Jos muokkaat ensin ja tarkistat myöhemmin, voit korjata kohteesta poikkeavan muutoksen klooniin. Pitäisin työnkulun yksinkertaisena: valitse vähäriskisin muokkausmenetelmä, pidä editorin altistus lyhyenä ja testaa sitten sekä ennustetut kohteesta poikkeavat paikat että kloonin vakaus ennen julkaisua.
Bioprosessi-insinööreille, soluviljelytieteilijöille ja viljellyn lihan T&K-tiimeille pääasia on yksinkertainen. CRISPR-järjestelmät voivat silti leikata lähes vastaavissa paikoissa, usein 3–6 virhettä sallitaan, ja nämä virheet voivat siirtyä laajennettuihin yksisoluklooneihin. Artikkeli jakaa riskinhallinnan kolmeen vaiheeseen: ennen muokkausta, muokkauksen aikana, ja muokkauksen jälkeen.
Tässä on koko tarkistuslista yksinkertaisessa muodossa:
-
Valitse tehtävään pienimmän riskin muokkaustyökalu
- Käytä base editing tai prime editing, kun ne voivat tehdä muokkauksen ilman kaksoisjuosteen katkeamista
- Käytä dCas9-pohjaista modulointia, jos tarvitset vain geenisäätelyä
- Jos tarvitset nukleaasia, aloita korkean tarkkuuden Cas9 -variantilla
-
Lukitse lähtömateriaali
- Vahvista solulinjan identiteetti
- Tarkista mykoplasma
- Tallenna passagenumero
- Sekvensoi todellinen kohdelokus työlinjassa, ei pelkästään referenssigenomissa
-
Seulo oppaat ennen märkätöitä
- Käytä kohdistukseen perustuvia ja pisteytykseen perustuvia off-target-työkaluja yhdessä
- Suosi opasta, jolla on puhtaampi off-target-profiili, verrattuna sellaiseen, jolla on vain korkeampi on-target-aktiivisuus
- Kiinnitä huomiota oppaan pituuteen, 40–60% GC-pitoisuuteen , ja homopolymeerijuoksuihin
-
Rajoita altistumista solun sisällä
- Käytä RNP:tä tai mRNA:tä toimitukseen mieluummin kuin plasmidi- tai virussysteemejä, jos mahdollista
- Käytä minimitehokasta annosta
- Vältä editorin pysyvyyden pidentämistä vain transfektiotulosten pakottamiseksi
-
Lisää ylimääräisiä kontrolloita korkeamman riskin tapauksissa
- Harkitse parinickaasien käyttöä
- Käytä indusoitavia, split-Cas9, tai valokontrolloituja järjestelmiä, kun ajoitus on tärkeää
- Lisää anti-CRISPR-proteiinit sulkemisvaiheeksi tarvittaessa
-
Varmista oikea validointi muokkauksen jälkeen
- Vahvista ensin kohdennettu muokkaus
- Tarkista jokainen ennustettu off-target-sivusto kohdennetulla amplicon NGS:llä
- Siirry GUIDE-seq, CIRCLE-seq, CAST-seq, UDiTaS, tai WGS, kun projektin riski on suurempi
- Lisää base tai prime-editoreille , RNA-tason tarkistukset tarvittaessa
-
Älä vapauta yksittäistä kloonia pelkän sekvenssin perusteella
- Vertaa 2–3 itsenäistä kloonia
- Käytä muokkaamatonta vanhempaa kontrollia
- Poista kloonit, joilla on epävakautta tai fenotyyppistä muutosta
- Julkaise vain, kun muokkaustila, kohteen ulkopuolinen näyttö ja tietueet ovat kaikki valmiit
Lyhyt tapa ajatella asiaa: suunnittele välttääksesi kohteen ulkopuoliset leikkaukset, toimita rajoittaaksesi solussaoloaikaa, ja validoi projektin riskin edellyttämällä syvyydellä. Se on se lanka, joka kulkee koko kappaleen läpi.
