Criopreservação é o processo de congelamento e armazenamento de células vivas em temperaturas ultra-baixas para manter sua viabilidade ao longo do tempo. Este método é crítico para a produção de carne cultivada, garantindo linhas celulares consistentes e estáveis e protegendo contra perdas por contaminação ou falha de equipamento. As etapas principais incluem:
- Preparação: Colher células durante sua fase de crescimento, verificar a viabilidade (objetivo de ≥90%) e prepará-las em meio de congelamento com crioprotetores como DMSO ou glicerol.
- Congelamento: Usar uma taxa de resfriamento controlada (-1°C a -3°C por minuto) para evitar danos por cristais de gelo. Armazenar células em vapor de nitrogênio líquido (-135°C a -190°C) para preservação a longo prazo.
- Descongelamento: Descongelar rapidamente as células em um banho-maria a 37°C para minimizar a toxicidade do crioprotetor, em seguida, transferi-las para o meio de crescimento para recuperação.
- Controle de Qualidade: Rotule os frascos com precisão, monitore as condições de armazenamento e teste a viabilidade após o descongelamento para garantir a preservação bem-sucedida.
Protocolo Completo de Criopreservação para Linhagens Celulares: Processo de 4 Etapas, da Preparação ao Armazenamento
Preparando Células para Criopreservação
Colheita de Células e Verificação de Viabilidade
Para garantir a melhor recuperação após o descongelamento, colha as células durante sua fase de crescimento logarítmico (log). Para linhagens celulares aderentes, isso geralmente ocorre quando atingem 80–90% de confluência [2][3][6].
Verifique a viabilidade das células usando o método de exclusão de Azul de Trypan. Misture partes iguais (1:1) de Azul de Trypan a 0,4% com a suspensão celular e, em seguida, conte as células usando um hemocitômetro.Células viáveis excluirão o corante e aparecerão brilhantes sob o microscópio, enquanto células não viáveis ficarão azuis [4]. Idealmente, busque uma viabilidade de pelo menos 90% para as melhores taxas de recuperação, embora alguns protocolos possam aceitar um mínimo de 75% [1][2][3][5].
Antes da colheita, use um microscópio para verificar a contaminação bacteriana ou fúngica. Células de suspensão saudáveis devem aparecer brilhantes, redondas e refráteis sob um microscópio de contraste de fase invertida [2][3].
Uma vez que as células atendam aos padrões de viabilidade exigidos, prossiga para as etapas de pré-congelamento.
Preparações Pré-Congelamento
Para células aderentes, use métodos de dissociação suaves, como tripsina ou TrypLE Express, e limite o tempo de incubação para evitar danos às membranas celulares [5]. Prepare as células em uma concentração de 1 × 10⁶ a 1 × 10⁷ células/mL, dependendo da linha celular [1][6]. Ao alocar, certifique-se de que a suspensão celular seja misturada frequentemente para manter a distribuição uniforme nos criotubos [5].
Mantenha o meio de congelamento resfriado entre 2°C e 8°C durante a ressuspensão para reduzir a toxicidade do crioprotetor antes que o processo de congelamento comece [5]. Uma vez que as células estejam suspensas no meio de congelamento, prossiga rapidamente para o protocolo de congelamento [1].Sempre criopreserve células no menor número de passagens possível para reduzir o risco de deriva genética ou mudanças morfológicas [5][7].
Selecionando Crioprotetores e Meios de Congelamento
Opções de Crioprotetores e Suas Funções
Dimetilsulfóxido (DMSO) é amplamente utilizado como crioprotetor, tipicamente em uma concentração de 10% [2]. Ele funciona penetrando nas membranas celulares e reduzindo a formação de gelo durante o congelamento. No entanto, o DMSO pode ser tóxico para as células à temperatura ambiente, portanto, o descongelamento rápido é essencial para minimizar a exposição e diluí-lo rapidamente [1].
Glicerol serve como uma alternativa útil para linhagens celulares sensíveis ao DMSO, geralmente usado em concentrações que variam de 5% a 15% [8].É particularmente eficaz para tipos de células onde o DMSO pode causar diferenciação indesejada [3], e tende a ter menor toxicidade em comparação com o DMSO.
Em aplicações de carne cultivada, protocolos tradicionais de congelamento frequentemente usam uma mistura de 90% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 10% de DMSO [1]. No entanto, a dependência de componentes derivados de animais limita esses métodos em termos de escalabilidade e aprovação regulatória [9]. Para resolver essas questões, meios quimicamente definidos - como Synth-a-Freeze ou Recovery Cell Culture Medium - fornecem uma alternativa livre de componentes animais. Esses meios mantêm alta viabilidade celular pós-descongelamento enquanto superam os desafios associados aos componentes de origem animal [9].
