Jos vertaat kLa-arvoja ilman, että menetelmä, väliaine, lämpötila ja anturin vaste ovat yhteneväisiä, voit tehdä väärän mittakaavan päätöksen.
Bioprosessien insinööreille, soluviljelytieteilijöille ja viljellyn lihan T&K-tiimeille, lyhyt vastaus on yksinkertainen: staattinen kaasunpoisto on paras aluksen vertailuun, kun taas dynaamiset ja kaasunpoiston happitasapainomenetelmät ovat hyödyllisempiä, kun haluat prosessiin liittyviä tietoja elävän liemen olosuhteissa. Vesipohjaiset kLa-luvut voivat johtaa harhaan, anturin viive voi vääristää nopeita siirtonopeuksia, ja väliaineen lisäaineet, kuten Pluronic F-68 voivat vähentää kLa-arvoa 50% tai enemmän joissakin kokoonpanoissa.
Tässä artikkeli yhdellä kertaa:
- kLa ei ole itsenäinen tavoite. Käyttäisin sitä yhdessä P/V:n, leikkausrajojen, kaasun virtauksen ja sekoitusajan kanssa.
- Staattinen kaasunpoisto antaa puhtaan laitteistojen vertailun, mutta se jättää huomiotta MEIDÄN eikä heijasta aktiivista kulttuuria.
- Dynaamiset menetelmät seuraavat hapensiirtoa viljelyn aikana ja ovat lähempänä sitä, mitä käytät laajassa mittakaavassa, vaikka ilmanvaihdon tauko voi rasittaa soluja.
- Happotasapainomenetelmät käyttävät sisään- ja ulostulokaasudataa ja sopivat suuremmille astioille, mutta ne vaativat tarkkaa kaasuanalyysiä.
- Sulfiittioksidaatio ja paineaskelmenetelmät ovat pääasiassa laitteiden karakterisointiin, eivät elävän viljellyn lihan liemeen.
- Anturin vasteaika on tärkeä: optiset DO-anturit reagoivat usein 3-10 s, kun taas polarografiset anturit ovat usein 8-30 s.
- Lämpötila ja väliaine ovat tärkeitä: vesissä mitattu kLa 20°C:ssa ei vastaa suoraan viljelyväliaineeseen 37°C:ssa.
- Tyypillisesti artikkelissa raportoidaan vaihteluväleiksi 50-200 h⁻¹ 2-10 L ja 80-300 h⁻¹ 50-500 L , mutta vain, jos koko testiperusta täsmää.
H.E.L Selittää | Johdonmukaisen hapensiirron saavuttaminen: kLa:n vaikutus fermentoinnin skaalaamiseen
sbb-itb-ffee270
Nopea vertailu
kLa:n mittausmenetelmät bioreaktorin skaalaamiseen: rinnakkainen vertailu
| Menetelmä | Paras käyttöön | Pääasiallinen haitta | Prosessin vastaavuus |
|---|---|---|---|
| Staattinen kaasunpoisto | Astian ja ilmastimen vertailu | Ei elävien solujen hapentarvetta | Matala tai keskitaso |
| Dynaaminen menetelmä | Aktiivinen kulttuurin skaalaustyö | Ilmastuksen keskeytys voi häiritä soluja | Korkea |
| Happotasapaino | Suurempien mittakaavojen seuranta | Tarvitsee tarkkaa poistoilmatietoa | Korkea |
| Sulfiittioksidaatio | Maksimisiirron laitteistotarkastukset | Ei kuten prosessimedia | Matala |
| Paineaskel | Suurisäiliön karakterisointi | Tarvitsee paineenkestävän asennuksen | Keskitaso |
Jos laatisin skaalaussuunnitelman, erityisesti siirryttäessä pilottimittakaavan järjestelmiin, käsittelisin menetelmän valintaa osana datan laadun tarkistusta, ei jälkikäteen.
2. Bioreaktoritutkimuksissa käytetyt pääasialliset kLa-mittausmenetelmät
Kirjallisuus jakaa kLa-mittauksen yleensä kolmeen päämenetelmäperheeseen: staattinen kaasunpoisto, dynaamiset ja happitasapainomenetelmät, ja kemialliset tai painepohjaiset tekniikat. Kukin tarkastelee hapensiirtoa hieman eri näkökulmasta. Tämä on tärkeää, koska menetelmä itsessään voi vaikuttaa siihen, miten skaalaustietoja tulkitaan.