CRISPR:n kohteen ulkopuolisen riskin hallinta: 3-vaiheinen tarkistuslista solulinjan muokkaukseen
Ennen muokkausta -tarkistuslista: vähennä riskiä ennen muokkauksen aloittamista
Määritä muokkaustavoite ja valitse vähäriskisin muokkausmenetelmä
Ennen kuin tilaat yhtäkään reagenssia, selvitä tarkasti, mitä muokkauksella on tarkoitus saavuttaa. Knockout, knock-in, yksittäisen nukleotidin muutos ja transkriptionaalinen modulointi eivät kanna samaa kohteen ulkopuolista riskiä. Ne eivät myöskään vaadi samaa työkalua.
Yleinen riskijärjestys on yksinkertainen. DSB:tä muodostavat nukleaasit, kuten Cas9 ja Cas12, ovat riskin yläpäässä, koska ne voivat aiheuttaa suuria deleetioita, translokaatioita ja DNA-vauriovasteita [1] [7]. Base-editorit ja prime-editorit käyttävät nickaseja, joten ne välttävät DSB:t ja vähentävät rakenteellisen vaihtelun riskiä [1][5]. Transkriptionaaliseen modulointiin epigeneettiset editorit, kuten dCas9 yhdistettynä transkriptiomodifikaattoreihin, jättävät DNA-sekvenssin muuttumattomaksi [1].
Käytännön sääntö on yksinkertainen: käytä vähiten genotoksista menetelmää, joka voi silti toimittaa tarvitsemasi muokkauksen. Yksittäisten nukleotidien muutoksiin CBEs tai ABEs sopivat paremmin kuin HDR, joka voi silti aiheuttaa indelsejä [3] [1]. Korvauksissa ja pienissä inserteissä tai deleetioissa prime-editointi osoittaa usein pienempää off-target-aktiivisuutta kuin standardi CRISPR-Cas9 [1]. Jos sinun täytyy käyttää nukleaasia, valitse korkean tarkkuuden variantti, kuten SpCas9-HiFi, eSpCas9, tai SpCas9-HF1 [1] [6].
Kun muokkausmenetelmä on määritetty, lukitse työsolulinja ja tarkka kohdesekvenssi.
Vahvista solulinjan identiteetti, historia ja kohdelokuksen sekvenssi
Jos solulinja on väärin tunnistettu tai ristiinsaastunut, muu työnkulku alkaa horjua. Jopa hyvin suunniteltu opas-RNA ei pelasta huonoa lähtömateriaalia. Tarkista solulinjan identiteetti ennen kuin muokkaus alkaa. Samalla varmista mykoplasman tila ja kirjaa nykyinen passagenumero, sillä korkean passagen solut voivat muuttaa genomista vakautta ja muokkaustehokkuutta [1][6].
Yhtä tärkeää on, ettei tukeuduta pelkästään referenssigenomiin.Järjestä tarkka kohdelokus työsolulinjassa. Tämä vaihe auttaa sinua havaitsemaan SNP:t tai indelit, jotka voivat estää oppaan sitoutumisen tai luoda uusia off-target -paikkoja [1] [6].
Tämän jälkeen siirry oppaan suunnitteluun.
Suorita in silico off-target -seulonta ennen reagenssien valintaa
Kun kohdelokus on vahvistettu, seulotaan ehdokasopas-RNA:t in silico ennen kuin sitoudut märkätyöskentelyyn. Käytä sekä kohdistukseen perustuvia työkaluja, kuten Cas-OFFinder tai FlashFry, ja pisteytykseen perustuvia työkaluja, kuten CFD-pisteytys tai DeepCRISPR. Ensimmäinen ryhmä auttaa löytämään genomisia paikkoja, joilla on sekvenssihomologia. Toinen auttaa sijoittamaan nämä paikat ennustetun katkaisuprobabiliteetin mukaan [1][5].