Comparação de Meios de Congelamento
Aqui está uma análise das vantagens e limitações de vários meios de congelamento usados na produção de carne cultivada:
| Médio | Prós | Contras | Adequação para Carne Cultivada |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO em FBS-DMEM | Protocolos estabelecidos [1] | Contém componentes de origem animal; variabilidade de lote [9] | Escalabilidade limitada |
| Synth-a-Freeze | Quimicamente definido; qualidade consistente; livre de componentes animais [9] | Custo inicial mais alto [9] | Sim |
| Meio de Cultura de Células de Recuperação | Fácil de usar; projetado para recuperação rápida [9] | Pode precisar de otimização para linhas celulares específicas | Sim |
| 10% de Glicerol em FBS | Alternativa para células sensíveis ao DMSO [1] | Depende de soro de origem animal [9] | Escalabilidade limitada |
Em fevereiro de 2023, pesquisadores da Tokyo Women's Medical University, liderados por Hironobu Takahashi, demonstraram a importância de escolher o meio de congelamento correto. Usando opções comerciais como CELLBANKER 1 e 2, eles criopreservaram com sucesso células miogênicas bovinas primárias a –80°C por até um ano. Notavelmente, essas células mantiveram sua capacidade de proliferar e se diferenciar em tecido muscular contrátil com estruturas de sarcômero intactas após o descongelamento [10] .
Para a produção de carne cultivada, meios quimicamente definidos e compatíveis com GMP são cada vez mais preferidos. Como STEMCELL Technologies destaca:
Em campos altamente regulamentados, como terapia celular e gênica, é recomendado usar um meio de criopreservação fabricado em conformidade com GMP e totalmente definido para garantir que os produtos sejam consistentemente produzidos e controlados de acordo com os padrões de qualidade [9].
Plataformas como
Procedimento de Criopreservação e Taxas de Resfriamento
Protocolo de Congelamento Passo a Passo
A chave para uma criopreservação bem-sucedida está em manter uma taxa de resfriamento constante de -1°C a -3°C por minuto[2]. Este processo gradual permite que a água saia das células lentamente, evitando a formação de cristais de gelo intracelulares prejudiciais que poderiam romper as membranas celulares[1].
Comece centrifugando as células a 150 x g por 5 minutos[3]. Uma vez centrifugadas, ressuspenda o pellet de células em um meio de congelamento frio contendo 10% de DMSO em uma concentração de 2–4×10⁶ células/mL [3].Para reduzir a exposição ao DMSO, avance rapidamente para a próxima etapa - congelamento.
Distribua a suspensão celular em frascos criogênicos pré-rotulados. Cada frasco deve indicar claramente detalhes essenciais, como o nome da linha celular, número de passagem, número do lote, concentração celular e a data de congelamento[3]. Com os frascos preparados, é hora de selecionar e utilizar o equipamento de resfriamento apropriado.
Equipamento e Técnicas de Resfriamento
Coloque os frascos imediatamente em um dispositivo de resfriamento de taxa controlada. Recipientes de congelamento passivo, como o Nalgene "Mr Frosty" (que usa isopropanol) ou o Corning "CoolCell", são escolhas populares. Essas ferramentas podem alcançar uma taxa de resfriamento de aproximadamente 1°C por minuto quando colocadas em um freezer a -80°C[2] .
Para operações em larga escala onde a consistência é crítica, um freezer programável com controle de taxa é a melhor opção. Conforme declarado por Sigma-Aldrich:
ECACC utiliza rotineiramente um freezer programável com controle de taxa. Esta é a maneira mais confiável e reprodutível de congelar células[3].
Após cerca de 24 horas a -80°C, transfira os frascos para a fase de vapor de nitrogênio líquido, onde as temperaturas variam entre -135°C e -190°C, para armazenamento a longo prazo [4]. Evite armazenar células a -80°C por mais de uma semana, pois isso pode comprometer sua viabilidade. Temperaturas abaixo de -135°C são essenciais para preservação indefinida[2]. Usar a fase de vapor em vez da fase líquida reduz o risco de contaminação cruzada enquanto mantém temperaturas suficientemente baixas.