2.1 Staattinen kaasunpoisto
Staattinen kaasunpoisto alkaa nesteen hapettomuudella, useimmiten typellä. Ilmastus kytketään sitten takaisin päälle, ja liuenneen hapen (DO) palautumista seurataan ajan myötä. kLa lasketaan DO:n nousunopeudesta.
Koska se ei vaadi eläviä soluja tai vaarallisia reagensseja, tämä menetelmä on yksinkertainen tapa arvioida bioreaktoria. Haasteena on, että se ei heijasta soluhengitystä tai sitä, miten liemen ominaisuudet muuttuvat viljelyn aikana.Tulokset riippuvat myös väliaineesta, juoksupyörän suunnittelusta, spargerin suunnittelusta, kaasun virtauksesta, lämpötilasta ja vaahdonestoaineen käytöstä. Esimerkiksi 400 L sekoitetussa säiliössä Pluronic F-68:n lisääminen 0,02 g/L voi vähentää kLa-arvoa vähintään 50% verrattuna viitteeseen ilman lisäainetta [2].
Yksi käytännön ongelma on anturin dynamiikka. Jos anturin vaste on liian hidas, mitattu kLa on vääristynyt ja vaatii korjausta [1].
2.2 Dynaamiset ja happitasapainomenetelmät prosessiolosuhteissa
Jos tavoitteena on prosessin merkityksellisyys puhtaan veden vertailuarvon sijaan, dynaamiset menetelmät kertovat yleensä enemmän. Yleisimmin käytetyssä versiossa ilmastus keskeytetään hetkeksi, jotta soluhengitys laskee liuenneen hapen määrää. Ilmastus palautetaan sitten, ja palautumistransientti analysoidaan. Tämä tekee mittauksesta paljon lähempänä sitä, mitä liemi tekee todellisen ajon aikana.
Happitasapainomenetelmä kulkee eri reittiä.Sen sijaan, että keskeytettäisiin ilmastus, se arvioi kLa:n OTR:stä miinus OUR, yleensä kaasuanalyysillä, kuten massaspektrometrialla [2]. Se on ei-invasiivinen ja erityisen hyödyllinen suuremmissa astioissa. Mutta sillä on hintansa: tarvitset bioprosessinohjausohjelmistoa ja kaasuanalyyttistä laitteistoa sekä luotettavia OUR-tietoja.
Viljellyn lihan työhön nämä menetelmät ovat hyödyllisiä, koska ne heijastavat hapensiirtoa samassa liemessä ja solutilanteissa, joita nähdään skaalausvaiheessa. Vaihtokauppa on melko selvä. Dynaamisessa menetelmässä DO laskee ilmastuksen tauon aikana, ja se voi rasittaa viljelmää, jos keskeytys kestää liian kauan.
Kemiallisia ja paineaskelmenetelmiä käytetään enemmän laitteiden karakterisointiin kuin reaaliaikaiseen prosessiluentaan.
2.3 Sulfiittioksidaatio ja paineaskelmenetelmät
Ei-biologisessa vertailussa kaksi muuta menetelmää esiintyvät usein. Ne ovat hyviä laitteiston karakterisointiin, mutta ne eivät suoraan edusta elävää viljeltyä lihalientä.
Sulfiittioksidaatio käyttää natriumsulfiittia, joka hapetetaan katalyytin läsnä ollessa, kuluttamaan liuennutta happea nopeudella, josta kLa voidaan laskea. Ongelma on yksinkertainen: neste ei edusta biologista mediaa, joten tulos ei suoraan käänny viljeltyyn lihaliemeen [2].
Paineaskelmenetelmä muuttaa astian painetta vaiheittain siirtääkseen hapen kyllästymiskonsentraatiota (C*) Henryn lain mukaisesti. Tämä luo massansiirtovoiman muuttamatta sekoitusnopeutta tai kaasun virtausnopeutta [2]. Se on kätevä, kun painetta on helpompi hallita kuin sekoitusta tai ilmastusta. Silti se vaatii paineenkestäviä astioita ja tiukasti hallittuja paineen muutoksia, mikä rajoittaa päivittäistä käyttöä. Siitä huolimatta se on hyödyllinen tutkimusmenetelmä laitteiston karakterisointiin.