Kun oppaita valitaan, puhtaampi off-target-profiili pitäisi voittaa raaka on-target-tehokkuus. Opas, jolla on 70% on-target-tehokkuus ja ei ennustettuja off-targeteja, on turvallisempi lähtökohta kuin sellainen, jolla on 90% tehokkuus ja useita korkean riskin kohteita [6] . Joissakin tilanteissa oppaan pituuden lyhentäminen 20 bp:stä 17-18 bp:hen voi vähentää off-target-tapahtumia jopa 500-kertaisesti ilman merkittävää on-target-tarkkuuden menetystä [5]. Tavoittele GC-pitoisuutta välillä 40% ja 60%, ja vältä neljän tai useamman identtisen emäksen jaksoja [6] [5].
Sanottakoon kuitenkin, että in silico -seulonnalla on rajoituksia. Se ei ota hyvin huomioon kromatiinitilaa, solusyklin vaihetta tai solukohtaista kontekstia [1][6][4]. Ajattele sitä suodattimena, ei todisteena.Se kaventaa kenttää, mutta ei korvaa kokeellista vahvistusta.
Tuo korkeimman riskin ennustetut kohteet esiin muokkaus- ja validointisuunnitelmaan.
sbb-itb-ffee270
Muokkauslista: hallitse editorin valinta, toimitus ja altistus
Käytä korkean spesifisyyden editoreita ja hyvin sijoitettuja opas-RNA:ita
Aloita ennustetusta off-target lyhytlistasta ja käytä sitä editorin valintaan. Useimmissa tapauksissa korkean uskollisuuden SpCas9-variantti - SpCas9-HiFi, eSpCas9 tai SpCas9-HF1 - on parempi oletus kuin villityypin SpCas9 [6] [1]. Villityypin SpCas9 voi sietää jopa kolme-viisi emäsparin epäsopivuutta, erityisesti PAM-etäisessä alueessa, ja se luo merkittävän off-target riskin herkissä solulinjoissa [3].
Yksinkertainen sääntö auttaa tässä: käytä vähiten aktiivista korkealaatuista editoria, joka silti toteuttaa halutun muokkauksen.
Peruseditoreille seuraa sivuvaikutusmuokkauksia ja RNA:n kohteen ulkopuolisia vaikutuksia erikseen DNA:n kohteen ulkopuolisesta riskistä [1] [8]. Nämä ovat erilaisia vikatiloja, ja ne tarvitsevat erilliset tarkistukset. Jos voit tehdä muokkauksen ilman kaksoisjuosteen katkeamista, perusmuokkaus tai ensisijainen muokkaus saattaa sopia paremmin korkeamman riskin työnkulkuihin [1][8].
Kun editori on valittu, seuraava tehtävä on pitää sen aika solussa mahdollisimman lyhyenä.
Rajoita editorin pysyvyyttä tilapäisellä toimituksella ja vähimmäistehokkaalla annoksella
Editorin pysyvyys on yhtä tärkeää kuin editorin valinta.Mitä pidempään editointilaite pysyy aktiivisena solussa, sitä enemmän aikaa sillä on toimia matalan todennäköisyyden kohteissa. Tämä tekee toimitusmuodosta merkittävän hallintapisteen.
Käytä ohimenevää toimitusta kuten RNP:tä tai mRNA:ta , ja vältä plasmidi-DNA:ta tai viruksia, jotka pidentävät editointilaitteen ilmentymistä [1] [5]. Käytännössä RNP-toimituksen tulisi olla oletus [6].
Annostuksella on myös merkitystä. Korkea nukleaasi-pitoisuus lisää leikkauksen todennäköisyyttä matalan herkkyyden kohteissa [5]. Käytä minimi tehokasta annosta. Jos transfektiotehokkuus on huono, älä vain lisää reagenssia ja toivo parasta. Tämä usein siirtää ongelmaa sen sijaan, että korjaisi sen.
Lisää tarkkuuden turvatoimia korkeamman riskin työnkuluille
Jotkut työnkulut tarvitsevat lisäsuojauksia. Tämä pätee erityisesti kohteisiin lähellä onkogeenejä, kasvaimen suppressoreita, tai p53-herkissä solulinjoissa, missä yksi kohteen ulkopuolinen tapahtuma voi aiheuttaa suhteettoman suuria kustannuksia [1][6][3].