Protocolos de Descongelamento e Recuperação
Processo de Descongelamento
Descongelar células rapidamente é crucial para limitar a exposição a crioprotetores tóxicos e evitar que cristais de gelo causem danos. Certifique-se de usar um visor facial completo e luvas isolantes para segurança. Comece removendo o criotubo do nitrogênio líquido e afrouxando ligeiramente a tampa para liberar qualquer pressão acumulada. Em seguida, aperte novamente a tampa.
Coloque o frasco em um banho-maria a 37°C, garantindo que a tampa fique acima da linha d'água. Deixe descongelar por 1–2 minutos, ou até que restem apenas alguns cristais de gelo. Uma vez descongelado, limpe o exterior do frasco com álcool 70% para manter a esterilidade.
Transfira o conteúdo do frasco para um tubo contendo 5–10 mL de meio de crescimento pré-aquecido. Adicione o meio lentamente para ajudar a reduzir o choque osmótico. Se você estiver trabalhando com linhas de células em suspensão, centrifugue a suspensão celular imediatamente a 300 × g por 5 minutos a 4°C.Este passo ajuda a pelotar as células e remove o crioprotetor. Após a centrifugação, ressuspenda as células em meio fresco. Para células aderentes, a centrifugação geralmente é desnecessária. Em vez disso, semeie diretamente as células em um recipiente de cultura adequado e remova qualquer DMSO residual durante a primeira troca de meio, normalmente após 24 horas.
Avaliações Pós-Descongelamento
Logo após o descongelamento, verifique a viabilidade celular para garantir que a recuperação foi bem-sucedida. Use o método de exclusão de Azul de Trypan para esta avaliação. Idealmente, a viabilidade celular deve exceder 90% [11], mas um mínimo de 75% é aceitável. Após 24 horas, inspecione as células em um microscópio de contraste de fase para confirmar a adesão, avaliar a densidade celular e verificar qualquer sinal de contaminação.
Continue monitorando as células através das passagens 1–3 para garantir a proliferação normal e que elas mantenham suas características esperadas.Para linhagens celulares que se recuperam mais lentamente, você pode melhorar a sobrevivência aumentando a concentração inicial de soro fetal bovino para cerca de 20% v/v.
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Armazenamento e Viabilidade a Longo Prazo
Condições e Duração de Armazenamento
Para manter a viabilidade das linhagens celulares a longo prazo, é essencial armazená-las em temperaturas abaixo de -135°C [7][2]. Isso garante que elas permaneçam preservadas indefinidamente.
O método preferido para armazenar linhagens celulares de carne cultivada é o nitrogênio líquido em fase vapor. Esta técnica mantém temperaturas entre -135°C e -190°C, tornando-a ideal para preservação a longo prazo, oferecendo maior segurança em comparação com o armazenamento em fase líquida.
Se você precisar armazenar células a -80°C, limite isso a um período de 24 horas a uma semana. Além disso, a viabilidade celular pode diminuir.Para armazenamento temporário a esta temperatura, transfira as células para armazenamento em nitrogênio líquido o mais rápido possível.
Use frascos criogênicos estéreis padrão (1–2 mL) com rosca interna e um anel de vedação para armazenamento seguro [4][5]. Sempre coloque os criotubos selados na fase gasosa em vez da fase líquida do nitrogênio para reduzir o risco de explosões dos frascos durante o descongelamento [5]. Além disso, certifique-se de que os recipientes de nitrogênio líquido a granel estejam pelo menos meio cheios para manter uma margem de segurança.
Finalmente, medidas rigorosas de controle de qualidade são críticas para garantir a viabilidade a longo prazo das células.
Verificações de Controle de Qualidade
Para garantir a confiabilidade das linhas celulares armazenadas, siga protocolos rigorosos de controle de qualidade. Comece rotulando com precisão cada frasco com etiquetas resistentes ao nitrogênio líquido.Inclua detalhes essenciais, como a identidade da linha celular, número do lote, número de passagem e data de congelamento. Mantenha um banco de dados eletrônico para registrar a localização exata de cada frasco, o que reduz o tempo que os recipientes de armazenamento precisam permanecer abertos [7][2].
Antes de comprometer lotes inteiros para armazenamento a longo prazo, teste a viabilidade de um frasco após armazenamento em fase gasosa de curto prazo. Esta etapa ajuda a confirmar que o processo de congelamento foi bem-sucedido e identifica quaisquer problemas potenciais [4][7][2]. Para estoques de células de alto valor, é prudente armazenar duplicatas em um local secundário para proteger contra falhas de equipamentos ou desastres locais [7][2].