3. Vahvuudet, rajoitukset ja vertailtavuus menetelmien välillä
Julkaistut kLa-arvot ovat vertailukelpoisia vain, kun testiasetukset ja taustaoletukset ovat samat. Jopa lämpötila voi vaikuttaa tulokseen merkittävästi. Ja jos yksi tutkimus korjaa liuenneen hapen anturin vasteajan ja toinen ei, näitä arvoja ei pitäisi pitää vastaavina, vaikka muu asetus näyttäisi samalta.
Tämä ero on merkittävin, kun päätät, mikä luku on tarkoitettu. Onko se laitteiston vertailuarvo? Vai onko se prosessiin liittyvä mittari, joka heijastaa, mitä kulttuurissa tapahtuu?
3.1 Missä staattinen kaasunpoisto pysyy viitemenetelmänä
Staattinen kaasunpoisto on edelleen ensisijainen menetelmä laitteistojen vertailuun. Jos tavoitteena on verrata ilmapuhaltimien suunnittelua, sekoittimien geometrioita tai astian kokoonpanoja kontrolloiduissa olosuhteissa, se hoitaa tehtävän hyvin.Se on yksinkertainen, toistettavissa ja ei tarvitse eläviä soluja.
Haittapuoli on yhtä selvä: kLa mitattuna vedessä on huono ennustaja hapensiirrolle viljellyssä lihaväliaineessa. Arvo deionisoidusta vedestä kertoo jotain hyödyllistä itse astiasta, mutta paljon vähemmän suorituskyvystä, kun todellinen väliaine on käytössä.
Tässä kohtaa dynaamiset menetelmät alkavat merkitä enemmän. Kun työ siirtyy astian karakterisoinnista elävään viljelyyn, prosessin merkityksellisyys alkaa painaa enemmän kuin puhtaan järjestelmän hallinta.
3.2 Missä dynaamiset ja liuenneen hapen profiilimenetelmät lisäävät prosessin merkityksellisyyttä
Dynaamiset menetelmät ovat lähempänä todellisia prosessiolosuhteita, koska ne mittaavat hapensiirtoa aktiivisen viljelyn aikana. Tämä tarkoittaa, että ne tallentavat sekä hapentarpeen että liemen todelliset ominaisuudet. Skaalaustyössä, tämä tekee tuloksesta paljon hyödyllisemmän kuin puhtaan veden arvio.
Happitasapainomenetelmä lisää jatkuvan, ei-invasiivisen lukeman käyttöolosuhteissa, vaikka se riippuu tarkasta poiskaasuanalyysistä ja vakaasta toiminnasta [2].
Eroja on helpompi nähdä, kun menetelmät asetetaan vierekkäin.
3.3 Vertailutaulukko: menetelmä viljellyn lihan skaalaamiseen
| Menetelmä | Periaate | Tarvittavat tiedot | Pääoletukset | Vahvuudet | Rajoitukset | Paras käyttö |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Staattinen kaasunpoisto | DO:n nousu N₂-poiston jälkeen soluttomassa nesteessä | DO:n aikakulku, anturin vasteaika | Hyvin sekoitettu neste; ei OUR:tä | Yksinkertainen; toistettava; ei tarvita soluja | Ohittaa OUR:n; herkkä väliaineen koostumukselle ja anturin viiveelle | Alkuperäinen astian karakterisointi; laitteiston vertailu |
| Dynaaminen menetelmä | DO:n palautuminen aktiivisen viljelyn aikana lyhyen ilmastuksen pysäytyksen jälkeen | DO:n aikakulku, OUR-arvio | Lähes vakaa tila viljelyssä; anturin korjaus sovellettu | Heijastaa todellisia liemi- ja solutilanteita | Ilmastuksen tauko voi stressata viljelmää; herkkä anturin viiveelle | Prosessin optimointi ja skaalaus aktiivisen kasvun aikana |
| Happitasapaino (kaasufaasianalyysi) | O₂:n massatasapaino tulo- ja lähtökaasun välillä | Tarkat kaasun virtausnopeudet ja O₂-pitoisuudet | Vakaa toiminta | Ei-invasiivinen; jatkuva; ei viljelmän häiriötä | Vaatii erittäin tarkan poistokaasun analyysin | Suurimittakaavainen tuotannon seuranta |
| Sulfiittioksidaatio | Natriumsulfiitin kemiallinen hapetus kuluttaa O₂:tä | Sulfiitin kulutusnopeus | Reaktionopeus rajoittuu massansiirrolla | Hyödyllinen maksimaalisen OTR-kapasiteetin kannalta | Ei edusta biologista väliaineistoa; voi yliarvioida kLa:tä | Laitteiston vertailuarviointi vain; ei elävien kulttuurien työhön |
| Dynaaminen paine menetelmä (DPM) | Paineen muutos hapen liukoisuuden muuttamiseksi | Paineen ja DO:n aikataulu | Paine tasapainottuu nopeammin kuin kaasukoostumus | Välttää kaasuvaiheen viiveen; sopii suurille astioille | Vaatii paineenkestävän astian ja tarkan paineen hallinnan | Suurimittakaavainen karakterisointi |
Nämä menetelmävalinnat vaikuttavat siihen, miten kLa tiedot tulisi muuttaa skaalaustavoitteiksi ja laitteiden valinnaksi.