Hyödyllisiä turvatoimia ovat:
- Paritetut nikkaasit, jotka vaativat kaksi lähekkäistä leikkausta. Yksi kohteen ulkopuolinen nikkaus korjataan yleensä ilman mutaatiota, joten kohteen ulkopuolinen riski vähenee huomattavasti verrattuna tavanomaiseen nukleaasi-asetukseen [4][1].
- Indusoituvat, valolla ohjatut tai jaetut Cas9-järjestelmät, jotka auttavat pitämään editorin toiminnan tiukasti rajatussa ikkunassa, kun toimitus on tehokasta ja altistuksen on pysyttävä lyhyenä [1].
- Anti-CRISPR (Acr) -proteiinit, jotka toimivat sammutuskytkimenä. Nämä luonnollisesti esiintyvät Acr-proteiinit voivat deaktivoida CRISPR-Cas-kompleksin määritellyn ajan kuluttua, antaen sinulle molekyylijarrun editorin toiminnalle [1].
Muokkaamisen jälkeinen tarkistuslista: havaitse kohteen ulkopuoliset tapahtumat ja validoi kloonit
Seulo ennustetut kohteen ulkopuoliset paikat kohdennetulla sekvensoinnilla
Kun muokkaus on valmis, vahvista ensin haluttu muutos kohdekohdassa. Nopeaa ensimmäistä tarkastusta varten yhdistetyissä soluissa voit käyttää epäsuhtaisuus-halkaisu analyysiä, kuten T7 Endonuclease I, rajoitusleikkausta tai reunustavaa PCR:ää.Ole vain varovainen tulkinnan kanssa: jokaisella näistä menetelmistä on herkkyysrajoja, erityisesti harvinaisille muokkauksille tai homotsygoottisille varianteille [9].
Klooni-tason validointiin kohdennettu amplicon NGS on standardi. Se antaa kvantitatiivisen näkymän alleelifrekvenssistä ja voi havaita variantit jopa 0.01% - 0.1% [3] .
Jokainen ennustettu off-target -kohta sekvensoidaan kohdennetulla amplicon NGS:llä. Sen pitäisi olla oletusvalidointivaihe.
Siirry genominlaajuisiin tai rakenteellisiin kokeisiin, kun projektin riski on suurempi
Paikkakohtainen seulonta ei aina riitä. Jos editoija, kohdelokus tai solulinja viittaa piilevään riskiin, siirry kokeisiin, jotka voivat havaita tapahtumia, joita et ennustanut etukäteen.
Genominlaajuiset löytökokeet kuten GUIDE-seq ja CIRCLE-seq eivät tarvitse etukäteen laadittuja off-target -kohtalistoja.GUIDE-seq voi havaita kohteesta poikkeavia paikkoja, joiden indel-taajuudet ovat niinkin alhaisia kuin 0.03% [2] . CIRCLE-seq voi tunnistaa jopa 94% kohteesta poikkeavaa paikkaa in vitro [3] . Nämä menetelmät ovat hyödyllisiä, kun solutyyppikonteksti voi peittää kohteesta poikkeavan toiminnan.
Jos olet huolissasi suurista uudelleenjärjestelyistä, tavalliset amplicon-lukemat saattavat ohittaa pääongelman. Deleetioiden, inversioiden ja translokaatioiden havaitsemiseen tarvitaan rakenteellisiin muutoksiin suunniteltuja testejä, kuten CAST-seq ja UDiTaS [1] .
Koko genomin sekvensointi (WGS) on laajin vaihtoehto. Se voi havaita indelit, rakenteelliset vaihtelut ja kopioluvun muutokset koko genomissa [1]. Kompromissi on syvyys ja kustannukset: se tarvitsee yleensä 20–60× kattavuuden, mikä tekee siitä huonon valinnan rutiiniseulontaan suurille populaatioille [1].
Käytä kohdennettua amplicon NGS:tä ennustetuille kohteille. Siirry koko genomin tai rakenteellisiin kokeisiin korkeamman riskin projekteissa. Perus- tai päätoimittajille lisää RNA-seq tarkistaaksesi RNA-tason off-target-vaikutukset.
