. Pero a 100 rpm, los remolinos se reducen a 166 µm, aumentando el riesgo de daño mecánico.
El burbujeo introduce estrés hidrodinámico adicional. Las burbujas pequeñas (1 mm de diámetro) generan velocidades de fluido locales de aproximadamente 6.4 m/s durante la ruptura, mientras que las burbujas más grandes de 6 mm producen picos más suaves de 0.94 m/s[13] . Para contrarrestar esto, se utilizan aditivos como Pluronic F68 para evitar que las células se adhieran a las superficies de las burbujas. Sin embargo, su efectividad depende de mantener la concentración adecuada en relación con el área de superficie del gas[13].
Estos parámetros son esenciales al pasar a sistemas de biorreactores más grandes.
Mantenimiento de Condiciones Durante la Escalación
Escalar de un matraz de agitación de 250 mL a un reactor de tanque agitado de 20 m³ presenta desafíos únicos. Las condiciones hidrodinámicas en sistemas a pequeña escala no se traducen directamente a volúmenes industriales. Incluso operar grandes reactores a velocidades de agitación mínimas puede resultar en fuerzas de cizallamiento lo suficientemente fuertes como para desprender células de los microportadores[3].
"Incluso cuando se opera a una velocidad de agitación cercana al Njs, el cizallamiento ejercido por los impulsores por sí solo podría causar el desprendimiento de células de los microportadores, mientras que se introduce aún más estrés hidrodinámico a través de la aireación." – Zhang et al.[3]
Para mantener condiciones de cizallamiento consistentes durante la ampliación, un enfoque es mantener constante la velocidad de la punta del impulsor. Sin embargo, esto puede llevar a tiempos de mezcla más largos y a la formación de gradientes de nutrientes y oxígeno, lo que puede afectar negativamente el crecimiento y rendimiento celular[3]. La modelización de Dinámica de Fluidos Computacional (CFD) se vuelve esencial para identificar zonas de estrés y optimizar el diseño del reactor durante la ampliación[5].
Para líneas celulares que son altamente sensibles al cizallamiento, los diseños de reactores alternativos son a menudo más adecuados. Los reactores de circulación de aire, que eliminan los agitadores mecánicos, han sido modelados con éxito para volúmenes de hasta 300,000 L, logrando densidades celulares teóricas de 2 × 10⁸ células/mL[7]. De manera similar, los biorreactores de balanceo utilizan movimientos de onda suave para minimizar el cizallamiento, haciéndolos efectivos para trenes de semillas de hasta 500 L[14][15]. Plataformas como
Resumen y Recomendaciones
Manejar el estrés por cizallamiento de manera efectiva es crucial para mantener la viabilidad celular y la productividad en la producción de carne cultivada. La investigación muestra que la ruptura de burbujas durante la aireación crea fuerzas más dañinas que la agitación mecánica. Por ejemplo, burbujas pequeñas (1 mm) generan velocidades de fluido de 6.4 m/s al romperse, mientras que burbujas más grandes (6 mm) producen picos más suaves de 0.94 m/s [13]. Para minimizar estas fuerzas, los equipos de adquisición deben centrarse en biorreactores equipados con microspargers sinterizados (tamaño de poro de 15 μm), que permiten una aireación pulsada y reducen la interfaz gas-líquido. Estas consideraciones son vitales para escalar los sistemas de biorreactores.
Otro factor importante es la relación entre la escala de remolino y el diámetro celular (η/d_c), lo que puede ayudar a reducir el daño causado por la agitación. Un estudio realizado en agosto de 2017 por el Instituto de Ingeniería de Bioprocesos y Tecnología Farmacéutica destaca esto. Usando un biorreactor de vidrio Applikon de 3 L con células de insecto Sf21, demostraron que un impulsor Rushton de seis palas a 205 rpm, combinado con burbujas de 199 μm, produjo un rendimiento de proteína GFP de 12.75 μg/mL. En contraste, un impulsor de palas inclinadas a 171 rpm, que generó una mayor área de superficie específica de gas de 18.0 m²/m³, produjo solo 4.0 μg/mL [13] . Esto demuestra que el área total de la superficie de gas es más influyente que la velocidad de agitación.
Agentes protectores como Pluronic F68 (0.5–3 g/L) pueden formar una capa protectora de 16–40 μm alrededor de las burbujas, evitando que las células se adhieran [13]. Sin embargo, como observaron Tobias Weidner y sus colegas:
Si el área de superficie [total de gas] supera un cierto umbral, la concentración de Pluronic ya no es suficiente para la protección celular [13].
Esto significa que los ingenieros deben monitorear cuidadosamente el área de superficie de gas en relación con la concentración de Pluronic F68 durante la ampliación para asegurar que las células permanezcan protegidas.
Para líneas celulares sensibles, diseños alternativos de reactores pueden proporcionar soluciones. Los reactores de circulación de aire, por ejemplo, eliminan los agitadores mecánicos, creando un ambiente de mezcla más suave [7]. Los biorreactores de lecho fijo son otra opción, capaces de mantener tensiones de cizallamiento en la pared ultra bajas que van desde 10⁻³ hasta 10⁻² Pa [17]. Para equipos que exploran sistemas especializados de baja cizalladura, proveedores como
Además, mantener los mioblastos bovinos por debajo de 25 duplicaciones de población es esencial para preservar su capacidad de diferenciación [16] . Superar este umbral puede llevar a una disminución en el índice de fusión de aproximadamente 6.81% con cada pasaje [16], reduciendo la capacidad de las células para formar fibras musculares. Para abordar esto, los ingenieros de procesos deben utilizar la modelización de Dinámica de Fluidos Computacional (CFD) para identificar zonas de alta cizalladura antes de escalar de sistemas de laboratorio a industriales. Este enfoque asegura transiciones más suaves y mejores resultados durante la ampliación.
Preguntas Frecuentes
¿Cómo mido el esfuerzo cortante en mi biorreactor?
El esfuerzo cortante en biorreactores a menudo se evalúa utilizando técnicas de modelado computacional como la Dinámica de Fluidos Computacional (CFD). Estos métodos permiten el análisis de patrones de flujo y la identificación de zonas de esfuerzo cortante dentro del biorreactor. Además, herramientas de prueba de esfuerzo cortante a pequeña escala son valiosas para caracterizar la sensibilidad de líneas celulares específicas y para evaluar diversas condiciones de proceso. Para el monitoreo continuo, el esfuerzo cortante se puede determinar calculando la velocidad del fluido y la viscosidad. Este enfoque es particularmente efectivo en sistemas microfluídicos o utilizando calculadoras de esfuerzo cortante en línea.
¿Qué método de aireación minimiza el daño por ruptura de burbujas?
Minimizar el daño por ruptura de burbujas depende en gran medida del uso de burbujas más pequeñas. Estas burbujas causan menos daño celular cuando se comparan en una base de volumen a volumen.Aunque no se detallan técnicas exactas, gestionar el tamaño y el comportamiento de las burbujas, como regular su tamaño, juega un papel crucial en la reducción de los efectos nocivos de la ruptura.
¿Qué debo mantener constante al escalar para reducir el cizallamiento?
Al aumentar el tamaño de los biorreactores de carne cultivada, es crucial mantener el esfuerzo de cizallamiento por debajo de aproximadamente 3 Pa para evitar dañar las células. Preste mucha atención a factores como agitación, patrones de flujo, y aeración para asegurar que los niveles de cizallamiento se mantengan consistentes durante toda la operación.