4. kLa-tietojen käyttö skaalaamisessa ja laitteiden valinnassa
4.1 Skaalaustavoitteiden asettaminen laboratoriosta pilottimittakaavaan
Kun olet mitannut kLa:n, seuraava tehtävä on muuttaa tämä luku käyttörajoiksi sekoitukselle, kaasun virtaukselle ja sekoittamiselle. kLa:tä tulisi käsitellä yhtenä rajoitteena , ei koko päätöksenä. Sen on oltava riittävän korkea hapentarpeen täyttämiseksi, mutta ei niin korkea, että prosessi ajautuu leikkausalueelle, jota solut eivät siedä.
Tasapaino on tärkeä viljellyssä lihassa. kLa:n pitäminen vakiona suuremmassa mittakaavassa voi johtaa korkeampiin juoksupyörän kärkinopeuksiin ja siten korkeampaan leikkausvoimaan [4]. Imettävien soluviljelmissä juoksupyörän kärkinopeuksia 0,1-0,5 m/s käytetään usein hapensiirron ja leikkausjännityksen tasapainottamiseen [5]. Joten käytännössä kLa sijoittuu laajempaan käyttöikkunaan, joka sisältää myös tehonsyötön tilavuusyksikköä kohti (P/V), pintakaasun nopeuden ja sekoitusajan [4][5].
Hyödyllinen vertailukohta auttaa tässä. 2-10 L laboratoriomittakaavan sekoitussäiliöreaktorissa kLa on usein 50-200 h⁻¹ alueella. 50-500 L pilottimittakaavan astiassa tyypillinen alue on 80-300 h⁻¹ [4] . Keskeinen askel on löytää päällekkäisyys, jonka kaikki astiat voivat saavuttaa. Tämä muuttaa skaalaustavoitteen paperilla olevasta ideasta käytännössä toteutettavaksi.
4.2 Antureiden ja laitteiston valinta luotettavaa kLa-työtä varten
Hyvät skaalaustiedot alkavat instrumenteista ja kaasulaitteistosta, jotka eivät vääristä tulosta.
Anturin vasteaika vaikuttaa suoraan kLa:n tarkkuuteen.Korkean kLa-järjestelmissä käytä nopeasti reagoivia DO-antureita. Hitaat polarografiset anturit tarvitsevat korjausta ja voivat aliarvioida kLa:n. Polarografisten antureiden vasteajat ovat yleensä 8-30 sekuntia, kun taas optiset fluoresenssipohjaiset anturit reagoivat 3-10 sekunnissa [4]. Hyvä sääntö on, että anturin vasteajan tulisi olla alle kymmenesosa massansiirtovakion ajasta (1/kLa) [1] . Jos et voi täyttää tätä ehtoa, optiset anturit ovat yleensä turvallisempi vaihtoehto.
Kaasun toimitus on yhtä tärkeää. Lämpömassavirtasäätimet auttavat pitämään kaasun virtauksen vakaana, mikä tekee mittauksista toistettavampia. Spargerin valinnalla on myös suora vaikutus saavutettavaan kLa-arvoon [2][3]. Pienemmät kuplat tarjoavat enemmän kaasu-neste rajapinta-alaa, mutta siinä on koukku: väliaineen lisäaineet voivat leikata kLa-arvoa jyrkästi [2] .
5. Keskeiset havainnot kLa-mittausten tulkintaan
Yhteenvetona, valitsemasi menetelmän tulisi vastata skaalauskysymykseen, johon yrität vastata. Käytännössä tämä tarkoittaa, että sinun on oltava selvä siitä, tarvitsetko laitteiston karakterisointia vai prosessiin liittyvää skaalaustietoa.