Equipe todos os recipientes de armazenamento com sistemas de monitoramento de temperatura e alarmes para detectar baixos níveis de nitrogênio líquido [7]. Além disso, instale alarmes de oxigênio nas áreas de armazenamento, configurados para disparar a 18% de oxigênio (v/v), para minimizar os riscos de asfixia para o pessoal que trabalha com nitrogênio líquido [7][2].
Protocolo em vídeo de criopreservação de linhagens celulares de mamíferos
Conclusão e Principais Conclusões
Aqui está um resumo rápido dos passos essenciais e recomendações para uma criopreservação eficaz na produção de carne cultivada:
- Colheita de Células: Coletar células durante sua fase de crescimento logarítmico, garantindo que a viabilidade exceda 90%. Use 10% de DMSO como crioprotetor, embora o glicerol possa ser uma alternativa para linhagens celulares mais delicadas [11][1].
- Resfriamento e Armazenamento: Mantenha uma taxa de resfriamento controlada e transfira rapidamente os frascos para armazenamento em nitrogênio líquido em fase vapor para proteger a integridade celular [11]
Um estudo de Roka Kakehi et al. destaca a importância da precisão na criopreservação [10]:
"Garantir uma fonte confiável e consistente de células usando criopreservação nos permitirá aumentar o fornecimento estável de células promissoras para a produção de carne cultivada." - Roka Kakehi et al., Tokyo Women's Medical University
- Processo de Descongelamento: Descongele as células em um banho-maria a 37°C por cerca de dois minutos, parando quando 80% do gelo tiver derretido. Isso reduz a toxicidade do DMSO e melhora a recuperação celular [1]. Realize verificações de viabilidade pós-descongelamento para garantir o sucesso e ajustar procedimentos futuros.
Esses métodos funcionam em conjunto com práticas rigorosas de controle de qualidade. Sempre rotule os frascos com precisão, mantenha registros organizados e implemente verificações minuciosas antes do armazenamento a longo prazo [11]. Para necessidades especializadas de criopreservação, plataformas como
Perguntas Frequentes
Quais são as vantagens de usar meios quimicamente definidos para criopreservar linhas celulares na produção de carne cultivada?
Os meios quimicamente definidos trazem múltiplos benefícios quando se trata de criopreservar linhas celulares para a produção de carne cultivada. Ao remover componentes indefinidos, como soro derivado de animais, eles garantem resultados consistentes e previsíveis - um fator crucial para manter a confiabilidade a longo prazo das linhas celulares.
Outra vantagem importante é o risco reduzido de contaminação e variabilidade. Isso não apenas apoia padrões mais altos de qualidade e segurança, mas também se alinha perfeitamente com a precisão e escalabilidade necessárias para atender tanto às exigências regulatórias quanto às expectativas dos consumidores na indústria de carne cultivada.
Como a escolha do crioprotetor influencia a sobrevivência celular durante o congelamento e descongelamento?
A escolha do crioprotetor é um fator chave na preservação da saúde celular durante o congelamento e descongelamento. Duas opções amplamente utilizadas são dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol, cada um com características distintas. O DMSO é conhecido por sua capacidade de penetrar rapidamente nas células e fornecer forte proteção. No entanto, vem com uma ressalva: em altas concentrações ou com exposição prolongada, pode se tornar tóxico, potencialmente reduzindo a viabilidade celular.
O glicerol, em contraste, é menos tóxico e pode ser aplicado diretamente.Sua desvantagem está em sua taxa mais lenta de penetração celular, o que pode resultar em menos proteção imediata em comparação com o DMSO.
Alcançar o equilíbrio certo é crucial. Ajustar adequadamente a concentração e o tempo de exposição do crioprotetor ajuda a proteger as células enquanto minimiza o risco de toxicidade. Além disso, aderir às melhores práticas para taxas de resfriamento e condições de armazenamento é essencial para garantir as maiores taxas de recuperação possíveis após o descongelamento.
Por que é importante controlar a taxa de resfriamento durante a criopreservação?
Manter uma taxa de resfriamento constante, geralmente entre –1°C e –3°C por minuto, é fundamental para manter as células viáveis. Resfriar gradualmente permite que as células desidratem em um ritmo controlado, reduzindo a chance de formação de cristais de gelo prejudiciais, que podem rasgar ou danificar as membranas celulares.
Essa abordagem medida protege a estrutura das células, aumentando sua sobrevivência e funcionalidade após o descongelamento.Seguir protocolos de resfriamento precisos é essencial para garantir o armazenamento e recuperação bem-sucedidos de linhagens celulares a longo prazo.