Valitse useita itsenäisiä klooneja ja dokumentoi vapautuskriteerit
Sekvenssitarkistusten jälkeen testaa fenotyyppiä useammassa kuin yhdessä kloonissa.
Älä etene vain yhdellä muokatulla kloonilla. Eristä ja laajenna vähintään kaksi tai kolme itsenäistä kloonipopulaatiota ja vertaa niitä muokkaamattomaan vanhempaan kontrolliin [4][9] . Poista kloonit, jotka osoittavat epävakautta tai fenotyypin muutosta [3]. Vahvista sitten suunniteltu muokkaus vaaditussa alleelitilassa, olipa se heterotsygoottinen tai homotsygoottinen, käyttämällä kohdennettua amplicon NGS [9].
Dokumentointi ei ole hallinnollista työtä lopussa. Se on osa kloonin julkaisua. Tallenna vanhempilinjatausta, sgRNA-suunnittelu, nukleaasi-variantti, toimitusmenetelmä ja kaikki QC-tulokset [3]. Klooni voi edetä vain, kun suunniteltu muokkaus on vahvistettu, ennustetut off-target-kohteet ovat selkeät ja koko tallenne on paikallaan.
Genomin muokkaus CRISPR: Kuinka tehokkaasti minimoida off-target-vaikutukset
Päätelmä: kolmen vaiheen tarkistuslista puhtaampiin solulinjan muokkauksiin
Yhteenvetona tarkistuslista käsittelee off-target-kontrollia vaiheittaisena prosessina, ei kertaluonteisena QC-tarkastuksena. Tavoite on yksinkertainen: vähentää riskiä varhain, rajoittaa editorin toimintaa ja sitten varmistaa lopputulos.
Validointisyvyyden tulisi vastata riskiä. Julkaise vain useita itsenäisiä klooneja, jotka on vahvistettu tarkoitetussa alleelitilassa.
Usein kysytyt kysymykset
Miksi ei luoteta yhteen klooniin?
Luottaminen yhteen klooniin on riskialtista. CRISPR-muokkaus ei ole täysin spesifinen, joten se voi aiheuttaa tahattomia kohteen ulkopuolisia mutaatioita.
Siksi tiimit yleensä laajentavat useita kloonipopulaatioita. Tämä helpottaa linjan löytämistä, joka sisältää tarkoitetun kohteen muokkauksen ilman haitallisia kohteen ulkopuolisia muutoksia.
On myös toinen syy: solulinjat voivat osoittaa geneettistä heterogeenisyyttä. Useiden kloonien sekvensointi auttaa varmistamaan, että tarkoitettu homotsygoottinen knockout tai muu kohdealueen muutos on läsnä kohdealueilla.
Milloin amplicon NGS riittää?
Ampliconiin perustuva seuraavan sukupolven sekvensointi on usein riittävä, kun tarvitset kohdennetun ja kustannustehokkaan tavan vahvistaa laskennallisten työkalujen tai muiden seulontamenetelmien esiin nostamat mahdolliset kohteet.
Koko genomin sekvensointi on edelleen ainoa tapa täysin kvantifioida kohteiden ulkopuoliset vaikutukset. Mutta monissa sovelluksissa tuon tason analyysi ei ole tarpeen.
Kuinka valitsen turvallisimman editorin?
Valitse vähiten aktiivinen CRISPR-nukleaasi-variantti, joka silti leikkaa kohdealueesi hyvin.
Et voi valita parasta varianttia pelkästään ennusteen perusteella. Ainoa luotettava tapa on suorittaa pieni seulonta valittujen nukleaasi-varianttien kesken ja lukea editointi seuraavan sukupolven sekvensoinnilla.
Viljellyn lihan R&D:lle tämä antaa käytännöllisen etenemistavan: aloita lyhyellä listalla variantteja, testaa sitten heikompia vaiheittain, kunnes löydät vähiten aktiivisen vaihtoehdon, joka silti muokkaa kohdesivustoa tehokkaasti.