Vesissä 20°C:ssa mitattua kLa-arvoa ei voida suoraan siirtää viljelyväliaineeseen 37°C:ssa. Pelkkä lämpötilakorjaus luo noin 45% eron [4]. Ja kLa ei ole jotain, mitä voi ennustaa pelkällä teorialla. Jokainen bioreaktori tarvitsee oman mitatun kLa-arvonsa [1] .
Tämä on vielä tärkeämpää, kun siirrytään penkistä pilottimittakaavaan. Staattinen kaasunpoisto suolaa vastaavassa puskurissa, kuten PBS, antaa sinulle puhtaan laitteiston vertailuarvon. Mutta kun mittakaava kasvaa, dynaamiset mittaukset varsinaisessa viljelyalustassa kertovat enemmän siitä, mitä prosessi käytännössä tekee, koska väliaineen lisäaineet voivat muuttaa kLa:ta huomattavasti [4]. Jos luotat vesipohjaisiin arvoihin, voit päätyä määrittelemään hapensiirtokapasiteetin liian suureksi mittakaavassa.
Viimeinen tarkistus on, onko kLa koko käyttöikkunan sisällä. Kohtele kLa:ta yhtenä prosessirajoitteena, ei yksittäisenä tavoitteena. Käytä sitä yhdessä P/V ja leikkausrajojen kanssa valitessasi parasta bioreaktorijärjestelmää ja sekoitusstrategiaa [4].
UKK:t22638>
Mikä kLa-menetelmä minun pitäisi valita skaalausta varten?
Dynaaminen kaasunpoistomenetelmä on yleisimmin käytetty tapa määrittää kLa sekoitetuissa bioreaktoreissa, ja se on menetelmä, jota useimmat tiimit suosittelevat käytännössä. Se on melko nopea, eikä se vaadi vaarallisia kemikaaleja tai eläviä organismeja.
Viljellyn lihan skaalausta varten on parasta mitata ilman soluja, jotta solujen aineenvaihdunta ei vääristä tulosta. Käytä PBS-puskuria 37 °C:ssa prosessiväliaineen paremman vastaavuuden saavuttamiseksi. Ja jos liuenneen hapen anturilla on hidas vasteaika, sovella korjausta. Jos et tee niin, voit aliarvioida kLa:t23400>.
Miksi vesipohjaiset kLa-arvot ovat usein harhaanjohtavia?
Vesipohjaiset kLa-arvot voivat olla harhaanjohtavia, koska ne eivät heijasta todellisten soluviljelyväliaineiden fysikokemiallista käyttäytymistä.Todelliset kasvatusalustat eivät ole pelkästään vettä, johon on sekoitettu ravinteita. Suolapitoisuus, viskositeetti, pintajännitys ja vaahdonestoaine vaikuttavat kaikki hapen siirtymiseen tavoilla, joita vesitestit eivät paljasta.
Tämä ero on merkittävä. Jos jätät kasvatusalustan vaikutukset huomiotta, hapen toimitusarviosi voivat poiketa huomattavasti siitä, mitä bioreaktori todellisuudessa tekee. Hyvä esimerkki on vaahdonestoaine: se voi lisätä kuplien yhdistymistä, vähentää rajapinta-alaa ja alentaa kLa-arvoa jopa 50% . Viljellyn lihan tuotannossa tämä ei ole pieni yksityiskohta. Se voi muuttaa sen, onko prosessilla riittävästi hapensiirtokapasiteettia vai toimiiko se lähempänä rajaansa.
Miten anturin viive ja kasvatusalustan lisäaineet vaikuttavat kLa-arvoon?
Anturin viive voi vääristää kLa-mittauksia. Jos liuenneen hapen anturi reagoi liian hitaasti suhteessa hapensiirtonopeuteen, tulos voi olla virheellinen ja saattaa vaatia epälineaarista korjausta .
Kasvatusalustan lisäaineet voivat myös muuttaa hapensiirtoa merkittävillä tavoilla. Elektrolyytit ja suolat voivat estää kuplien yhdistymistä. Pluronic F68 saattaa pienentää kuplien kokoa. Vaahdonestoaineet lisäävät usein kuplien yhdistymistä, mikä pienentää tehokasta rajapinta-alaa ja laskee kLa.
